TENDENCIAS EN TENDENCIAS EN
CITOMETRÍA DE FLUJOCITOMETRÍA DE FLUJO
TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO
1. Cuantificación del número de moléculas por célula
2. Determinación de moléculas solubles
3. Enumeración celular
4. Nuevas formas de marcaje4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes
4.2 Marcaje intracelular
4.3 Marcaje de proteínas totales
1) CUANTIFICACIÓN DEL
NÚMERO DE MOLÉCULAS
POR CÉLULA INDIVIDUAL
Cuantificación del número de moléculas por célula individual
• Cuantificación del número medio de
moléculas por célula
• La cantidad de antígeno que contiene cada
célula se expresa en ABC (antigen binding
capacity) o capacidad de unión antigénica
CUANTIFICACIÓN DE ABC
1.1) QUIFIKIT
1.2) RAINBOW BEADS
1.1) QUIFIKIT: FUNDAMENTO
• Micropartículas de calibración con cantidades determinadas de IgG unidas.
• Se emplea un segundo anticuerpo fluorescente anti-IgG. La fluorescencia por micropartícula es proporcional a la cantidad de IgG unida
• Se realiza una curva de calibración entre la intensidad media de fluorescencia frente a la capacidad de unión de anticuerpo (ABC)
PROTOCOLO DE MARCAJE
PROTOCOLO DE MARCAJE
QUIFIKIT
QUIFIKIT
REALIZACIÓN DE LA RECTA ESTÁNDAR
• Unión media bruta (ABC media bruta) relaciona la intensidad de fluorescencia con la capacidad de unión
• Se obtiene la formula de la recta que nos permitirá deducir la ABC media bruta de cada célula a partir de su intensidad de fluorescencia media
RECTA DE REGRESIÓN
log ABC (antigenicbinding capacity)
3 4 5 6
log
MF
I (m
ean
flu
ores
cen
ce in
ten
sity
)
0
1
2
3
4voltage 453 (r2=0.999)
voltage 463 (r2=0.999)
voltage 473 (r2=1)
voltage 483 (r2=0.999)
voltage 493 (r2=0.999)
1.2) RAINBOW BEADS
Micropartículas con número conocido de moléculas de fluorocromos unidos covalentemente
RAINBOW BEADS
Patrón Problema
RAINBOW BEADS
R5
R4
M1M2
M3M4M5
M6
M1M2M3M4M5M6
Marker Left, Right Events % Gated Mean CV Peak ChAll 1, 9910 12943 100.00 518.70 128.03 1826
M1 1512, 2350 2213 17.10 1826.46 1.80 1826M2 730, 1219 2164 16.72 871.87 2.58 873
M3 189, 359 2046 15.81 245.10 3.77 245M4 57, 129 2259 17.45 89.29 5.96 87
M5 24, 53 2115 16.34 34.50 8.71 34M6 1, 7 2140 16.53 1.66 38.55 1
Gate: G2 X Parameter: FL1-H FL1-Height (Log)
M1M2
M3M4M5M6
Marker Left, Right Events % Gated Mean CV Peak ChAll 1, 9910 12943 100.00 1107.52 133.97 4104
M1 3191, 5777 2213 17.10 4107.18 1.56 4104M2 1446, 2187 2165 16.73 1723.37 1.64 1730
M3 328, 667 2046 15.81 472.42 2.32 474M4 127, 281 2258 17.45 178.55 3.20 177
M5 42, 100 2116 16.35 62.57 4.23 63M6 1, 6 1674 12.93 1.81 30.19 1
Gate: G2 X Parameter: FL2-H FL2-Height (Log)
M1M2M3M4M5M6
Marker Left, Right Events % Gated Mean CV Peak Ch
All 1, 9910 12943 100.00 688.33 151.53 2890M1 2091, 4614 2213 17.10 2882.30 2.09 2890
