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M~decine et Maladies Infectieuses 1984 -- 14 -- Numero hors s6rie -- 205 ~ 210

Toxicologie de la reproduction :

cas particulier des antibiotiques

par J. STADLER* , J. PERRAUD* et J.M. FACCINI * *

RESUME Apr~s un rappel des diff~rents protocoles d'~tudes et des exigences le)gales en la mati~re, les problemes particuliers d'adaptat ion de ces cl i f f ,rents protocoles ~ I'~valuation du risque avec les antibiotiques sont exposes ainsi que les solutions que I'on peut y apporter.

Mots clef :

Toxicologie de ta Reproduction - Animaux de laboratoire - Ant ib iot iques - Protocoles d'[:tude.

L'6valuation des effets ind~sirables sur I'en- semble du processus de reproduction et sur celui du d~veloppement jusqu'& I'~ge adulte fait partie des essais d'innocuit~ toxicologique de m~dicaments nouveaux. Les protocoles de ces essais sont conformes aux r~glementations ou recommandations en vigueur dans le monde. Cette 6valuation est particulierement n6cessaire Iorsqu'il s'agit de nouveaux antibiotiques, ceux-ci faisant partie des m~dicaments les plus prescrits aussi bien chez un adulte en ~ge de procr6er, que chez la femme enceinte ou I'enfant jusqu'~ I'adolescence.

Depuis I ' introduction des premieres p6nicillines dans I'arsenal th6rapeutique, une mult i tude de pu- blications est parue mettant en cause, ou ~ I'inverse, innocentant, I'usage des antibiotiques en particulier pendant les premiers et derniers tiers de la grossesse et chez le jeune enfant (1, 2, 15). C'est pourquoi, apr~s avoir examin~ les diff6- rentes recommandations 16gales, nous essaierons d'expliquer comment on peut actuellement adapter I'~tude de I'~valuation du {{risque t6ratogene>), au sens large, des nouveaux antibiotiques en essayant d'apporter au clinicien un maximL~m d' informations qui I'aideront dans ses choix.

* Laboratoires Pfizer, Centre de Recherche, B.P. 109, F-37400 Amboise.

* * Les Oules, F-37150, Francueii.

RECOMMANDATIONS OFFICIELLES

On peut distinguer trois ~tapes dans 1'6valuation des risques en toxicologie de la reproduct ion: - I ' e f f e t direct sur la fertil it6 parentale et ses

consequences tant sur le d~veloppement in-ut6ro que p~ri et post-natal de ta descendance,

- I ' e f f e t t~ratogene proprement dit, c'est-&-dire I'apparition de malformations li6es ~ un traitement de la femelle gestante pendant I'organo- genese,

- I ' e f f e t sur le d~veloppement p6ri et post-natal, via le lait maternel. Ce dernier type d'6tude a donn~ naissance ~ une discipline nouvelle : la t~ratologie du comportement (behavioral tera- tology).

Comme il est inenvisageable d'exposer dans le d~tail la totalit~ des exigences I~gales pour les trois types d'6tudes, un r6sum6 en est fait dans les tableaux I, II et I11.

Lorsqu'un laboratoire pharmaceutique a l'inten- tion de commercialiser un nouveau m6dicament, il est Iogique que son dossier pr6clinique soit consti- tu~ d'~tudes sur I'animal de laboratoire conformes aux protocoles les plus s6v~res de facon ~ r6pondre aux souhaits d'un maximum de pays. Aussi se sont cr~s des protocoles hybrides prenant en compte les recommandations de divers pays.

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T A B L E A U I - Etudes sur la fer t i l i t6 parentale , Exemples de recommandat ions internat ionales

Esp~ce Nbre an imaux P6riode de t ra i tement Observations

F.D.A.* Rat ~ 1 0 m~les/ m~les : 2 mois avant accou- -- crit~res de fertilit(~ des deux sexes groupe plement. -- sacrifice interm~liaire d'une partie des femelles (dvaluation

20 femelles/ femelles : 2 semaines prdc6- de I 'effet embryotoxique). groupe dant I'accouplement et en- -- travail et mise-bas.

suite t o u s l e s jours (?). -- survie, dvolution ponddraledes jeunes. --tests (rdflexes, comportement) pendant la lactation et au sewage.

