UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences Biologique
Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de
MASTER ACADEMIQUE
Domaine : Science de la Nature et de la Vie
Filière : Biologie
Spécialité : Microbiologie Appliquée
Présenté par : ZERGOUNE Fatma
Thème
La sélection des souches des bactéries lactiques protéolytiques
isolées à partir d’un produit laitier fermenté artisanale a basse
de lait de vache « j’ben »
Soutenu publiquement
Le : 10 /06/2015
Devant le jury :
Année universitaire : 2014/2015
UKM Ouargla Présidente M.C.B Mme
Ouled ElHadj Khelil Aminata
UKM Ouargla Examinateur M.A.A Mr.BANSACI.Messaoud Bachagha
UKM Ouargla Encadreur M.A.A Mr
.BOURICHA M‘hamed
REMERCIEMENTS
J’adresse en premier lieu ma reconnaissance à notre DIEU tout puissant, de
m’avoir permis d’en arriver là, car sans lui rien n’est possible.
Au terme de ce travail, il est agréable de présenter mes remerciements les plus
sincères à Monsieur Bouricha M’hamed., pour m’avoir proposé ce sujet si
intéressant et m’avoir accepté d’encadrer et d’orienter tout au long de mon
travail avec leur judicieux conseils et sa constante disponibilité, c’est grâce à sa
compétence et indulgence que ce travail a pu être réalisé
Je tiens à remercier Monsieur Bensassi Messouad Bachagha. Responsable de la
spécialité de microbiologie d’avoir acceptée d’examiner mon mémoire.
Je remercie également Madame Ouled ElHadj Kheil Aminata. d’avoir acceptée
la présidence du jury de mon travail,
C’est également un grand honneur pour moi d’être jugé par vous «Soyez
profondément remercié».
Je remercie aussi l’ensemble du personnel travaillant au laboratoire du
département de Biologie.
Mes remerciements vont également à mes enseignants qui m’ont accompagné
pendant mon cursus universitaire.
Je tiens à remercier tous le personnel de l’Université de Kasdi Merbah de
m’avoir aidé à réaliser ce projet. Merci infiniment pour les efforts fournis.
Mes plus vifs remerciements à mes parents, ma famille, et mes amies.
DEDICACE
Spécialement à mon père
À qui je dois énormément, qui a cru en moi et qui m’a donné les moyens d’aller
aussi loin. Ce travail est le fruit de tes sacrifices que tu as consentis pour mon
éducation et ma formation.
A ma très chère mère
Affable, honorable, aimable : Tu représentes pour moi le Symbole de la bonté
par excellence, la source de tendresse et l’exemple du dévouement qui n’a pas
cessé de m’encourager et de prier pour moi. Ta prière et ta bénédiction m’ont
été d’un grand secours pour mener à bien mes études.
A mes très chères sœurs :rym ,chaherazed les mots ne suffisent guère pour
exprimer l’attachement, l’amour et l’affection que je porte pour vous.
A mes très chères frères :elhachmi ,fadal Je vous dédie ce travail avec tous mes
voeux de bonheur, de santé et de réussite.
A mes oncles : nourdine,selimane,rahmoun,toufik,faride
Ames tantes.
A mes cousins :khaiera ,khalida ,douaa,yasmine,iman, khadidja,houda, warda,
nawal ,manoubya
A mes cousins :charafedine ,rafik,mouneaam,abdou,hicham
A tous les membres de ma famille zergoune, petits et grands
Qui n’a cessé de me soutenir pendant tout mon parcours. Je leur exprime toute
ma gratitude pour leur soutien financier et moral, ce qui m’a permis d’être à ce
niveau. Puisse ce diplôme nous réserver a tous des lendemains meilleurs.
Pour finir j’adresse mes remerciements à mes très chers amis qui sont devenus
des frères et sœurs pour
moi :djamila,madjeda,khadidja,lila,ahlame,hayat,zouhera,iman,zineb,farahe,
amine,khadera ,saberina et autres, pour leurs conseils et leurs soutiens sans
faille.
Sommaire
Sommaire
Remerciement
Dédicace
Liste d‘abréviation
Liste des tableaux
Liste des figures
Introduction 1
Généralités sur le lait
I.1.Définition du lait 2
I.2.Composition chimique du lait 2
I .3.Caractères physico –chimiques du lait: 6
I.4.La valeur nutritive du lait 7
II. Produits laitiers fermentés traditionnels 7
II.1.Exemples Produits laitières fermentés traditionnels Algériens 7
II.2.La microflore du lait fermenté 11
II.2.1.Les bactéries lactiques 11
II.2.1.1.Le genre Lactobacillus 12
II.2.1.2.Le genre Lactococcus 12
II.2.1.3Le genre Streptococcus 12
II.2.1.4.Les genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella 13
II.2.1.5.Le genre Enterococcus 13
II.2.1.6.Les genres Pediococcus et Tetragenococcus 13
II.2.1.7.Le genre Bifidobacterium 14
II.2.2.Les levures 14
II.2.3.Les moisissures 14
II.2.4.Les virus 15
II.3.Microflore de J‘ben 15
II.4.Composition biologique du lait 15
II.4.1.Flore originelle 15
II.4.2.Flore de contamination 16
II.4.3. Action de la flores microbienne 16
II.4.4.Acidification ou Fermentation acide 16
II.4.5.Le filage 17
II.4.6.L‘alcanisation du lait 17
II.4.7.Autres dégradation 17
II.4.8.La protéolyse 17
II.4.8.1.Activité protéolytique 18
II.4.8.2.Bactéries lactiques protéolytique 19
II.4.8.3.Intérêt de l‘activité protéolytique des bactéries lactiques 19
Matériel et méthodes
I.1.Matériel Biologique 21
I.1.1.Préparation de fromage frais (j‘ben) 21
II .Méthodes 24
II.1.Techniques de prélèvements et échantillonnages 24
II.2.Mesure de pH 24
II.3. Préparation des dilutions 24
II.3.1.Préparation de la dilution mère 24
II.3.2.Préparation des dilutions décimales 24
II.4. Isolement des bactéries lactiques 25
II.5.Purification 25
II.6.Conservation des souches 25
II.7. Identification des souches 25
II.7.1.Pré-identification des souches 26
II.7.1.1. Caractérisation phénotypique des souches 26
II.7.1.1.1. Étude morphologiques 26
A/L‘aspect macroscopique et microscopique 26
B/L‘aspect microscopique 26
II.7.1. 2. Production de la catalase 26
II.7.2. Testes physiologique et biochimique 27
II.7.2.1. Testes physiologique 27
II.7.2.1.1. Croissance dans les conditions hostiles 27
A/Croissance à différentes températures (4, 15, 37 et 45°C) 27
B/Croissance en présence de différentes concentrations de Na Cl 27
C/Croissance à pH 4 et 9,6 27
II.7.2.1.2. Thermorésistance 27
II.7.2.1.3Type fermentaire 28
II.7.2.1.4 Croissance sur lait bleu de Sherman 28
II.7.2.2. Test biochimique 28
II.7.2.2.1. Profile fermentaire 28
II.7.2.3.Tests technologiques 29
II.7.2.3.1. Test de citrate 29
II.7.2.3.2. Production de dextrane 30
II.7.2.3.3. La recherche l‘arginine dihydrolase (ADH) 30
II.8. Étude de l‘activité protéolytique des isolats 30
II.8.1. Activité protéolytique en milieu solide. 30
II.9. Cinétique d‘acidité 31
RESULTATS ET DISCUSSION
III.1.Mesure de pH 33
III.2.Isolement, purification 33
III.3.Pré-identification des souches 34
III.3.1.Caractérisation phénotypique des souches 34
III.3.1.1.Étude morphologiques 34
A/L‘aspect macroscopique 34
B/L‘aspect microscopique 35
III.3.2.Production de la catalase 36
III.4.Identification des souches 37
III.4.1.Testes physiologique et biochimique 37
III.4.1.1. Testes physiologiques 37
III.4.1.1.1.Croissance dans les conditions hostiles (en différents température, pH, NaCl 39
III.4.1.1.2.Thermorisistance 39
III.4.1.1.3. Type fermentaire 39
III.4.1.1.4. Test de lait de Sherman 40
III.4.1.2. Test biochimique 41
III.4.1.2.1. Profile fermentaire 41
III.4.1.3. Tests technologiques 43
III.4.1.3.1. Test de citrate 43
III.4.1.3.2. La production de dextrane 44
III.4.1.3.3. Recherche de l‘Arginine dihydrolase (ADH) 45
III.5. Étude de l‘activité protéolytique des isolats 46
III.6. Cinétique d'acidité 48
Conclusion 52
Références bibliographiques
Annexes
Liste des abréviations
ADH Arginine Dihydrolase
DM Dilution Mére
MRS Mayeux, Sandine et Elliker
S19 Souche19
BL Bactéries Lactiques
Lb Lactobacillus
FAO Food and Agriculture Organization
ADH Arginine Di Hydrolase
Liste des figures
Photo Titres Pages
01 Schéma de la fabrication de fromage frais (j‘ben). 22
02 Schéma résumant la méthodologie utilisé pour l‘étude de Cinétique
d‘acidité
03 Des colonies des bactéries lactiques sur le milieu MRS 34
04 Des colonies des bactéries lactiques sur le milieu M17 34
05 L‘aspect macroscopique de la souche sur milieu MRS sur milieu
liquide 35
06 Aspect d‘une culture pure dans un milieu liquide 35
07 Observations microscopiques des bactéries lactiques avec un
grossissement (G : 10x100) 36
08 Résultat des tests physiologique (déférents pH et NaCL) 39
09 Type fermentaire sur milieu MRS liquide glucosé contenant la cloche
de Durham. 40
10 Le test de lait de Sherman 41
11 Le profil fermentaires des isolats effectué sur plaque d‘Eliza 42
12 Résultat de la dégradation de citrate sur milieu KMK 44
13 Test de production des exopolysaccharides ( dextrane) 45
14 Résultats du test d‘hydrolase arginine 46
15 Etude de l‘activité protéolytique sur milieu YMA 48
16 Résultats de la cinétique d‘acidité 49
17 Variation de pH en fonction du temps chez la souche S19 50
18 Variation de l‘acidité exprimée en degrés Dornic en fonction du
temps chez la souche S19 51
Liste des tableaux
Tableaux Titres pages
I La composition moyenne du lait de vache (Charles et al., 2005) 4
II Caractéristiques physicochimiques du lait de vache (F.A.O,
1998). 6
III Résultats des tests physiologiques sur les souches étudiées 38
IV Profil fermentaire des souches isolées 42
V la variation de pH et de degré Dornic en fonction du temps chez
la souche S19
50
Introduction
1
Introduction
Le lait est un liquide blanc mat, légèrement visqueux, dont la composition et les
caractéristiques physico-chimiques varient sensiblement selon les espèces animales, et même
selon les races. Ces caractéristiques varient également au cours de la période de lactation,
ainsi qu‘au cours de la traite.
Les laits fermentés sont des produits laitiers transformés par une fermentation essentiellement
lactique qui aboutit à l‘acidification et à la gélification du lait (Béal et Sodini, 2012).
Leur nature dépend du type de lait utilisé, le prétraitement, les conditions de fermentation et le
traitement ultérieur (Zamfir et al., 2006).
Les bactéries lactiques sont des micro-organismes de catégorie alimentaire qui jouent un rôle
essentiel dans la fermentation des matières premières animales et végétales. Elles occupent
des niches écologiques extrêmement variées. Leur capacité à fermenter les hydrates de
carbone et, à un moindre degré, de dégrader les protéines et les lipides mène à la synthèse
d'une large gamme de composés, tels que les acides organiques, les peptides, les composés
antimicrobiens et aromatiques et les exopolysaccharides. Ces métabolites peuvent contribuer
aux caractéristiques organoleptiques, technologiques et nutritionnelles des aliments fermentés
(Mozzi et al., 2010).
Une large gamme d‘activités métaboliques et propriétés sont recherchées chez ces
bactéries pour un usage industriel, telle que l‘acidification, la protéolyse, la production de
polysaccharides…etc.