M2 655, 1407 2165 16.73 885.87 2.96 897M3 124, 352 2048 15.82 189.72 5.41 191
M4 47, 107 2257 17.44 67.86 6.99 67M5 16, 47 2117 16.36 28.19 12.08 27
M6 1, 8 2081 16.08 2.58 33.76 2
Gate: G2 X Parameter: FL3-H FL3-Height (Log)
Marker Left, Right Events % Gated Mean CV Peak ChAll 1, 9910 12943 100.00 682.85 123.80 2371
M1 1778, 3995 2216 17.12 2362.49 3.27 2371M2 710, 1811 2172 16.78 1097.54 4.92 1094
M3 241, 599 2050 15.84 321.76 7.22 324M4 109, 241 2480 19.16 145.60 11.41 145
M5 47, 109 1896 14.65 81.83 12.68 82M6 1, 47 2140 16.53 20.57 22.46 21
Gate: G2 X Parameter: FL4-H FL4 (Log)
CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA
• Asunción: el control negativo tiene cero moléculas del antígeno
Problema: emite fluorescencia inespecífica
• Hay que tener en cuenta el número de fluorocromos por anticuerpo
CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA
• La capacidad de unión específica (ABC específica o neta) es igual a la cantidad de moléculas antigénicas expresadas por cada célula. Experimentalmente se determina como la ABC media para el anticuerpo específico menos la ABC media del control negativo
DIFERENCIACIÓN DE POBLACIONES EN BASE A UNA DETERMINADA MOLÉCULA
• En linfocitos CD4 activados disminuye la
intensidad de expresión del correceptor CD4. En
linfocitos CD8 activados aumenta la expresión del
correceptor CD8
• Activación TCR modulación de CD3
• La apoptosis reduce la expresión de determinados
antígenos de linaje
2) CUANTIFICACIÓN DE
CONCENTRACIONES DE
MOLÉCULAS SOLUBLES
FUNDAMENTO
El numero medio de moléculas de citocina capturadas por cada partícula se relaciona con la concentración de la citocina en el sobrenadante
PROTOCOLO
Incubación Lavado
Marcaje
Lavado
DETERMINACIÓN DE CITOCINAS SOLUBLES
Citocina
- +
Citocina
- +
SSC
CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS
SOLUBLES
• Más rápido y sensible que el ELISA. 90
min. Sensibilidad fentomolar: 10-15 M
• Multiparamétrico
3) ENUMERACIÓN CELULAR
ENUMERACIÓN CELULAR
- Los métodos anteriores proporcionaban una cifra relativa de las células que están proliferando
- Este método ratiométrico permite calcular el número absoluto de células con respecto a las que sembramos inicialmente
CULTIVOS CELULARES
Medio PHA
Células
Tras cultivoTras cultivo
R1
R2
BasalBasal
R2R2
R1R1R1R1
R2R2
R1R1
R2R2
CÉLULAS TCÉLULAS TCÉLULAS BCÉLULAS B
MICROPARTÍCULASMICROPARTÍCULAS
MuerteMuertecelularcelular
CrecimientoCrecimiento
ENUMERACIÓN CELULAR
ENUMERACIÓN CELULAR
Tras
Cultivo
Apoptosis
Crecimiento
CÁLCULO DEL NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULAS
N0 = concentración celular inicialNt = concentración celular a tiempo t
Nt = (Ratiot / Ratio0) * N0
Ratiot = (Célst / Partículast)
Ratio0 = (Céls0 / Partículas0)
t. Partículas = cte.