C.S.M.** Rat ~ 1 2 m~11es/ m~les : 2 mois avant accou- groupe et plement.

24 femelles/ femelles : 2 semaines prdc~- groupe dant I'accouplement et

toute la gestation.

JAPON Rongeur ~ 20/sexe/dose. (1983)

FRANCE

femelles : 2 semaines avant I'accouplement jusqu'au 6e jour de gestation. mSles : au moins 60 jours avant accouplement.

- - crit~res de fert i l i td des deux sexes. - - sacrifice intermddiaire d'une partie des femelles (6valuation de I 'effet foetotoxique). -- travail et misa-bas. - - survie, 6volution ponddrale des jeunes. - - dvaluation du comportement au sevrage. - - 2e gdndration.

-- sacrifice des femelles en f in de gestion ; examens morpho- Iogiques des f~etus vivants. - - autopsie des m~les et femelles ((stdriles)).

((Si les r~sultats des autres exp6rimentations effectu~es laissent apparaTtre des dl~ments de nature ~ faire soup~onner des altd- rations dans la f6condit6 m~11e ou femelle, cette derni~re devra ~tre contrOl~e de mani~,re addquate)).

* Food and Drug Administration (USA). * * Committee of Safety of Medicine (G.B.).

T A B L E A U I I I - - I~tudes peri et post-natales, Exemples de recommandat ions internat ionales

Esp~ce Nbre de femelles P6riode de t ra i tement Observat ions

F.D.A.*

C.S.M.**

A.B.P.I. rat

P.M.A.*** rat

JAPON rongeur ou lapin

rat ~ 20 par dose. dernier tiers de la gestation -I-toute la lactation.

rat 24 par dose. de la f in de I'organog~nesa la f in de la lactation.

~ 1 2 par dose. jour 17 de la gestation au sewage.

? idem F.D~A.

20 par dose de la f in de I'organog6n~sa jusqu'au sewage.

- - travail et mise-bas ; taille des port~Ses ; - - possibilit~ d'effectuer desiadoption s crois6es, - - une partie des jeunes doi~ ~tre ~lev~e jusqu'~ 1'Sge adulte.

- - travail et mise-bas ; - - examen des jeunes au sev~age, - - d a n s certains cas (?) les~petits doivent ~tre ~lev~s jusqu'& I'~ge adulte, accoupl~s et leur descendance examin6e.

-- t ravai l et mise-bas, ~volution pond~rale et comportement (vision et audit ion en particulier) -- survie, autopsie de tousles jeunes au savrage. j ,

Idem F.D.A. "~ ~'traitement des jeunes sevr6s jusqu'~ l'~ge adulte.

- - travail et mise-bas ;: - - d6veloppement et comportement des jeunes ; - si n6cessaire, 2e g6n6ration.

* Food and Drug Administration (USA) * * Committee of Safety of Medicine (G.B.) * * * Commission Am~ricaine charg~e des m~dicaments ~ usage p6diatrique

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T A B L E A U I I -- R~glementations internationales relatives aux 6tudes de fcetotoxicit6

Esp~ces Nombre d'animaux Dose P(~riode de trai tement Voie d'administration

A U S T R A L I E -- pr~sentant un m~ta- 10 femelles gestantes Dose maximale Chaque jour de I'orga- P.O. ou perent6rale. bolisme similaire & par groupe. Idthale pour le nog6n(~se. I 'homme. foetus. -- 2 types diff~rents de mammif~res.

C A N A D A -- 1 rongeur : souris, 20 femelles par dose. 3 doses -t- 2 t~- 3 types : m~me voie que celle (1975) rat, hamster, moins, dose -- certains jours, pr6sum6e en th6rapeu-

-- 1 non rongeur : lapin, 15 femelles par dose. maximale t~rato- - - t o u t e la gestation, t ique humaine. chien, chat. g~ne. - -avant et pendant la

gestation.