Grâce à leur richesse en enzymes protéolytiques (protéinase de paroi, peptidases) ils
participent, avec d‘autres enzymes, à l‘hydrolyse des caséines, protéines essentielles du
lait, en petits peptides et acides aminés. Cette activité est d‘autant plus accrue grâce au
phénomène d‘autolyse bactérienne rendant plus accessible aux enzymes intracellulaires
libérés leurs substrats présents dans la matrice fromagère (Hassaine O.,2013).
Cette activité contribue de façon très significative dans l‘apparition des qualités
organoleptiques souhaitables et appréciées des fromages, telles que la texture et la flaveur.
Les peptides et acides aminés libérés sont en effet des précurseurs de nombreuses
molécules riches en saveurs et en arômes qui sont à la base du succès gastronomique des
fromages(Hassaine O.,2013).
Introduction
2
Pour ces multiples raison nous avons étudié le pouvoir protéolytique des bactéries lactiques,
isolées à partir d‘un produit laitier fermenté traditionnel (J‘ben), en se basant sur les deux
essentiels étapes :
Isolement et identification des bactéries lactiques à partir d‘un produit laitier fermenté
traditionnellement (j‘ben) ;
Rechercher des souches des bactéries lactiques responsables de l‘activité protéolytique
présente dans le j‘ben.
Synthèse bibliographiques
3
I. Généralités sur le lait
I.1.Définition du lait
Le lait destiné à l‘alimentation humaine a été défini en 1909 par le Congrès international
de la répression des fraudes comme suit :
« Le lait est produit intégral de la traite et ininterrompue d‘une femelle laitière bien
portante, bien nourrie et non surmenée .II doit recueilli proprement et ne pas contenir de
colostrum » (larpant, 1997).
Le lait sans indication de l‘espèce animal de provenance correspond au lait de vache
(larpant, 1997).
I.2.composition chimique du lait :
Le lait est un substrat très riche fournissant à l‘homme, et aux jeunes mammifères un
aliment presque complet. Protides, lipides, sels minéraux, et vitamines sont présents à des
concentrations tout à fait satisfaisantes, pour la croissance, et la multiplication cellulaire
(LARPENT, 1991).
Le tableau I résume la composition chimique moyenne d‘un litre de lait de vache.
Synthèse bibliographiques
4
Tableau I : La composition moyenne du lait de vache (Charles et al., 2005)
Constituants
majeurs
Composition
(%)
Etat physique des
composants Caractéristiques
Eau 87 Eau liber : 87.5%
Eau liée : 10%
C‘est le solvant du lactose et des sels.
Retenue par des substances en émulsion et en suspension
Glucides
<< lactose >> 40 Solution Un solide blanchâtre , avec un pouvoir sucrant 4 fois plus faible que le saccharose.
Lipides :
Triglycérides
Phospholipides
Fraction
insaponifiable
35
98
1
1
Les globules gras
sont en émulsion
de type huile dans
l‘eau
Se trouvent aux centres des globules gras.
Constituent l‘enveloppe des globules gras .
Rassemblent :les carotènes et les stérols (d‘où dévirent les A et B )
Protides :
*Caséine
*Protéines du sérum
*Substances azotées non
protéiques
34
80
20
1.2
Suspension
micellaire de
Phospho-
caseinate de
Ca++
Solution
colloïdale
Solution varie
Sont principalement : αs1,αs2,β et κ
Les deux principales sont la β-lactoglobuline et α-lactalbumine
Sont principalement :protéase, peptone.
Constituants mineurs Composition Etat physique des
composants Caractéristiques
Minéraux :
*Potassium
*Calcium
*Chlorure
Traces
1500(mg/kg)
1180(mg/kg)
958(mg/kg)
/ Cette composition varie selon la saison et l‘alimentation de l‘animal.
Synthèse bibliographiques
5
Vitamines :
*Hydrosolubles
A
D
E
K
*Liposolubles
B6, B1
B2 (Riboflavine)
Traces
40µg/100ml
2.4µg/100ml
100µg/100ml
5µg/100ml
50.45mg/100ml
175µg/100ml
/
Participant comme cofacteurs dans les échanges à l‘échelle des membranes cellulaire.
Enzymes :
*Hydrolases
Estérases
Protéases
*Diastases
*Oxygénases
Traces
/
Leurs substrats spécifiques sont les Triglycérides, esters phosphoriques.
Enzymes spécifiques pour les parois cellulaires microbiennes et caséine.
Enzymes spécifiques aux protéines, peptides et bases puriques.
Le substrat est les composés réducteurs H2O2
Synthèse bibliographiques
6
I .3.caractères physico –chimiques du lait:
Le lait est un liquide opaque blanc mat, plus ou moins jaunâtre selon la teneur de la
matière grasse en béta carotène Tableau II (Bourgeois et al ; 1996).
Tableau II : Caractéristiques physicochimiques du lait de vache (F.A.O, 1998).
Constantes Moyennes Valeurs extrêmes
Energies
(Keal/Litre)
(MJ /Litre)
701
2930
587-876
2454-3662
Densité du lait entier à20°c 1.031 1.028-1.033
Densité du lait écrémé - 1.036
Densité du la matière grasse - 0.954-0.96
pH à 20°c 6.6 6.6-6.8
Acidité titrable (Dornic) 16 15-17
Point de congélation (°c) (-0.520)-(-0.550)
Viscosité du lait entier à 20°c
(centipoises)
2.2 -
Viscosité du lait entièr à 25°c
(centipoises)
1.8 1.6-2.1
Viscosité du lait écrémé à 20°c
(centipoises)
1.9 -
Point d‘ébullition - 100.17-100.15
Synthèse bibliographiques
7
I.4.La valeur nutritive du lait
Le lait un substrat très fournissant à l‘homme et aux jeunes mammifères un aliment
presque complet, protides glucides lipides sels minéraux et vitamines sont présents à des
concentrations tout à fait satisfaisantes pour la croissance et la multiplication cellulaire
(Bourgeois et al., 1996).
II. produits laitiers fermentés traditionnels
Les produits laitiers fermentés ont été produits pour prolonger la durée de conservation
du lait. Ces aliments traditionnels ont persisté au cours des siècles et ils ont souvent évolué
d‗un niveau artisanal et traditionnel à la fabrication à grande échelle industrielle avec
production utilisant des cultures spécifiques (starter) et équipements modernes (Cogan, 1996;
Oberman, 1998).
II.1.Exemples Produits laitières fermentés traditionnels Algériens
II.1.1.L’ben
L'origine de ce produit remonte à des temps immémoriaux, probablement à l'époque
où l'homme a commencé à domestiquer les espèces laitières et à utiliser leurs laits. Sa
fermentation lactique lui donne son arôme naturel et sa saveur inimitable. Sa préparation
artisanale est simple, le lait est abandonné à lui-même jusqu'à sa coagulation. Celle-ci se fait à
température ambiante et dure 24 à 48 h selon la saison. Le barattage qui lui succède dure 30 à
40 minutes. A la fin du barattage, on ajoute généralement un certain volume d'eau (environ 10
% du volume du lait), chaude ou froide, suivant la température ambiante, de façon à ramener
la température de l'ensemble à un niveau convenable au rassemblement des grains de beurre
(Ouadghiri, 2009 ; Benkerroum et Tamime, 2004).
II.1.2. Raïb
Le Raïb fait partie des produits laitiers fermentés populaires en Algérie, en plus du
L‘ben (lait écrémé fermenté). Le Raïb a une très ancienne tradition en Algérie; il est fabriqué
à partir du lait cru de vache ou de chèvre. La fermentation du lait, comme de nombreux
procédés traditionnels de fermentation, est spontanée et incontrôlée et pourrait être une source
précieuse des bactéries lactiques autochtones (Mechai et Kirane, 2008).
Synthèse bibliographiques
8
II.1.3.Bouhezza
Ce type de fromage est répandu dans le territoire de l'Aurès (zone Chaouia). Il est
fabriqué à partir de lait de chèvre, de vache ou de brebis baratté et écrémé (lben) (Touati,
1990 et Hallal, 2001).
Le salage, l'égouttage et l'affinage sont réalisés simultanément dans une outre
perméable (Chekoua) avec incorporation de poudre du piment rouge (figure 4), la fabrication
de bouhezza dure plusieurs semaines à plusieurs mois, il a un goût acidulé fort caractérisé au
fromage (Zaidi, 2002).
II.1.4.Klila
La klila est préparée à partir du lben chauffé sur feu doux pendant 12 minutes environ
pour favoriser la séparation du caillé et du lactosérum et accélérer le processus d'égouttage.
Le lait caillé est égoutté dans un tissu fin. La klila peut être consommée à l'état frais ou
additionnée à certains plats traditionnels après avoir été coupé en petits cubes et séchés au
soleil (Touati, 1990).
II.1.5.Takammart
D'après (Hellal, 2001), c'est un fromage du Hoggar, il est fabriqué par introduction
d'un bout de caillette de jeunes chevreaux dans le lait, après quelques heures, le caillé est
retiré à l'aide d'une louche et déposé en petits tas sur une natte et sera ensuite pétri pour
évacuer le sérum puis déposé sur une autre natte faite de tige de fenouil sauvage qui lui donne
de l'arome. Les nattes sont ensuite placées à l'ombre jusqu'à durcissement du fromage. Le
fromage peut subir un affinage durant un mois (Gast et coll., 1969 cité par Abd Elaziz et Ait
Kasi, 1992).
II.1.6.Aoules
Il est fabriqué à partir du lait de chèvre qui est extrêmement aigre. Après une
coagulation intense, le fromage obtenu a une pâte dure (matière sèche représente 92%).
L'égouttage se fait dans une paille ensuite, il est reformé sous forme des boules plates séchées
au soleil, il peut être consommé en mélange avec les dates (Abdelaziz et aitkaci, 1992).
Synthèse bibliographiques
9
II.1.7.Lebaa
La matière première est le colostrum, parfois il est mélangé avec des oeufs, il est salé
puis bouillit pendant 15 mn environ. Le produit obtenu est appelé lebaa (Lemouchi, 2008).
II.1.8.Méchouna
Il est fabriqué à partir du lait cru qui est chauffé jusqu'à ébullition. Ensuite, on ajoute
de lait fermenté <<lben>> ou <<rayeb>> et du sel. En utilisant une gaze, le mélange est laissé
égoutter. Il est consommé frais ou avec la galette (Lemouchi, 2008).
II.1.9.Madghissa
Le fromage est connu dans la zone du chaouia coté Est du pays. Il est préparé avec la
klila fraîche après salage et incorporation du lait frais. L'ensemble est porté à ébullition sur
feu doux jusqu'à séparation du caillé et de lactosérum. Après refroidissement du mélange, la
marmite est basculée pour éliminer le lactosérum. Le fromage ainsi préparé est une pâte jaune
salée et élastique appelée madghissa (Aissaoui, 2003).
II.1.10. kémaria
La kémaria c‘est un type de fromage traditionnel qui caractérise une place très
important dans la société d‘une valeur de consommation très remarquable autochtone de la
wilaya de Ghardaïa. (HARROUZ et OULAD HADJ ,2007).
II.1.11.J’ben (Fromages frais traditionnel)
Le « J‘ben » est le fromage traditionnel frais le plus connu depuis fort longtemps aussi
bien en milieu rural qu'en milieu urbain.
Le J‘ben est obtenu par coagulation enzymatique (présure extrait à partir de la caillette
de veau). Le lait destiné à la fabrication est chauffé, une fois tiède, un fragment de caillette
bovine est macéré dans le lait. après coagulation du lait et égouttage, le caillé ainsi obtenu
peut être salé ou additionné de quelques épices ou de plantes aromatiques (Abdelaziz et Ait
Kaci, 1992).
Synthèse bibliographiques
10
Le fromage frais commercialisé est fabriqué soit à partir du lait de vache ou du lait de
chèvre. Le processus de fabrication nécessite trois grandes étapes essentielles : la maturation,
la coagulation et l‗égouttage (Randazo et al., 2002).