Nt = (Célst / Céls0) * N0
ENUMERACIÓN CELULAR
R1
R8
R1
R8
R1
R8
Células 2000Partículas 2000
= = 1
40002000
= 2
10002000
= 0.5
Crecimiento
Apoptosis
Basal
20002000
= 50.000 céls
1 50.000 céls2 x
x = 100.000 céls
=
1 50.000 céls0.5 x
x = 25.000 céls
=
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ENUMERACIÓN CELULAR
• Centrifugación
• Sedimentación de células y micropartículas
• Número de células y de micropartículas adquiridas
CENTRIFUGACIÓN CELULAR
Número de lavadosNúmero de lavados00 11 22 33
% d
e %
de
recu
per
ació
nre
cup
erac
ión
celu
lar
celu
lar
00
1010
2020
3030
4040
5050
6060
7070
8080
9090
100100
300 g300 g
200 g200 g
SEDIMENTACIÓN DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS
Ratio Céls/Micropartículas Ratio Céls/Micropartículas
0.00.0 .2.2 .4.4 .6.6 .8.8
1.Adquiridas 1.Adquiridas inmediatamenteinmediatamente
Tras 20 minutos:Tras 20 minutos:2. Adquirir2. Adquirir
3. Agitación manual.3. Agitación manual.
4. Vortex4. Vortex
*
*
NÚMERO DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS ADQUIRIDAS
Ratio células/partículasRatio células/partículas
0.10.1 11 101000
22
44
66
88
1010
1212
1414
100100
CV
del
rat
io
CV
del
rat
io
VALIDACIÓN DEL MÉTODO
• Precisión – Coeficiente de variación (CV)
• Sensibilidad– Límite de sensibilidad
• Exactitud– Linealidad
ESTUDIO DE LA PRECISIÓN Y DE LA SENSIBILIDAD
ContadoresContadorescelularescelulares
Células/ml x 10Células/ml x 10-3-311 1010 100100 10001000
CV
(%
)C
V (
%)
00
1010
2020
3030
4040
5050
6060
MicroscopíaMicroscopíaCitometríaCitometría
de flujode flujo
ESTUDIO DE LA EXACTITUD
ContadoresContadorescelularescelulares
Ratio céls/micropartRatio céls/micropart
00 22 44 66 88 101000
200200
400400
600600
800800
10001000
r= 0.9997r= 0.9997
Nº
abso
luto
de
célu
las
x 10
Nº
abso
luto
de
célu
las
x 10
-3-3
Nº medio deNº medio decélulas x 10células x 10-3-3
00 200200 400400 600600 800800 10001000
r= 0.9891r= 0.9891
Nº medio de célulasNº medio de célulaspor campopor campo
00 1010 2020 3030 4040 5050 6060 7070
r = 0.9956r = 0.9956
MicroscopíaMicroscopíaCitometríaCitometríaDe flujoDe flujo
ENUMERACIÓN DE CÉLULAS APOPTÓTICAS
• Las células apoptóticas se fragmentan en cuerpos apoptóticos
• Las células apoptóticas pierden la expresión de antígenos específicos de linaje.
FRAGMENTACIÓN CELULAR
Una célula apoptótica se fragmenta en varios cuerpos apoptóticos.¿Cuál es el límite en FSC entre las células apoptóticas y los cuerpos apoptóticos?
FRAGMENTACIÓN CELULAR
Aunque se pudiera precisar el límite, perdemos células ya fragmentadas que escapan del gate de análisis.
Per
mea
bil
idad
de
mem
bra
na
Tamaño celular
INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS
PrevalenciaPrevalencia = = apoptóticas /apoptóticas /viablesviables+apoptóticas+apoptóticas = (1/5) = (1/5)
20% = prevalencia de la apoptosis20% = prevalencia de la apoptosis
Incidencia = (Incidencia = (apoptóticasapoptóticas + + fragmentadasfragmentadas+ + pérdidaAgpérdidaAg)) / / totaltotal = (6/10) = (6/10)
60% = incidencia de la apoptosis 60% = incidencia de la apoptosis
INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS
(1/10) = 10 % prevalencia (1/10) = 10 % prevalencia
Incidencia = (1/10) 10%
APOPTOSIS TEMPRANA
(4/9) = 44% prevalencia (4/9) = 44% prevalencia
Incidencia (5/10) = 50%
(1/5) =(1/5) =
20 % prevalencia20 % prevalencia
Cuerpos apoptóticosCuerpos apoptóticos