A/ La maturation
C‗est l‗incubation du lait cru à température ambiante pendant un temps variable de
façon à favoriser la multiplication d‗une flore lactique qui va jouer un rôle important dans
l‗acidification du lait. Cette maturation peut être spontanée ou provoquée par adjonction de
levains. Le recours à des levains artificiels du commerce n‗est cependant pas toujours une
nécessité absolue, car le fermier producteur de lait a lui-même la possibilité de cultiver un
levain naturel à partir de la flore contenue dans son propre lait (Randazo et al., 2002).
B/La coagulation
C‗est une opération qui vise à coaguler le lait au moyen de la présure (emprésurage)
ou de toute autre enzyme coagulante. L‗activité coagulante est déterminée par la force de
présure, la température du lait et son acidité. Après l‗emprésurage, le lait est abandonné au
repos à température ambiante pendant 6 à 10 heures. Il va prendre en masse (caillage) avec
une consistance plus ou moins ferme selon le degré d‗acidité développé.
En réalité, le coagulum est obtenu par deux modes de coagulation : la coagulation dite
lactique et celle engendrée par l‗action de la présure. Ces deux modes ont une action
simultanée sur le lait avec cependant une prédominance plus ou moins marquée de l‗un ou
l‗autre selon que le fromager souhaite obtenir une pâte à caractère plus présure ou à caractère
plus lactique(Randazo et al., 2002).
C/L‘égouttage
Un des buts essentiels de cette opération est de régler la teneur en eau du fromage. Il
permet l‗élimination de la plus grande partie du sérum qui imprègne le coagulum. L‗égouttage
est amorcé dans des moules qui confèrent au fromage sa forme. La nature du gel influe sur la
conduite de l‗égouttage. Un gel lactique subit un égouttage spontané et le caillé a par
conséquent une forte humidité. Cependant, un gel présure est un gel compact, solide ou
l‗égouttage ne peut avoir lieu qu‗après certaines interventions telles des actions mécaniques
de pression.
Synthèse bibliographiques
11
Suivant le goût du fromager, le salage peut être fait. C‗est une opération importante
dans la fabrication des fromages. Elle a des effets multiples : elle améliore l‗égouttage en le
complétant, elle oriente et sélectionne le développement microbien et relève la saveur de la
pâte (Kbibou, 1987; Benkerroum et Tamime 2004).
II.1.11.1. Caractéristiques physiques et chimiques du J’ben
le fromage frais « J‘ben » ne présente pas de caractéristiques définies à cause des
méthodes artisanales utilisées pour sa préparation reposant, essentiellement, sur les
connaissances acquises à partir d‘une longue expérience (Salmeron et al., 2002). Les arômes,
les propriétés organoleptiques et les caractéristiques physico-chimiques du fromage dépendent
de celles du lait cru qui à son tour dépend de la race des animaux et leur type d‘alimentation
(Poznanski et al., 2004). Généralement, Le pH (< 4,2) et l'acidité titrable (> 0,9%) sont les
paramètres les moins variables du « J‘ben ». Cependant, les matières solides totales du «
J‘ben » sont le facteur le plus variable car ce dernier dépend de la durée d‘égouttage. Étant
donné que les lipides, le lactose et les protéines constituent les principaux composants de
l‘ensemble des matières solides en « J‘ben », ils sont directement influencés par les variations
des dites matières solides (Benkerroum et Tamime 2004). De nos jours, J‘ben est également
préparé à partir de lait pasteurisé. Les caractéristiques finales d‘un J‘ben typique sont
variables et affectées par le préparation du fromage (Ouadghiri et al., 2005).
II.2. Microflore du lait fermenté
Bactéries, leveurs, moisissures et virus peuvent être présents dans le lait fermenté. Les
bactéries ont une place prédominante dans l‘ensemble des problèmes microbiologique du lait,
et des produits laitiers, les levures et les moisissures intéressent surtout la fromagerie.
II.2.1.Les bactéries lactiques
Elles rassemblent en effet un certain nombre de genres qui se caractérisent par la
production, liée à un métabolisme exclusivement fermentaire, de quantités importantes
d‘acide lactique à partir des sucres.
La fermentation est dite : homolactique si l ‘acide lactique est pratiquement le
seul produit formé et hétérolactique si d ‘autres composés sont aussi présents (acide
acétique, éthanol, CO2 …etc.) (Leveau et Bouix, 1993 ; Pilet et al., 2005).
Synthèse bibliographiques
12
Elles sont à Gram positif, généralement immobiles, asporulées, catalase
négatives, oxydase négatives généralement nitrate réductase négative, ce sont des
bactéries anaérobies facultatives. Elles ont des exigences nutritionnelles complexes pour
les acides aminés, les peptides, les vitamines, les sels, les acides gras et les glucides
fermentescibles (Dellaglio et al., 1994 ; Hogg, 2005).
II.2.1.1.Le genre Lactobacillus
Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae, il
contient de nombreuses espèces qui sont des agents de fermentation lactique intervenant
dans de nombreuses industries ou qui sont rencontrées comme contaminants. Il s ‘ agit
de bacilles longs et fins (parfois incurvés) souvent groupés en chaînes, immobiles,
asporulés, catalase négative, se développent à un optimum de température situé entre 30 et
40°C. Les lactobacilles ont des exigence s nutritionnelles très complexes en acides
aminés , en vitamines, en acides gras, en nucléotides, en glucides et en minéraux
(Khalid et Marth, 1990 ; Leclerc et al., 1994 ).
II.2.1.2.Le genre Lactococcus
Les lactocoques se présentent sous forme de coques en paire ou en chaînes de
longueur variable. Ce sont des bactéries anaérobies facultatives homofermentaires ne
produisant que de l‘acide lactique L(+), seul Lactococcus lactis ssp. lactis biovar .
diacetyla ctis produit le diacétyle. Leur température optimale de croissance est proche de
30°C, capable de se développer à 10°C mais pas à 45°C. Quelques espèces produisent
des exopolysaccharides et des bactériocines. Elles sont capables de se développer à 3% de b
leu de méthylène et d‘hydrolyser l‘arginine (Tamime, 2002).
Actuellement, le genre Lactococcus comprend cinq espèces, Lactococcus lactis est l ‘espèce
la plus connue avec ses trois sous - espèces : Lc. lactis ssp. lactis, Lc. lactis ssp. cremoris
et Lc. lactis ssp. hordniae (Pot et al., 1996 ; Pot, 2008) .
II.2.1.3Le genre Streptococcus
La seule espèce de streptocoques qui soit utilisée en technologie alimentaire est
Streptococcus thermophilus (Stiles et Holzapfel, 1997).
Synthèse bibliographiques
13
Streptococcus thermophilus se différencie par son habitat (lait et produits laitiers) et
son caractère non pathogène. La résistance à la température, la capacité de croitre à 52°C
et le nombre limité des hydrates de carbones permettent de distinguer les St.
thermophilus de la plupart des autres streptocoques (Haddie, 1986 ; Pilet et al., 2005).
II.2.1.4.Les genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella
Ils ressemblent les coques lenticulaires en paires ou en chainettes mésophiles,
qui possèdent un caractère hétérofermentaire marqué, avec production d‘acide lactique
(isomère D), de CO2 et d‘éthanol. Les caractéristiques telles que l‘hydrolyse de
l‘esculine, la formation de dextrane, lesconditions de croissance, la capacité à croître à
différents pH et température, l‘assimilation de citrate et/ou malate permettent la
différenciation entre les genres Leuconostoc et Weissella (Pilet etal., 1998 ; Ho et al . ,
2007).
Le développement des leuconostoc entraîne souvent l‘apparition d‘une viscosité dans
le milieu grâce àla production des exopolysaccharides. Les leuconostoc principalement Ln.
mesenteroides ssp. cremoris et L n. lactis sont utilisés en association avec les lactocoques
dans l‘industrie laitière pourproduire en plus de l‘acide lactique et le CO2, des substances
aromatiques telles que le diacétyle etl‘ acétoïne à partir des citrates du lait (Hassan et Frank,
2001 ; Guiraud, 2003 ; Ogier et al., 2008 ).
II.2.1.5.Le genre Enterococcus
Ce genre regroupe les s treptocoques fécaux . Ce sont des commensaux de
l‘intestin. Les espèces rencontrées dans l‘alimentation sont essentiellement En. faecalis
et les espèces proches. Les entérocoques sont des coques qui peuvent être mobiles,
homofermentaires, généralement différenciés par la fermentation de l‘arabinose et le
sorbitol, ils croissent entre 10°C et 45° C (Tamime, 2002 ; Ho et al., 2007).
II.2.1.6.Les genres Pediococcus et Tetragenococcus
Les Pediococcus sont des coques homofermentaires dont la particularité est le
regroupement en tétrade. Ils sont mésophiles, le plus souvent incapable d‘utiliser le
lactose, et leur développement nécessite la présence de divers facteurs de croissance.
Certaines espèces se distinguent par leur capacité à se développer à des teneurs en
Synthèse bibliographiques
14
sels très élevées, comme Pediococcus halophilus , renommé Tetragenococcus halophilus
et Tetragenococcus muriaticus qui tolère jusqu ‘à 18% de NaCl (Pilet et al., 2005).
II.2.1.7.Le genre Bifidobacterium
Le genre Bifidobacterium est considéré comme faisant partie du groupe des
bactéries lactiques grâce à la similarité de ses propriétés physiologiques et biochimiques et à
sa présence dans le même habitat écologique, tel que le tube gastro intestinal. .
Les bifidobactéries s e caractérisent par leur forme très irréguli ère souvent en forme
V mais pouvant être coccoïdes, la présence d'une enzyme, le fructose - 6- phosphate
phosphocétolase, celle- ci leur permet de fermenter les hexoses en produisant de l'acide
acétique et de l'acide lactique. Leur température de croissance varie de 36°C à 43°C
(Axelsson et al., 2004 ; Pilet et al., 2005 ; Ho et al., 2007)
II.2.2.Les levures
Bien que présentes dans le lait, leur action est minime. Certaines d‘entre elles sont
capables de fermenter le lactose en alcool (production de l‘éthanol).
On n‘a pas identifié pour l‘instant de levures pathogènes associées au domaine laitier.
Il y a des levures qui participent à l‘affinage de certaines fromages et d‘autres entrent dans la
fabrication de certains produits laitiers fermentés.
On retrouve aussi dans le domaine laitier des levures nuisibles responsables de
certaines dégradation détectées par des odeurs d‘alcool, par un gonflement des emballages et
du fromage du à la production de gaz et par le limonage (Carole. l ., 2002).
II.2.3.Les moisissures
Sans importance dans le lait liquide, elles intéressent un grand nombre d‘autres
produits laitiers. Elles se développent en surface, ou dans les parties internes aérées. Elles sont
productrices de lipases et de protéases, dont on rencontre le Penicillium et le Geotrichum
(F.A.O, 1995).
Synthèse bibliographiques
15
II.2.4.Les virus
Nuisibles à la culture des levains, ils sont aussi appelés bacériophages (F.A.O, 1995).
II.3.Microflore de J’ben
La composition microbiologique du fromage dépend de celle du lait de départ, du
processus de fabrication qu‘il a subi et de l‘âge du fromage (Ercolini et al., 2009).
Généralement, elle est dominée par les bactéries lactiques en l‘occurence les
Lactococcus et les Enterococcus qui influencent les caractéristiques sensorielles du produit
fini (Randazzo et al., 2009).
II.4.Composition biologique du lait
II.4.1.Flore originelle
Le lait contient peu de micro-organismes lorsqu‘il est dans de bonnes conditions, à
partir d‘un animal sain (moins de 5000 germes / ml et moins de 1 coliformes /ml) Il s‘agit
essentiellement de germes saprophytes du pis et des canaux galactophores : microcoques
streptocoques lactiques et lactobacilles.
D‘autres micro-organismes peuvent se trouver dans le lait lorsqu‘il est issu d‘un animal
malade ; ils sont généralement pathogènes et dangereux du point de vue sanitaire Il peut s‘agir
par exemple d‘argents de mammites.