Fragmentacióncelular
Incidencia = 60%
APOPTOSIS TARDÍA
IMPACTO DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR EN LA MEDIDA DE LA APOPTOSIS
Hours of culture
0 6 12 18 24
% o
f Apo
ptot
ic c
ells
0
10
20
30
40
50
60
70 Apoptosis incidence Apoptosis prevalence
0 hours0 hours
24 hours24 hours
6 hours6 hours
PÉRDIDA DE ANTÍGENOS PÉRDIDA DE ANTÍGENOS ESPECÍFICOS DE LINAJE (AEL)ESPECÍFICOS DE LINAJE (AEL)
Si las células apoptóticas pierden su AEL, la prevalencia de la apoptosis en la población positiva será menor que su incidencia en la población original
APOPTOSIS INDUCIDA POR CICLOHEXIMIDA
CD3 CD8 CD4 CD190
20
40
60
80
100
AI TOTAL AI HIGH AI MED AI LOW
Por
cen
taje
de
célu
las
apop
tóti
cas
ALLBRIGHT
DIMNEG
AEL
MFI061
MFI004
MFI015
Células Células viablesviables
ApotóticasApotóticastempranastempranas
ApoptóticasApoptóticastardíastardías
ApoptóticasApoptóticasintermediasintermedias
CD19 on B-CLL leukemic cells
MFI131
Estudio de la expresión de AEL en células en Estudio de la expresión de AEL en células en diferentes estadios de la apoptosisdiferentes estadios de la apoptosis
Viablecells
EarlyApoptotic
IntermediateApoptotic
LateApoptotic
MF
I
20
40
60
80
100
120
140
ESTADIO DE LA APOPTOSIS
PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD19)
POR CÉLULA INDIVIDUAL
CD8
Stage of apoptosis
Viable EA IA LA
MF
I
0
100
200
300
400
500CD56
Stage of apoptosis
Viable EA IA LA
MF
I0
50
100
150
200
250
300
PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD8 Y CD56)
POR CÉLULA INDIVIDUAL
Stage of apoptosis Stage of apoptosisCD3
Stage of apoptosis
Viable EA IA LA
MF
I
0
100
200
300
400
500
600CD5
Stage of apoptosis
Viable EA IA LA
MF
I
0
50
100
150
200
PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD3 Y CD5)
POR CÉLULA INDIVIDUAL
Antígeno específico de linaje
CD5 CD3 CD8 CD19 CD56
% P
érd
ida
de
an
tíg
en
o (
Via
ble
s-E
A)
0
20
40
60
80
100
PORCENTAJE DE PÉRDIDA DE AEL ENTRE LAS CÉLULAS VIABLES Y LAS APOPTÓTICAS TEMPRANAS (EA)
REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN
CELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICACELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICA
APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS___________________________________________________________
VIABLES + APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS
≤≤
AIAPOPTÓTICAS
VIABLES + APOPTÓTICAS
_________________________________=
REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN
CELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICACELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICA
APOPTÓTICAS
VIABLES + APOPTÓTICAS
APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS
VIABLES + APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS
≤≤
2
6 + 2
2 + 1 + 3
6 + 2+ 1 + 3= 0.25 = 0.5<<
AR vs. AI
Subpoblación linfocitariaCD19CD19 CD56CD56 CD8CD8 CD4CD4 CD3CD3
% d
e cé
lula
s ap
optó
tica
s
0
20
40
60
80
100AI
AR
4) NUEVOS MÉTODOS DE
MARCAJE
4) NUEVOS MÉTODOS DE MARCAJE
4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes
4.2 Marcajes intracelulares
4.3 Marcajes de proteínas totales
4.1) MARCAJE DE
RECEPTORES CON LIGANDOS
FLUORESCENTES
4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES
• Estudio de receptores con ligandos solubles (citocinas, factores de crecimiento). Para medir la capacidad de unión de ligando por célula individual.