Les mammites sont dues à des infections par Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae, Escherichia coli…etc.
Les pathogènes pour l‘homme sont également les micro-organismes suivants :
Mycrobacterrium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Brucellella, Streptococcus
agalactiae Escherichia coli, salmonella, Leptospira, Listeria monocytogene ,Bacillus cereus,
Pasteurella multocido, Clositridium perfringens , Coxiella burnetii, Campylobacter, Yesinia
(bourgeois et al ; 1996).
Synthèse bibliographiques
16
II.4.2.Flore de contamination
Le lait au cours de la traite, du transport et du stockage à la ferme ou à l‘usine, est
contamine par une grande variéte de micro –organismes une partie seulement d‘entre eux peut
se multiplier dans le lait si la température leur est favorable et le milieu propice.
Les principales sources de contamination sont les suivants :
Fèces et téguments de l‘animal ; coliformes, Bacillus, Clositridium, Salmonella.
Sol ; Streptomyces , bactéries sporulées spores de champignons.
Litières et aliment : flore banale, Lactobacilles ; Clostridium butyriques (ensilage)
Air et eau : flores divers
Equipements de traite et de stockage du lait : flore lactique, microcoques
Lactobacilles ; Chromobacterium , Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium,
Acinetobacter , levures.
Manipulateur : Staphycoques des mains, germes d‘expectoration et contamination
fécale.
Vecteur divers : insectes en particulier.
Parmi ces micro- organismes il en est d‘inoffensifs d‘autres de dangereux du point de
vue sanitaire, d‘autres enfin sont capables d‘entrainer la détérioration du lait (ARPENT ;
1997).
II.4.3.Action de la flore microbienne
De nombreux micro-organismes peuvent se développer dans le lait en entrainant par
leur action des modifications des propriétés organoleptiques Ces altérations vont dépendre des
conditions de stockage du lait et des traitements qu‘il subit (Guiraud ;1998).
II.4.4.Acidification ou Fermentation acide
La plupart des micro-organismes du lait sont capables de fermenter le lactose en
produisant une acidification qui entraine la coagulation de la caséine : Lactococcus lactis,
Coliformes, Enterococcus, Feacalis ; Lactobacilles (Bourgeois et al 1991)
Synthèse bibliographiques
17
II.4.5.Le filage
II consiste à la modification de la viscosité, soit par la présence de fibrine et de
leucocytes qui passent dans le lait pendant la traite ; soit par la production de capsules
mucilagineuses qui peuvent apparaitre à faible température par Alcaligenes, Microccus
(Guiraud, 1998, Bourgeois et al 1991).
II.4.6.L’alcanisation du lait
Les genres Pesudomonas ,Alcaligens , Micrococcus peuvent produire l‘alcalinité du lait
sans protéolyse ,l‘alcalinisation est due, soit à la formation d‘ammoniaque à partir de l‘urée ,
soit à la décomposition des acides organiques, tel que l‘acide citrique (Bourgeois et al,1991).
II.4.7.Autres dégradation
Pseudomonas et les bactéries sporulées peuvent dénaturer la matière grasse par
hydrolyse des acides gras insaturés ou oxydation ou les deux (Guiraud ,1998)
Les microorganismes pigmentes peuvent entrainer des colorations anormales du lait,
coloration bleu (Pseudomonas syncynea), jaune (flavobacterium) (bourgeois et al 1991) .
II.4.8.La protéolyse
Protéolyse: est le phénomène le plus complexe et le plus important de la maturation
des fromages; elle est subdivisée en deux étapes:
a. Protéolyse primaire: c'est une hydrolyse spécifique des caséines qui est
influencée par la concentration, la rétention d'eau, l'activité des enzymes elle-
même et le pH (Kalit et coll., 2005).
La protéolyse primaire représente l'étendue de la dégradation des caséines native en gros
peptides, et essentiellement liée à l'action des protéases contenues dans la présure,
notamment la chymosine et à celle de la plasmine, la protéolyse primaire est évaluée par
électrophorèses.( GRAPPIN et al. (1985) et PAVIA et al. (2000)) .
b. Protéolyse secondaire : correspond à l'hydrolyse des gros peptides par l'action
des protéinases et des peptidases des bactéries lactiques "levains" et "non levains" qui
Synthèse bibliographiques
18
donnent des peptides plus courts et des acides aminés. (GRAPPIN et al., 1985 ; PAVIA
et al., 2000), Cette dégradation a deux conséquences:
La pâte fromagère devient plus molle et plus onctueuse (action sur la texture de la
pâte).
il y a production de métabolites qui confèrent un arôme et une saveur particulière au
fromage (action sur la flaveur) (Eck, 1975).
Elle est favorisée par un long stockage à basse température, la protéolyse peut se
manifester directement par l‘odeur et paroo légère alcalinisation du lait : les germes
responsables sont : Micrococcus, Alcaligenes,Bacillus, Clostridium ,Pseudomonas Ces micro-
organismes interviennent directement ou par l‘action de leurs enzymes thermostables
(Guiraud,1998).
II.4.8.1.Activité protéolytique
Les BL exigent plusieurs acides aminés pour leur croissance et le milieu de culture
doit donc en contenir, sous une forme quelconque, pour leur permettre de se développer. Cela
explique pourquoi les milieux commerciaux destinés à la propagation des ferments
contiennent des peptones ou des extrais de levure. Il n‘y a malheureusement pas de milieu
universel pour les BL, car les exigences acides aminés varient avec les souches (carol.l ;
2002).
Il n‘y a que très peu d‘acides aminés ou de peptides libre dans le lait en fait, si les
Lactocoques ne disposaient que de cette source, leur population ne dépasserait guère 3 fois
10000000 unités formant des colonies (UFC) /ml (juillard et al 1996). On a démontré que la
majorité de l‘azote servant à la croissance des Lactocoques provient des caséine et que la
croissance des Lactocoques sur lait se fait croissance des oligopeptides libères de la
protéolyse de la caséine (juillard et al 1995).
Dans une culture mixte de BL il doit donc y avoir des souches qui synthétisent les
protéases pour qu‘une abondante croissance sur lait soit possible. Certains ferments sont
applés « lents» lorsque inoculés dans le lait. cette dénomination n‘est pas tout à fait exacte.
Car les ferments lents ont un taux initial de croissance aussi élevé que les cultures dites
rapides (Cogan 1980) les ferments lents ont typiquement des activités protéinasiques réduites.
Synthèse bibliographiques
19
Le métabolisme d‘hydrolyse des protéines affecte non seulement la croissance des
cellules, mais également la saveur des fromages. Une accumulation de peptides peut
provoquer de l‘amertume. Pour éviter ce défaut causé par certains ferments, les fournisseurs
préparent des cultures mixtes ayant des mélanges de souches avec diverses activités
protéolytiques et peptidasiques.
Le système protéolytique des bactéries lactique est compose de protéases associees a la
paroi cellulaire, qui catalysent l‘hydrolyse de proteines en peptides contenant de 7 a16 residus
amines (Law et Haandrikman, 1997).
II.4.8.2.Bactéries lactiques protéolytique
La croissance jusqu‘à des densités cellulaires permettant aux bactéries lactiques
d ‘assurer les fonctions de fermentation repose sur un système protéolytique capable de
satisfaire tous les besoins en acides aminés en hydrolysant les protéines. Les bactéries
lactiques démontrent des potentialités différentes, liées à leur équipement enzymatique,
pour l‘utilisation de la fraction azotée. Les lactobacilles présentent généralement une
activité protéolytique plus prononcée que les lactocoques (Donkor et al., 2007 ; Monnet et
al., 2008 ; Roudj et al., 2009) .
Le catabolisme des acides amines (des activités peptidases et amino-peptidases) ont
été rapportées chez LB.sakei , Lb. Cuvvatus et LB.plantarum (Fadd et al. ,1999a:1999b).
II.4.8.3.Intérêt de l’activité protéolytique des bactéries lactiques
Le système protéolytique joue un rôle clé dans la fermentation du lait et permet
l‘obtention d‘acides aminés à partir des caséines, les protéines les plus abondantes dans le lait.
(Savijoki et al .,2006) .
Les bactéries lactiques provoquent une augmentation des protéines solubles dans le
milieu et l'apparition de peptides et d'acides aminés qui outre le fait qu'ils stimulent la
croissance des microorganismes, interviennent dans la formation de certains composés
aromatiques(Savijoki et al.,2006).
Ce microorganisme est responsable d‘une activité protéolytique qui est le
phénomène dominant lors de l‘affinage. Cette activité contribue dans l‘apparition des
Synthèse bibliographiques
20
courts peptides et acides amines, précurseurs de nombreuses molécules riches en arômes et
en saveurs.
Or la dégradation de la caséine durant ce processus participe également à la
modification de la texture et la flaveur des fromages. A ce stade les aminopeptidases ont
l‘activité la plus forte en hydrolysant pratiquement la totalité des courts peptides
hydrophobes responsables de l`apparition du goût des fromages (Desmazeaud, 1998).
Une fraction de ces peptidiques est susceptible d‘exercer des effets désirables chez le
consommateur après l‘ingestion de ce lait fermenté. Ces peptides sont désignés peptides
fonctionnels ou encore peptides bioactifs. Il y a quatre domaines principaux dans lesquels
l`effet observé lors de la consommation des produits laitiers, peut être attribue à ces
peptides, qui sont respectivement, le système digestif, les défenses de l`organisme, le
système cardio-vasculaire et le système nerveux (Tome, 1998).
Certains Lactobacillus, notamment Lb. sakre, Lb curvatus et Lb. plantarum sont dotées
des leucine et valine amino-peptidases), contribuant ainsi a la formation de la flaveur du
produit par les produit par les acides amines et les petits peptides porduits (PAPAMANDI
et al.,2003)
Le catabolisme des acides amines peut résulter la formation d'autre produits dont
les méthyles et les alcools méthyles (TALON et al., 2002).
Matériel et méthodes
21
Matériel et méthodes
Notre étude a porté sur une durée de 3 mois de Mars à Mai et a été réalisée au niveau
des laboratoires de microbiologie et de biochimie de la faculté des sciences de la nature et de
la vie (Université KASDI Merbah Ouargla).
I. Matériel Biologique
I.1. Préparation de fromage frais (j’ben)
Un fromage (J‘ben) variété molle est produit selon un protocole traditionnel qui
comprend la coagulation de lait cru entier de vache collecté à partir d‘une ferme à Hassi
benaballah , à laquelle a été ajouté un sel dans une proportion de par litre de lait (Mennane et
al., 2007).
Le processus de fabrication nécessite trois grandes étapes essentielles (figure 1):
la maturation, la coagulation et l‘égouttage (Voire annexe 1).
Le salage peut être fait. C‘est une opération importante dans la fabrication des
fromages
Après l‘obtention du fromage frais on n‘a divisé ce dernier en trois portions ;
une est seulement salée
la 2éme portions additionné par l‘ail
la 3éme portions additionné par coriandre.
Cette préparation est résumée dans la figure 1
Matériel et méthodes
22
Lait cru
Maturation Fermentions spontanée a T°
Ambiante pendant 24-72h
Lait cillée
Coagulation
Egouttage
J‘ben gout coriandre j‘ben gout l‘ail
Figure 1: Schéma de la fabrication de fromage frais (j’ben).
J‘ben
Matériel et méthodes
23
II .Méthodes
II.1.Techniques de prélèvements et échantillonnages
On a effectué des prélèvements sur trois échantillons de fromage frais (j‘ben) :
a-j‘ben
b- j‘ben avec gout d‘ail
c –j‘ben avec gout de coriandre
II.2.Mesure de pH
Le pH des différents échantillons de j‘ben est mesuré par un pH-mètre, la mesure du
pH exprime la concentration en H+.
Après l‘étalonnage du pH-mètre, l‘électrode est placée directement dans la masse
l‘échantillon (j‘ben) (Saoudi., 2012).
On a rincé l‘électrode du pH-mètre avec de l‘eau distillée, après l‘électrode a été
insérée directement dans (Owusu et al, 2012).
II.3. Préparation des dilutions
II.3.1.Préparation de la solution mère
La solution mère a été préparée ; en introduit 1 g du fromage frais (j‘ben) dans un tube
stérile qui contient 9ml d‘eau physiologique ; l‘homogénéisation a été réalisée à l‘aide du
vortex après introduction du j‘ben.
Cette suspension constitue alors la dilution mère (DM) qui correspond à la dilution
1/10 ou 10-1
(Lebres et al., 2002).
II.3.2.Préparation des dilutions décimales
Un millilitre de la dilution mère (10-1
) est prélevé aseptiquement à l‘aide d‘une
micropipette et introduit dans un tube à essai contenant 9 ml d‘eau physiologique stérile. On
obtient ainsi la dilution 10-2 et on répète la même procédure en prélevant 1mlà partir de la
Matériel et méthodes
24
dilution 10-2
et en l‘introduisant aseptiquement dans un tube à essai contenant 9 ml du diluant
et ainsi de suite jusqu‘à 10-6
(Guiraud., 2003).
II.4. Isolement des bactéries lactiques
L‘isolement des bactéries lactiques est réalisé sur le milieu MRS solide à pH 6.2 et le
milieu M17, l‘isolement se fait en profondeur à partir des dilutions 10-3,
10-4
,10-5
.
Les cultures sont incubées pendant 24 à48 heures à 30 °C dans des boîtes de Pétri à
l‘obscurité. (Kacem et Karam, 2006, Cheriguene et al., 2007).
II.5.Purification
La purification des souches isolées est réalisée par repiquages successifs alternant sur
milieux sélectifs MRS liquide et solide (par la méthode des stries), et l‘incubation à 30°C.
(Kacem et Karam, 2006, Cheriguene et al., 2007).
La pureté des souches est révélée par des colonies homogènes ayant le même aspect
extérieur (couleur, taille et forme) (Guiraud, 2004).
Ces colonies pures sont retenues pour la suite de l‘étude.
II.6.Conservation des souches
La conservation des souches pures a été faite selon deux méthodes: à court et à long
terme.
A courte terme a été effectuée à 4°C dans des tubes à essais en géloses MRS
inclinées en tubes à raison d‘un repiquage toutes les 4 semaines
A long terme, les souches sont conservées dans une solution contenant 70% de lait
écrémé (enrichie par 0.5g/l d'extrait de levure et 0.5g/l de glucose) et 30% de glycérol
à 40% à -20°C (Samelis et al., 1994).
II.7. Identification des souches
L‘identification a été établie en se basant sur des caractères morphologiques et divers
caractères biochimiques : production d‘enzymes, température de croissance, production de
gaz carbonique, fermentation de divers sucre.
Matériel et méthodes
25
II.7.1.Pré-identification des souches
II.7.1.1. Caractérisation phénotypique des souches
II.7.1.1.1. Étude morphologiques
A/L’aspect macroscopique et microscopique
Cette étude est basée sur l‘observation visuelle de la culture des isolats sur milieu
MRS solide et liquide ; pour caractériser la taille, la forme et la couleur des
colonies sur milieu MRS solide (Badis et al, 2005). Et le trouble dans le milieu
liquide.
L‘étude macroscopique nous a permis de noter le diamètre, la pigmentation et l'aspect
des colonies. (Hassaine.O,2013)
B/L’aspect microscopique
L'étude microscopique par l‘intermédiaire de la coloration de Gram, nous a permis
d‘examiner la forme, le mode d‘association et le Gram de ces bactéries. (Hassaine
O ,2013)
La coloration de Gram a été effectuée selon le protocole décrit par (Prescott et al.,
2003 )(voir annexe 3).
Cette coloration permet de différencier les bactéries à Gram positif de celles à Gram
négatif, les bâtonnets, les coques et le mode de regroupement. (Hadef S.,2012)
II.7.1. 2. Production de la catalase
L‘activité catalytique permet la dégradation de l‘eau oxygénée en oxygène et en eau.
Elle est mise en évidence en émulsionnant une à deux colonies de l‘isolat de la souche à tester
dans une solution fraîche d‘eau oxygénée à 10 volumes. Un dégagement gazeux abondant
sous forme de mousse, traduit la décomposition de l‘eau oxygénée sous l‘action de l‘enzyme à
tester (Guiraud, 2003).
La catalase permet la décomposition de l'eau oxygénée selon la réaction :
2 H2O2 2 H2O + O2
Matériel et méthodes
26
II.7.2. Testes physiologique et biochimique
II.7.2.1. Testes physiologique
II.7.2.1.1. Croissance dans les conditions hostiles
A/Croissance à différentes températures (4, 15, 37 et 45°C)
Ce test est important car il permet de distinguer les bactéries lactiques mésophiles des
bactéries lactiques thermophiles, ce test est réalisé en bouillon MRS. La croissance est
appréciée par un trouble du milieu après 24 heures à 4, 15, 37 et 45°C en comparaison avec
un tube témoin non ensemencé (Hassaine O.,2013).
B/Croissance en présence de différentes concentrations de Na Cl
Ensemencement des isolats dans des tubes de bouillon de MRS à 2 %, 4% et 6% de
NaCl l‘incubation se fait à 30°C pendant 24 heures. (Hassaine O.,2013)
La croissance de ces bactéries se manifeste par un trouble du milieu en
comparaison avec un tube témoin non ensemencé.
C/Croissance à pH 4 et 9,6
Ce test est réalisé uniquement pour les cocci en milieux MRS liquide dont le pH est
ajusté à 4et9, 6.
La croissance est appréciée par un trouble du milieu après 24 heures à 30C °
(Hassaine O ,2013).
II.7.2.1.2. Thermorésistance
Le teste de thermorésistance est destiné aux coques, il permet de sélectionner des
espèces thermorésistantes. Les souches à tester sont préalablement réparties dans des tubes
de milieu MRS. Ces tubes sont par la suite exposés à une température de 62°C pendant 30
min en suite on incuber a 30C° pendant 24 à 72heures (Hassaine O,2013)
Matériel et méthodes
27
II.7.2.1.3Type fermentaire
Ce test permet de différencier les bactéries lactiques homofermentaires de celles
hétérofermentaires. (Hassaine O,2013)
Il consiste à mettre en évidence la production du gaz (CO2). De jeunes souches
préalablement préparées sont ensemencées dans des tubes contenant du bouillon MRS, avec
une cloche de Durham. Après incubation à 37°C pendant 24–48 heures, la présence ou
l‘absence du gaz dans la cloche indique le type fermentaire (Hariri et al., 2009).
Les souches homofermentaires vont produire 90% d‘acide lactique et seulement 10%
de CO2, par contre les souches hétérofermentaires vont produire l‘acide lactique et le CO2 a
proportions égales (Carr et al., 2002).
II.7.2.1.4 Croissance sur lait bleu de Sherman
Une série de tubes à essais de 10ml de lait écrémé stérilisé à 0,1% et à 0,3% de bleu de
méthylène est ensemencé par des cultures pures puis incubés durant une période de24 à 48
heures à 30°C, on note que les observations relatives à la réduction de bleu de méthylène et la
coagulation du lait.
Seuls les entérocoques peuvent se développer dans le lait à 0,3% de bleu de
méthylène (Rabah N., 2010).
Et certaines coques sont capables de se développer sur du lait à 0.1% de bleu de
méthylène après incubation à 30°C pendant 48 heures (Hassaine O,2013).
II.7.2.2. Test biochimique
II.7.2.2.1. Profile fermentaire
Les bactéries lactiques dégradent différemment les sources de carbone. L‘étude de la
fermentation des sucres est réalisée sur le milieu spécifique bouillon MRS (sans le glucose
et l‘extrait de viande), additionné de pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH
(MRS-BCP) (Bekhouche et (Boulahrouf, 2005, Mannu et al., 2000) .
Matériel et méthodes
28
Les solutions de sucres ont été préparées dans 10 ml d‘eau distillée contenant 1 g des
différents sucres. Ces préparations sont stérilisées par chauffage au bain Marie à 100°C
pendant 10 min puis conservées au réfrigé rateur (Joffin et Leyral,1996).
Les sucres que nous avons testés sont : Arabinose, Glucose, Lactose, Maltose ,
Rhamnose, Saccharose, Sorbitol , Sucrose, Tréhalose, Xylose. Nous avons effectué
l‘identification des souches en nous référant au manuel de Bergey (De Vos et al., 2009).
Ce test est résumé dans les étapes suivantes :
Dans des tubes à hémolyse stériles, on mit 1ml de MRS BCP.
On récupère les culots après centrifugation des cultures jeunes des souches
étudiées après lavage par l‘eau distillée.
On ajoute 0,1ml de chaque sucre dans les tubes précédents.
On ensemence le contenu des tubes avec 0,1ml des souches et en dernier on y
ajoute une goutte d‘huile de paraffine stérile pour l‘anaérobiose.
L‘incubation se fait à 30°C pendant 24 à 48 h. (Rabah N., 2010).
Le virage de la couleur du milieu du violet au jaune indique la fermentation du sucre
donc la souche a dégradé le sucre (résultat positif), si non le résultat est négatif. (Hariri et
al., 2009).
II.7.2.3.Tests technologiques
II.7.2.3.1. Test de citrate
L‘utilisation du citrate est étudiée sur milieu Kempler et Mc Kay (1980) (Kihal et al
,1996 ; Moulay, 2006). Ce milieu contient une solution de ferricyanide de potassium et une
solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l‘ion
ferrique et le potassium ferricyanide. Les colonies qui fermentent le citrate lancent la réaction
entre ces ions il en résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu (après 18 h-
72 h d‘incubation). Les colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches. (Marchal
et al., 1991).
Citrate-positive : culture avec alcalinisation du milieu (virage de l‘indicateur au bleu).
Matériel et méthodes
29
Citrate-négative : pas de culture (coloration verte de milieu inchangée) (Marchal et
al., 1991).
II.7.2.3.2. Production de dextrane
La production du dextrane (exo-polysaccharides) à partir du saccharose est mise
en évidence sur milieu solide MSE (Mayeux et al., 1962). L‘ensemencement des isolats se
fait par méthode de strie, et incubées à 30°C pendant 24h à48h.
Les souches productrices de déxtrane sont caractérisées par la formation de colonies
larges, visqueuses et gluantes. Ce test est aussi considéré comme clé d‘indentification
permettant aussi de différencier entre les leuconostocs productrices et non productrice de
dextran.
II.7.2.3.3. la recherche l’arginine dihydrolase (ADH)
La mise en évidence de cette enzyme est intéressent pour la caractérisation des
bactéries lactiques. Le rôle de cette enzyme est de libérer l‘ammoniac à partir de l‘arginine.
Pour effectuer ce test on utilise le milieu M16 BCP par l‘ensemencement en stries
et l‘incubation se fait à 30 °C pendant 24 h (Thomas ., 1973).
Ce milieu contient un indicateur de pH, le pourpre de bromocrésol, si la couleur du
milieu vire au jaune puis vers le violet ceci indique la présence de l‘enzyme et la dégradation
de l‘arginine. Si elle reste jaune cela veut dire que la bactérie est ADH négative.
II.8. Étude de l’activité protéolytique des isolats (Hassaine O,2013).
II.8.1. Activité protéolytique en milieu solide.
L‘activité protéolytique des bactéries est mise en évidence et comparée sur un milieu
plus riche(MRS) additionné de lait écrémé (YMA) (Van Den Berg et al., 1993).
Les bactéries à tester, issues d‘une culture jeune,
Pour le milieu YMA : Ont été ensemencées en touches à l‘aide d‘une anse de platine.
Après incubation à 30°C pendant24 h
Matériel et méthodes
30
L‘activité protéolytique de ces isolats se manifeste par l‘apparition d‘un halo clair
autour des colonies. (Hassaine O,2013).