• Se emplean ligandos marcados con moléculas fluorescentes
• Buffer de marcaje especiales optimas para unión del ligando a su receptor específico
4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES
Ligando-FITC
4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES
Ligando-FITC
Ligando
4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES
Ligando-FITC
Dominio de unión
4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES
Ligando-FITC
Unión inespecífica
4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS
INTRACELULARES
4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES
• Mitocondriales (Bcl-2, Apo-2) de gránulos de secreción (citocinas, perforinas, granzimas)
• Detección de receptores presentes en citoplasma pero no expresados en superficie
• Caracterización multiparamétrica de las células que producen las citocinas en poblaciones de células mononucleares
4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES
• Permite el estudio de gran número de células y realizar medidas estadísticamente significativas:– 10 → error = 33%
– 100 → error = 10%
– 10.000 → error=1%
• Aporta información sobre producción de citocinas por células individuales caracterizadas por inmunofenotipo
LIMITACIONES DE LAS TÉCNICAS DE MARCAJE INTRACELULAR• Sensibilidad limitada:
– cantidad mínima de citocina detectable en cada célula
– frecuencia mínima de células positivas discriminable del fondo
• Para marcar intracelularmente hay que matar las células
SENSIBILIDAD
SOLUCIONES CANTIDAD MÍNIMA DE CITOCINA DETECTABLE EN CADA CÉLULA
• Anticuerpos marcados con APC para aumentar la intensidad de fluorescencia media por célula
• Aumentar el número de fluorocromos por anticuerpo
• Inhibidores del transporte celular para aumentar las concentraciones intracelulares
FRECUENCIA DE CÉLULAS POSITIVAS DISCRIMINABLES
+S, -E -S, +E
AMPLIFICACIÓN ENZIMÁTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR• Se marcan las células con anticuerpos conjugados
con peroxidasa de rábano (HRP)• La HRP produce radicales inestables tiramina
conjugados con biotina que se depositan alrededor del lugar de catálisis
• La adición de estreptavidina conjugada con HPR amplifica la señal
• Se incrementa 15 veces la relación señal-ruido
AMPLIFICACIÓN CATALÍTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR (CARD)
Sustrato
Radical tiramina
Tiramina
+
Biotina
HPR
AMPLIFICACIÓN CATALÍTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR (CARD)
Estreptavidina-HPR
+
EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS
• IL-10 e IFN se expresan en membrana plasmática en un número bajo de copias (<300 copias/membrana)
• Sistemas de amplificación– Liposomas magneto-fluorescentes 1 x 105
IL-10 2.3 34.8IFN 12.5 12.5
EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS
IL-10 2.3 34.8
IFN 12.5 12.5
EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS
IL-10 2.3 34.8
IFN 12.5 12.5
MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS
• Uso de anticuerpos biespecificos anti-CD45-anti-citocina para la captura de las citocinas producidas por células individuales
• Se pueden fabricar también con fragmentos Fab
MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS
CD45 Anti-citocina Citocina
MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS
• Permite la separación de las células viables productoras de una citocina determinada por FACS o por separación inmunomagnética
• Estas células se pueden analizar por otros métodos o cultivarse para obtener clones
4.3) MARCAJE DE PROTEÍNAS
TOTALES
RELACIÓN ENTRE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Y LA APOPTOSIS
Proliferación
Todas se dividenuna vez
1 cél. apoptosis1 se divide 3 veces
½ apoptosis½ se dividen 2 veces
HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE
- Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE)
- Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares
y que se reparte por igual entre las células hijas
HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE
HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSECFSE
XX
Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula
X / 2X / 2 X / 4X / 4
DespuésDespuésdel cultivodel cultivo
BasalBasal
M1
MARCAJE CON CFSE
CULTIVOS CELULARES
Medio PHA
Células
HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE
R2R3
No proliferantes
Proliferantes
HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE
PHA+IL-2
Nº de divisiones celulares
0 1 2 3 4
FS
C
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE
Combinación con antígenos de superficie:
relación procesos de diferenciación con procesos
de proliferación
PHA
PHA +
IL-2
R2
R2
3% 59%
38%
3% 53%
44%
3 días de cultivo
PHA
PHA +
IL-2
R2
R2
23% 48%
29%
15% 48%
37%
5 días de cultivo
PHA
PHA+
IL-2
R2
R2
71% 19%
10%
37% 40%
23%
7 días de cultivo
MARCAJE CON CFSE
• Estudios in vivo
• Estudios ex vivo
• Estudios in vitro