II.9. Cinétique d’acidité
L‘un des caractères technologiques essentiels des bactéries lactiques est leur aptitude à
l‘acidification du lait qui dépend de l‘aptitude à la fermentation du lactose et de la résistance à
l‘acide développé dans le lait écrémé stérile
La mesure de l‘activité acidifiante consiste à suivre d‘une part l‘évolution du pH des
différentes cultures en fonction du temps et d‘autre part à doser simultanément l‘acidité totale
par la soude (Hadef S., 2012).
L‘acide lactique produit par les souches isolées est mesuré à l‘aide d‘un Ph mètre
puis titré par le NaOH 1/9 N en présence d‘un indicateur de pH (la
phénolphtaléine 1%). Cette acidité est exprimée en degré Dornic (D°).
Un degré Dornic correspond à l‘acidité apporté par 0,1g d‘acide lactique dans un litre
de lait.
Chaque souche est ensemencée dans un tube à 10 ml de lait écrémé stérile puis
incubés à 30°C pendant 24h. Dés que le lait coagule, on mesure le pH et on note la souche la
plus acidifiante, la moins acidifiante et qui acidifié le lait moyennement.
Dans flacon contenant 100 ml de lait écrémé stérile, on transfère 3ml de lait coagulé
de chaque tube sélectionnés puis on homogénéise.
Le flacon est réparti dans des tubes stériles à raison de 10ml de lait par tube puis en
mis dans l‘incubateur Figure 2.
La quantité d‘acide lactique est calculée après différents temps (2h, 4h, 6h, 8h, 18h
et24h). (Rabah N.,2010) .
L‘acidité est déterminée par la formule :
Acidité (°D) = V NaOH x 10
V NaOH: Volume de NaOH utilisé pour titrer l‘acide lactique contenu dans les 10ml de lait.
La mesure de pH est faite directement par le pH-mètre, en plongeant l‘électrode dans
le volume du lait. Le pH a été déterminé à chaque fois qu‘on procède au dosage de l‘acide
lactique
Matériel et méthodes
31
0,1ml 10 ml de lait écrème 30C° / 18h
Culture jeune de 18h
Sur MRS 3ml
100ml de lait écrème
0h 2h 4h 6h 8h 18h 24 h
Figure 2 : Schéma résumant la méthodologie utilisé pour l’étude de Cinétique d’acidité
Résultats et discussion
32
III RESULTATS ET DISCUSSION
A fin d‘étudier le pouvoir protéolytique des bactéries lactiques isolées d‘un produit
laitier fermenté (J‘ben) on a passé par plusieurs tests.
III.1.Mesure de pH
Les résultats de mesure du pH de chaque échantillon montrent que :
a-J‘ben Sallé 5
b- J‘ben avec gout d‘ail 4,5
c –J‘ben avec gout de coriandre 4,7
Ces résultats du pH montrent que le J'ben possède un pH acide, ceci est due à la
production des acides organique qui abaissent le pH (l‘activité acidifiante).
Les différences des valeurs de pH de J‘ben par rapport aux autres produits peuvent être
dues à la méthode de préparation, au type de lait, à la date de préparation ou peuvent être liées
au type d‘alimentation donnée aux animaux (Ouadghiri., 2009).
III.2.Isolement, purification
A partir des 3 échantillons du J‘ben, on a isolé les bactéries lactique sur milieu MRS
et M17 solide.
La purification des souches lactiques isolées par plusieurs repiquages successifs
sur milieu M17et MRS (alternant sur milieux liquide), on a obtenu 27 souches pures du
j‘ben, les colonies sont d‘un aspect (couleur, taille et forme) typique et homogènes, ils ont
été gardées pour la suite de l‘étude (Figure 3 et 4).
Résultats et discussion
33
Figure 3: des colonies des bactéries Figure 4 : des colonies des bactéries
Lactiques sur le milieu MRS lactiques sur le milieu M17
III.3.Pré-identification des souches
Lors de cette étude nous avons identifié les souches isolées à partir du lait de vache par
les procédures phénotypique conventionnelles basées sur les tests morphologiques,
physiologiques et biochimiques.
III.3.1.Caractérisation phénotypique des souches
Ces tests sont effectués pour but de déterminer le genre des souches isolées
III.3.1.1.Étude morphologiques
A/L’aspect macroscopique
- Sur milieu solide
Les cultures obtenues sur les boites de Pétri sont observées à l‘œil nu pour caractériser
la forme, la taille, l‘aspect ainsi que la couleur des colonies (Badis et al., 2006).
Ces colonies sont apparues de petite taille, de forme circulaire ou lenticulaire, avec
une couleur blanchâtre et d‘un pourtour régulier (Figure 5) (Voir le tableau III).
Résultats et discussion
34
Figure 5: L’aspect macroscopique de la souche sur milieu MRS
- Sur milieu liquide
La croissance des bactéries apparaît sous forme de trouble homogène fumeux dans le
milieu MRS liquide, ce trouble est concentré au fon du tube à la recherche des conditions
anaérobiques de ces bactéries. (Kihal, 1996 ; Carr et al, 2002)(Figure 6).
Figure 6: Aspect d’une culture pure dans un milieu liquide
B/L’aspect microscopique
L'étude microscopique est basée sur la coloration de Gram (Figure 7).
Résultats et discussion
35
L‘observation microscopique a révélé que les colonies isolés et purifiés
sont Gram positif, apparaissant sous différentes formes avec différents modes
d‘associations.
Cette observation a montré que les souches étudiées sont des cocci isolés ou en
chainettes.
Les résultats de l‘examen microscopique sont illustrés dans le tableau III.
Figure7: Observations microscopiques des bactéries lactiques avec un grossissement
(G : 10x100)
III.3.2.Production de la catalase
L‘activité catalytique permet la dégradation de l‘eau oxygénée en oxygène et en
eau, par la mise en contact des colonies avec quelques gouttes d‘eau oxygénée (Guiraud,
2003).
Un dégagement gazeux abondant sous forme de mousse, traduit la décomposition
de l‘eau oxygénée sous l‘action de l‘enzyme à tester (Guiraud, 2003).
Toutes les souches lactiques isolées sont à catalase négative car l‘absence de
dégagement gazeux (O2) (Voir le tableau III).
Résultats et discussion
36
III.4.Identification des souches
Après effectuer l‘examen de la recherche de la catalase et la coloration de Gram,
toutes les bactéries Gram positif et catalase négatif sont présumées comme bactéries lactiques
(Kihal, 1996 ; Carr et al, 2002).
Les isolats Gram positif, catalases négatifs sont étudiées pour déterminer leurs
espèces.
III.4.1.Testes physiologique et biochimique
III.4.1.1. Testes physiologique
Les résultats des tests physiologiques sont résumés dans Le tableau III.
Résultats et discussion
37
Tableau III : résultats des tests physiologiques
Tests
Souches
Gram
Catalase
Forme de cellules
Et
Regroupement
Type
fermentaire
Test physiologique et lait de Sherman
Test biochimiques Lait de
Sherman PH Na cl Températures
2
%
3
% 4 9
2
%
4
% 6% 4°C 15°C 37°C
42°C
62°C
Dégradation
de citrate ADH Production de EPS
S8 + - Cocci ; isolé Hétérofermetaire + - + + + - - - + + - - - - -
S9 + - Cocci;
Chaînette Homofermentaire + - + + + - - + + + - - - - -
S10 + - Cocci;
Chaînette Homofermentaire + - + + + + - + + + - - - - -
S13 + - Cocci ; isolé Homofermentaire + - + + + + - + + + - - - - -
S14 + - Cocci;
Chaînette Homofermentaire + - + + + + - + + + - - - - -
S16 + - Couque- isolé Homofermentaire + - + + + + - + + + - - - - -
S17 + - Homofermentaire - - + + + + - + + + - - - - -
S18 + - Cocci ; isolé Homofermentaire / / + + + + + - + + - + - - -
S19 + - Cocci ; isolé Homofermentaire + - + + - - + + + + + - - - -
S21 + - Cocci ; isolé Homofermentaire + - + + + - - - + + - - - - -
S22 + - Cocci ; isolé Homofermentaire / / + - + + + - + + + - - - -
S23 + - Cocci- diplocoque Homofermentaire / / + - + + + - + + + - - - -
S24 + - Cocci- diplocoque Homofermentaire / / + - + + + + + + - - - - -
S27 + - Cocci ; isolé Hétérofermentaire / / - + + + - - + + - + - + -
S28 + - Cocci ; isolé Hétérofermentaire + + / / / / / / / / / / - + -
S29 + - Cocci ; isolé Hétérofermentaire + + + + + + - + + + - - + + -
S116 + - Cocci ;isolé Hétérofermentaire + + + + / / / + + + + - + + -
S128 + - Cocci ;Chaînette +7 Homofermentaire + - + + + + + - + + + + - + -
S129 + - Cocci ;
Chaînette +4 Hétérofermentaire + + + + + + + + + + - - - + -
S132 + - Cocci ;
Chaînette 2à3 Hétérofermentaire + + + + + + - + + + + + - + -
S133 + - Cocci ;
Chaînette 5à7 Homofermentaire + + + + + + - - + + + - - + -
S134 + - Cocci ;
Chaînette 3à5 Homofermentaire + + + + + + - / / / / / - + -
S135 + - Cocci ;
Chaînette >5 Homofermentaire + + - + + + - + + + + + - + -
S143 + - Cocci ;
Chaînette Homofermentaire + + / / / / / / / / / / - + -
S145 + - Cocci ;diploco-que Hétérofermentaire + + - + + + + + + + - + - - -
S146 + - Cocci ;
Chaînette Homofermentaire / / / / / / / / / / / / - - -
S148 + - Cocci ;diploco-que Hétérofermentaire + + - + + + - + + + - - - - -
S149 + - Cocci ;
Chaînette Homofermentaire + + - + + + - - + + - - - - -
Résultats et discussion
38
III.4.1.1.1.Croissance dans les conditions hostiles (en différents température, pH, NaCl).
Ce test est réalisé dans le but de différencier les lactocoques des Entérocoques,
Nous avons remarqué que la majorité des souches testées capable de croitre sur
milieu MRS liquide à pH 4 et 9 (Figure 8).
Pour des concentrations différentes de Na Cl la pluparts des isolas poussent a 2%
et 4% et la moitie pu croitre a 6% de Na Cl (Figure 8).
Tous les souches poussent à température 15C° et 37C°, seulement 13 souches se
multiplier a 4C° et la plut parts des souches sont incapables de se multiplier à
la température 42 ºC à l‘exception de 8 souches Ce qui assure que ces souches
sont mésophiles en générales(Voir le tableau III).
Figure 8: Résultat des tests physiologique (déférents pH et NaCL).
III.4.1.1.2.Thermorisistance
La pluparts des isolats n'ont pas des thermorésistantes sauf 7 souches (après
traitement à 62C° pendant 30 min) (Voir le tableau III).
III.4.1.1.3. Type fermentaire
Ce test permet d'apprécier le type de métabolisme par lequel le substrat carboné est
transformé, il consiste à mettre en évidence la formation de CO2 qui est piégé dans une
cloche de Durham en milieu MRS-BCP glucosé pour les bacilles (Hassaine O, 2013).
Ce test permet de différencier les isolats homolactiques des hétérolactiques après
une incubation à 30°C pendant 24 heures jusqu'à 72 heures (Hassaine O,2013).
Résultats et discussion
39
La plus parts des souches sont homofermentaires qui fermentent le sucre en lactate
sans produire du gaz, et les autres souches sont hétérofermentaires où il y a un dégagement
de gaz qui va poussée la cloche de Durham vers le haut (Figure 9).
Figure 9: Type fermentaire sur milieu MRS liquide glucosé contenant la cloche de
durham.
Les bactéries lactiques homofermentaires comprennent les espèces de lactocoques,
pediocoques, ainsi que certains lactobacilles. Cette voie conduit dans des conditions optimales
de croissance à la production de deux molécules de lactate et deux molécules d‘ATP par
molécule de glucose consommée. (Thompson et al., 1994).
Les bactéries lactiques qui fermentent le glucose en produisant, en plus de l‘acide
lactique, de l‘acétate, de l‘éthanol et du CO2 sont dites hétérofermentaires. Les groupes
principaux de bactéries présentant ce type de métabolisme sont les leuconostoc et certains
lactobacilles. Ces microorganismes sont dépourvus d‘une FBA et le système de transport PTS
(Thompson et al., 1994).
III.4.1.1.4. Test de lait de Sherman
Ce test est basé sur le mode respiratoire des souches ensemencées, Les résultats
de ce test est résumé dans le tableau III.
Résultats et discussion
40
Pour les résultats positives on a obtenus 21 souches qui ont réduit le bleu de
méthylène 1% et 8 souches qui ont réduit le bleu de méthylène 3%, ceci signifie que
ces souches sont des entérocoques, elles vont tirés leurs oxygène depuis le bleu de
méthylène présent dans le lait, donc ce dernier va perdre sa couleur (Figure 10).
Et on a obtenus 8 souches qui ont donné des résultats négatifs pour le bleu de
méthylène 3%, et une seule souche pour le bleu de méthylène 1% ,ceci signifie que
ces souches sont des lactocoques qui sont microaérophiles, elles vont utiliser
une petite quantité d‘oxygène qui ne peut pas changer la couleur du lait donc il
reste bleu (Figure 10).
Figure 10: Le test de lait de Sherman
III.4.1.2. Test biochimique
III.4.1.2.1. Profile fermentaire
Nous avons identifié les bactéries au niveau de l‘espèce et même parfois de la
sous-espèce, en établissant leur profil fermentaire à l‘aide de plaque d‘Eliza (Figure
11).
Donc ce test est utilisé pour but d‘identifié les isolats au niveau de l‘espèce, Seules les
isolats qui on un effet inhibiteur sont identifiées, Les résultats obtenus sont résumés dans le
tableau IV.
Résultats et discussion
41
Figure 11 : Le profil fermentaires des isolats effectué sur microplaque.
Couleur jaune dégradation du sucre. Couleur bleue résultat négatif.
Tableau IV: Profil fermentaire des souches isolées.
les sucres
Les souches
tréh
alo
se
Su
cro
se
rha
mn
ose
xy
lose
ma
lto
se
glu
cose
lact
ose
Sa
cch
aro
se
ara
bin
ose
So
rbit
ole
Souches identifié
Souche 8 + + + _ _ + _ _ _ + Leuconostoc mesonteroide
Souche 9 + + + + _ _ _ _ + + Lactococcus lactis subsp lactis
Souche 10 + + _ + _ _ _ _ + + Lactococcus lactis subsp lactis
Souche 13 _ + _ +/- +/- _ _ _ + _ Lactococcus crémoris
Souche 14 + + +/- +/- + + + + + _ Lactococcus raffinolactis
Souche 16 + + +/- +/- + + + + + + Lactococcus lactis subsp lactis
Souche 17 + + _ _ + + + + + + Lactococcus lactis subsp lactis
Souche 18 _ + _ _ + + + + + + Lactococcus lactis subsp lactis
Souche 19 _ + _ _ + + + + + + Lactococcus lactis subsp lactis
Souche 21 + + _ _ + + + + + _ Lactococcus raffinolactis
Souche 22 _ + _ _ + + + + + _ Lactococcus lactis subsp lactis
souche 23 _ _ + _ + + + + _ _ Lactococcus lactis subsp lactis
Souche 24 + + _ _ _ _ + _ _ _ Lactococcus lactis subsp lactis
Souche27 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Weissella halotolerans
Souche 28 _ _ _ + _ _ _ + _ _ Entérococcus
Résultats et discussion
42
Souche 29 + + _ + _ _ + _ _ + Entérococcus durans
Souche 116 _ + _ + + _ + _ _ _ Entérococcus durans
Souche 127 _ _ _ _ _ + _ + _ _ Lactococcus lactis subsp
crémoris
Souche 128 _ + _ _ _ _ _ _ _ _ Pediococcus pentosaceus
Souche 129 _ + _ + _ _ + _ + _ Entérococcus durans
Souche 132 _ + _ _ + _ _ _ _ _ Entérococcus faecuim
Souche 133 _ _ _ _ _ _ _ + _ _ Lactococcus lactis subsp
crémoris
Souche 134 + _ _ _ + + _ _ _ _ Lactococcus lactis subsp
crémoris
Souche 135 _ _ + + + + _ _ _ + Lactococcus lactis subsp
crémoris
Souche 145 _ _ _ _ + + + + _ + Leuconostoc lactis
Souche 146 _ _ _ _ _ _ + + _ + Entérococcus durans
Souche 148 _ _ + + _ _ _ + _ + Lactococcus lactis subsp lactis
Souche 149 _ _ _ _ _ + _ _ + + Lactococcus lactis subsp lactis
Le virage de couleur de milieu M16BCP indique que les souches ont dégradé la
pluparts des sucres ajouté dans le milieu Figure 11.
Le profil fermentaire des sucres nous a permis de confirmer la pré-identification de
nos isolats en se basant sur des donnés bibliographiques établis par ( Carr et
al., 2002 et Khedid et al, (2006)).
III.4.1.3. Tests technologiques
III.4.1.3.1. Test de citrate
Le milieu KMK différencié entre les bactéries qui utilisent le citrate pour donner des
produits aromatiques et les bactéries qui n‘utilisent pas le citrate. Dans le premier cas les
résultats se manifestent par des colonies de couleur bleus contrairement les résultats négatif
donnent des colonies de couleur blanche (Figure 12).
Sur milieu KMK (1980) qui est utilisé pour savoir le pouvoir des bactéries de
dégrader le citrate, ce dernier qui se trouve en faible concentration dans le lait mais il est
constitue néanmoins une substance clé dans l‘élaboration des produits laitiers
fermentés (François, 1986 ; Sanchez et al, 2005).
Les souches capables de fermenter le citrate permettant la réaction entre l‘ion
Résultats et discussion
43
ferrique et le potassium ferricyanide de cette façon résulte la formation des colonies
bleues, et ces les cas pour les souches : S29et S106, contrairement pour les autres souches
qui ne dégradent pas le citrate cette perte de la capacité d‘utiliser le citrate est peut être due
à une perte de plasmide codant pour le citrate permease (Kihal et al, 1996) (résultats dans le
tableau III).
Figure 12: Résultat de la dégradation de citrate sur milieu KMK
III.4.1.3.2. La production de dextrane
Milieu MSE est utilisé pour détectée La production des exopolysaccharides (la
formation de colonies gluantes).
La production de exopolysaccharides sur milieu saccharosé MSE est un critère
important pour différencier entre les espèces de bactéries lactiques (Kheddid et al, 2006).
D‘après ce test on a obtenue des résultats négatifs pour touts les souches lactiques qui
sont incapables de produire les exopolysaccharides ceci inhiber la croissance des colonies
visqueuse, gluante (résultats dans le tableau III) (Figure 13).
Résultats et discussion
44
Figure 13: Test de production des exopolysaccharides ( dextrane)
III.4.1.3.3. Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH)
Sur M16BCP on observe que la majorité des isolats n‘ont pas la capacité à
hydrolyser l‘arginine, car ne possèdent pas l‘ADH (arginine déhydrolase) (Kheddid et
al., 2006), ceci signifié que Les bactéries lactiques utilisent le lactose en acidifiant le
milieu, les colonies donnant ainsi une coloration jaunâtre (Figure 14).
Et les autres isolats sont capables d‘utiliser l‘arginine et ré-alcalinisent le milieu,
leurs colonies apparaissent blanchâtres. La couleur de l‘indicateur de pH demeure inchangée
(mauve) (résultats dans le tableau III).
Résultats et discussion
45
Figure 14: Résultat du test d’hydrolyse de l’arginine
III.5. Étude de l’activité protéolytique des isolats
La protéolyse catalysée par les enzymes bactériennes est un des événements
biochimiques essentiels de la maturation du fromage (Muyncka et al. , 2004).
L'hydrolyse des caséines du lait modifie la texture de la pate et les acides amines
et peptides liberes sont précurseurs des composes responsables de l'arome des fromages.
L'activité protéolytique est également une caractéristique technologique
importante chez les bactéries lactiques puisqu'elle leurs confère la capacité de croître
efficacement dans le lait( Maghnia.D.,2011). ce milieu étant déficient en sources azotées
disponibles.
L‘activité protéolytique des souches isolées a été traduite par la présence d‘un
halo claire d‘hydrolyse de la protéine du lait (caséine) sur boite de MRS
additionnée de lait écrémé à des concentrations de 1% et 2%( Maghnia. D., 2011),
Les résultats sont montrés que après l‘identification des 27 souches, nous avons
obtenu 16 souches protéolytiques, 13 isolées à partir de milieu MRS et 3 souches isolées à
partir de milieu M17 (Figure 15) et parmis les souches qui n‘sont pas protéolytiques ont sites
Leuconostoc mesonteroide et Weissella halotolerans .
Résultats et discussion
46
Les genres Lactococcus, Lactobacillus composant la flore des ferments
lactiques possèdent des systemes de degradations des proteines qui contribuent grandement a
la protéolyse du fromage (Zeppa et al 2001).
Nos résultats ont révélés que tous les souches isolées (Lactococcus lactis subsp
lactis , Lactococcus crémoris, Lactococcus raffinolactis, Entérococcus, Entérococcus durans,
Pediococcus pentosaceus) sont à coloration Gram positives et catalase négatives.
Parmis les Lactococcus isolées nous avons remarqués que la pluparts ne se
développent pas en concentration 6% de NaCl.
Notre étude montre la présence des coques et l‘absence des bacilles, dans
les échantillons du lait fermenté traditionnellement (J‘ben) sur 27 souches lactiques
isolées.
On remarque aussi que la plus part des lactocoques isolées apartiennent à l‘espèce
Lactococcus lactis subsp lactis cette especes a été signalé comme majoritaire dans les lait
crus étudier en Algérie (Karam, 1995 ; Rouisset et al., 2006).
L‘activité des enzymes protéolytique est fondamentale, car elle complète l‘action de
la présure restant dans le caillet. La protéolyse due aux bactéries lactiques va surtout
conduire à des précurseurs pour de nombreux produits d‘aromes (Desmazeaud, 1992,
Sanni et al 2002).
Les bactéries lactiques protéolytiques participent donc à l‘amélioration de la
qualité organoleptique du produit fini.
Ces résultats nous permettent de comfirmer d‘une part le caractère
protéolytique ou non des souches isolées et d‘autres parts la présence d‘une protéase
de paroi comme il a été raporté par les travaux de (Desmazeaud, 1992, Sanni et al
2002).
Certaines bactéries lactiques sont capables de produires des composées
d‘aromes qui participent aux qualités organoleptiques des fromages.
Etant donné les éxigences nutritionnelles des bactéries lactiques
Résultats et discussion
47
(Desmazeaud, 1992), ces défférences entre les laits vont avoir des conséquences sur
la croissance et production de métabolites de ces microorganismes dans le lait.
Figure 15: Étude de l’activité protéolytique sur milieu YMA
III.6. Cinétique d'acidité
Parmi les bactéries isolées à partir de J‘ben , on a choisi une souche
protéolytique :
La souche 19 qui est moyennement acidifiante afin de suivre leur cinétique
d‘acidification, le pH a diminué progressivement en fonction du temps (Tableau V).
Par contre le degré Dornic a augmenté à cause de l‘augmentation de l‘acide lactique
présent dans le milieu de culture (Figure 16).
Résultats et discussion
48
Figure 16 : Résultat de la cinétique d'acidité
La production de l‘acide lactique à été suivie en fonction du temps en utilisant la
culture pure de la souche sélectionnée S19, cette activité acidifiante est souvent utilisée
dans le choix de la souche pour l‘industrie alimentaire.
Le suivi de la quantité d‘acide lactique produite et l‘évolution du pH dans les
conditions mésophiles nous a permis de conclure que le temps d‘incubation à influencer
positivement sur le rendement de notre souches. Les résultats sont présentés sous forme
de diagramme (Figure17et 18).
De ces résultats nous avons constaté que la quantité d‘acide lactique produite change
selon le stade de vie de la bactérie cette différence de production peu être expliqué par une
déficience dans le système du transport des substances fermentescibles du milieu vers le
cytoplasme cellulaire. (Albenzino et al, 2001).
Nous remarquons aussi que la production d‘acide lactique par notre souche est
moins importante, on explique ceci par leur métabolisme hétérofermentaire donc la
production d‘autre composé organique tel que l‘acide acétique, le glyceraldehyde,
l‘éthanol et le CO2 plus l‘acide lactique (Kihal et al ,2006).
Résultats et discussion
49
Le suivi du pH montre une diminution progressive pour la souche sélectionnée, cela
s‘explique par plusieurs facteurs le plus important est l‘aptitude de souches a possédé une
activité protéolytique qui est codé par un matériel extra-chromosomique (Juillard et
al, 1998).
TableauV : la variation de pH et de degré Dornic en fonction du temps chez la souche
S19
V: volume de Na OH coulé D°: degré dornic
Figure 17: Variation de pH en fonction du temps chez la souche S19
Souche 19
Ph V D°
0h 6.6 1.3 13
2h 6.57 1.5 15
4h 6.4 1.7 17
6h 6.22 2 20
8h 6.09 2.4 24
18h 5.22 4.7 47
24h 5.17 5.1 51
Résultats et discussion
50
Figure 18: variation de l’acidité exprimée en degrés Dornic en fonction du temps
chez la souche S19
Conclusion
51
Conclusion
Pour prolonger la duré de conservation du lait il est transformé a autres produits
fermentées, cette fermentation qui est due à l‘activité des bactéries lactiques présentent dans
le lait.
Les produits laitiers sont très variées, consomable a cause de leur richesse en matières
nutritives, J‘ben ce produit laitier traditionnel provient d‘une fermentation spontané, préparé à
base du lait cru.
Notre travail est débuté par l‘isolement et la purification de 27 souches à partir de
3 échantillons d u J‘ben préparé au laboratoire àbase du lait cru de vache.
L‘isolement s‘est effectué sur milieux MRS et M17ou on a obtenu des colonies
blanchâtres rondes lisses et de formes lenticulaires de petite taille.
Après la purification des isolats ont subit une identification en utilisant la galerie
biochimique classique les tests effectuer on révélé d‘identifier les espaces suivante :
(Lactococcus lactis subsp lactis ,Lactococcus crémoris, Lactococcus raffinolactis,
Entérococcus, Entérococcus durans, Pediococcus pentosaceus ,Leuconostoc mesonteroide
et Weissella halotolerans )
Notre étude s‘est ensuite développée autour de ces souches isolées de J‘ben en
examinant certains caractéristiques d‘intérêt technologique afin d‘évaluer leurs potentiels
pour un éventuel usage industriel. Dans cette partie, nous nous sommes intéressés
spécialement à leur activité acidifiante, l‘activité protéolytique (Omar hassaine ,2013).
L‘activité protéolytique des souches isolées a été traduite par la présence d‘un
halo claire d‘hydrolyse de la protéine du lait (caséine) sur milieu Y M A , On a
obtenu 16 souches protéolytiques( qui appartienne au espèces : Lactococcus lactis subsp
lactis , Lactococcus crémoris, Lactococcus raffinolactis, Entérococcus, Entérococcus
durans, Pediococcus pentosaceus),ainsi elles ont la capacité de produire des substances
aromatiques ce qui leur donne un intérêt technologique dans la fabrication des différents
fromages. (Hassaine O .,2013)
Perspective
Identification moléculaire est très essentielle pour mieux identifier les isolats ;
Caractérisation physico-chimique partielle de l‘activité protéolytique ;
Dosage de l‘activité protéolytique.
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51 p.
Annexes
Annexe1 : les étapes de préparation du J’ben
I.1.1.1. la maturation
On a incubé lait cru à température ambiante pendant un temps variable de façon à
favoriser la multiplication d‘une flore lactique qui va jouer un rôle important dans
l‘acidification du lait.
Cette maturation a été accélère par adjonction de levains.
I.1.1.2. La coagulation
Cette opération qui vise à coaguler le lait au moyen de la présure (emprésurarge) ou de
toute autre enzyme coagulante. L‘activité coagulante est déterminée par la force de
présure, la température du lait et son acidité. Après l‘emprésurage, le lait est abandonné au
repos à température ambiante pendant 6 à 10 heures. Il va prendre en masse (caillage) avec
une consistance plus ou emoins ferme selon le degré d‘acidité développé.
I.1.1.3. L’égouttage
Se fait a l‘aide d‘un tissu très fin pendant 24 heurs, il permet l‘élimination de la plus
grande partie du sérum qui imprègne le coagulum. L‘égouttage est amorcé dans des
moules qui confèrent au fromage sa forme.
Annexes
Annexe 2 : Milieux de culture
Milieu MRS (Man Rogosa et Sharpe, 1960)
Extrait de levure 5 g
Extrait de viande 10 g
Polypeptone 10 g
Citrate de sodium 2 g
Acétate de sodium 5 g
Glucose 20 g
KH2PO4 2 g
MgSO4 0,25g
MnSO4 0,05 g
Agar-Agar 15 g
Eau distillée 1000 ml
pH 6.2
Autoclavage 120°C/ 20 minutes
Milieu MSE (Mayeux, Sandine et Elliker, 1962)
Tryptone 20 g
Gélatine 2.5 g
Extrait de levure 5 g
Saccharose 100 g
Glucose 5 g
Citrate de sodium 1 g
Azide de sodium 0.075 g
Agar-Agar 15 g
Eau distillée 1000 ml
pH 6,8
Autoclavage 120°C/ 20 minutes
Annexes
Milieu KMK (Kempler et Mc Kay, 1980)
Extrait de levure 3 g
Biopolytone 2,5g
Glucose 5 g
Agar 15 g
Eau distillée 1000 ml
pH 6.6
Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 15 minutes à 121°C.
Au moment de l‘emploi on ajoute :
1 ml d‘une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v)
1 ml d‘une solution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p)
Ces solutions sont stérilisées par filtration sur filtre millipore 0.22 μm et sont
conservées à l‘obscurité à 4°C.
Milieu M16 BCP (Thomas, 1973)
Extrait de levure 2,5 g
Extrait de viande 5 g
Peptone 10 g
Acide ascorbique 0,5 g
Lactose 2 g
L-arginine 4 g
Pourpre de Bromocrésol 0,05 g
Agar-Agar 15 g
Eau distillée 1000 ml
pH 6,8
Autoclavage 120°C pendant 20 minutes
Milieu MRS BCP
MRS (milieu liquide) moins l‘extrait de viande et sans sucre
1000 ml
Bromocrésol pourpre 0,025 mg
pH 7.0
Autoclavage 120°C/ 20 minutes
Annexes
Lait écrémé
Lait en poudre 110 g
Eau distillée 1000 ml
Extrait de levure 3g
Autoclavage 110°C pendant 10 minutes
Eau Physiologique
Chlorure de sodium 8,5 g
Peptone 0,5 g
Eau distillée 1000 ml
pH 7,0
Autoclavage 120°C pendant 20 minutes.
le milieu YMA :
On a prépare le milieu MRS à part et l‘ait écrémé à part et par la suit on
1% 90ml de MRS +10ml de l‘ait écrémé.
2% 80ml de MRS +20ml de l‘ait écrémé.
Annexes
Annexe 3: Coloration de Gram
1- Déposer une goutte d‗eau physiologique stérile sur une lame bien propre
2- Prélever un échantillon de colonie et mélanger avec la goutte d‗eau, strier et sécher
par passage rapide sur la flamme d‗un bec benzène
3- Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes
4- Laver l‗excès du colorant avec de l‗eau distillée
5- Couvrir de lugol pendant 30 secondes
6- Laver à l‗eau distillée pendant 5 secondes
7- Rincer immédiatement le frottis avec le mélange alcool - acétone en inclinant la
lame et par goutte à goutte jusqu‗à disparition complète de la coloration violette
8- Laver à l‗eau distillée pendant 5 secondes
9- Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes
10- Laver à l‗eau distillée pendant 10 secondes
11- Déposer une goutte d‗huile à immersion sur le frottis et observer au microscope à un
fort grossissement.
Les cellules Gram+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues violettes
en apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement rosâtres.
Résumé
Nous avons isolé et purifié 27 souches à partir de 3 échantillons d‘un produit laitière fermenté traditionnel (J‘ben) à
base de lait de vache cru collecté à partir d‘une ferme à hassi sidi benaballah(une portion seulement salée ;la 2éme
portions additionné par l‘ail, la 3éme portions additionné par coriandre).
L‘identification phénotypique des isolats a été assurée en utilisant des méthodes classiques de microbiologie
ou on a pu identifier les genres suivants : (Lactococcus lactis subsp lactis ,Lactococcus crémoris, Lactococcus
raffinolactis, Entérococcus, Entérococcus durans, Pediococcus pentosaceus ,Leuconostoc mesonteroide et Weissella
halotolerans )
Nous avons par la suite examiné chez ces souches certaines caractéristiques d‘intérêts technologiques afin
d‘évaluer leurs potentiels pour un éventuel usage industriel. Nous nous sommes intéressés spécialement à
l‘évaluation de l‘activité acidifiante, l‘activité protéolytique, cette dernière qui a été mis en évidant sur milieu YMA
.les résultats obtenu montre 16 souches ont la capacité de dégradé la caséine du lait contenant dans le milieu .ces caractère
qui ont un intérêt essentiel dans l‘industrie fromagère.
Mots clé : Bactéries lactiques, J‘ben, identification phénotypique, caractères technologique, protéolyse, pouvoir acidifiant.
Abstract
We isolated and purified stem 27 from 3 samples of a traditional fermented dairy product
( J'ben ) from raw cow milk collected from a farm in Hassi Sidi benaballah ( salted only a portion; the 2nd portions added
by garlic, 3rd servings supplemented by coriander) .
Phenotypic identification of isolates was assured using conventional microbiology methods or have been identified the
following genres: (Lactococcus lactis subsp lactis ,Lactococcus crémoris, Lactococcus raffinolactis, Entérococcus,
Entérococcus durans, Pediococcus pentosaceus ,Leuconostoc mesonteroide et Weissella halotolerans )
We subsequently examined in these strains of technological interest some features to assess their potential for possible
industrial use. We looked specifically at the evaluation of the acidification activity , proteolytic activity , the latter which
was set by recessing on YMA medium .the shows results obtained 16 strains have the capacity gradient milk casein
containing in the middle .ces character have a vital interest in the cheese industry.
Keywords:Lactic acid bacteria, J'ben , phenotypic identification, technological character , proteolysis , acidifying power .
ملخص
ي حهب انبقش انطاصج انت تى خؼها ي يضسػت ف حاس ب ػبذ هللا ( خب ) ػاث ي اندب انتقهذي 3 سالنت ي 27تى ػضل و تقت
(ػت يهحت فقظ ، و انثات يضاف نها انثىو و انثانثت انكضبشة )
: و أكذ تحذذ خصائص انؼضالث باستخذاو طشق ػهى األحاء انذققت انتقهذت و تى تحذذ االخاط انتانت
(Lactococcus lactis subsp lactis ,Lactococcus crémoris, Lactococcus raffinolactis, Entérococcus,
Entérococcus durans, Pediococcus pentosaceus ,Leuconostoc mesonteroide et Weissella halotolerans )
تى دساست هز انسالالث راث ي احت االهت انتكىنىخت نتقى قذساتهى نالستخذاو ف اندال انصاػ و دانك بتقى انشاط تحض ،
سالالث نذها قذسة 16تذل ػهى انتائح انت تحصها ػهها ا . YMAانشاط انتحهم انبشوت ، وهزا األخش انزي تى ػهى وسظ انضسع
. هذ انخاصت نها اهت حىت ف صاػت اندب. ػهى تحهم اكاص انحهب ف انىسظ
.قىة انحىضت ، وتحذذ انظهشي ، وانطابغ انتكىنىخ، و انتحهم انبشوت ، خببكتشا حض انالكتك ، : الكلمات المفتاحية