JAPON -- 1 rongeur : rat, souris 30 rongeurs, plusieurs doses Tous les jours de I'or- m~me voie que celle (1975) -- 1 non rongeur : lapin. dont la dose ganog~n~se, pr~sum~e en th~rapeu- r6vis~ 1983 maximale tol~r~e t ique humaine.

NORVEGE -- 1 esp~ce pour la- selon les profi ls Organog~n~se Idem quelle la Thal idomide toxicologiques et souris : 5-16 produit des malforma- pharmacologi- rat :5-16 tions. ~ ques. Dose maxi- lapin : 6-18 -- 1 autre esp~ce (rat male :dose maxi- ou ou souris), male tol~r6e, toute la gestation.

SUEDE rat ou souris et lapin. 10 femelles gestantes 1 t6moin -I- 3 rat :6-15 (1974) par groupe, doses, souris : 6-12

lapin : 6-18

Pas en I.P.

R.F.A. et rat ou souris, lap in ou C.E.E. un autre non rongeur.

~La m~thodologie dol t ~tre en accord avec les moment de la soumission du dossier)).

degr~s les plus 61eves de I'expertise scientif ique au

F.D.A.* souris ou rat et lapin, au moins 20 rongeurs et au moins 3 do- rat : 6-15 voie pr~sum~e pour 1973 ~ 20 lapins/dose, ses. Dose maxi- souris : 6-15 I'usage th~rapeutique.

male tox ique, lapin :6-18 Sauf : la voie I.P.

OMS 1 rongeur suffisant pour analyses 1 t~moin -[-3 do- organogdn~se 1967/1975 1 non rongeur statistiques, ses. Dose maxi-

male : au moins la dose efficace. Dose maximale: dose maximale tol~r~e.

voie pr(~sum~e pour I'usage th~rapeutique.

C.S.M.** 2espdces au moins 12 femelles 3 doses. Dose (1974) 1 rongeur gestantes par dose. maximale : tox i -

1 non rongeur cit6 minimale chez la mdre.

orga nog6n~se idem

A .B .P . I . * * * 2 mammif~res dont 1 3 doses -I- t~- non rongeur, moins. Dose

maximale : tox i - que.

organog~nOse idem

FRANCE 2 esp~ces au moins. La- (1972) pin et rat ou souris.

Les modalit6s de I'exp6rience seront d(}termin~es en tenant compte de I '~tat des connaissances scientifiques au moment du d6p6t du dossier et de la signification statistique que les r~sultats doivent atteindre.

* Food and Drug Administrat ion (USA) * * Commit tee of Safety of Medicine (G.B.) * * * Association of British Pharmaceutical Industry.

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Une dtude dite de fertil itd se ddroulera chez le rat. Les m~les reproducteurs seront traitds 60 80 jours avant I'accouplement afin d'etre exposds aux effets du produit pendant plus d'un cycle de spermatogdn~se, voire deux. Les femelles, quant

elles, seront traitdes deux semaines avant I'accouplement, soit au moins trois cycles cestraux. Les animaux seront ensuite accouplds au sein des m~mes doses, le traitement dtant poursuivi au moins pour les femelles pendant cette pdriode. Au cours de la gestation, les femelles continueront

~tre traitdes, ceci afin de maximiser le risque d'exposition. Les mises-bas seront enregistrdes et la durde de gestation calculde avec la plus grande prd- cision possible. Une partie des femelles gestantes aura subi une hystdrectomie en cours de gestation pour d6celer en particulier I'embryoldthalitd ~ventuelle. Apr~s la naissance, la croissance, la survie et parf0is m~me le ddveloppement neuro- musculaire des jeunes seront dvaluds. Dans le cas le plus complexe, ces jeunes seront dlevds jusqu'~ maturitd se×uelle et accouplds & leur tour pour ddterminer si le traitement parental n'a pas inhibd le ddveloppement sexuel de la descendance.

Une ~tude de t6ratog~ne, ou de f~etotoxicitd, se ddroulera chez deux ou trois esp~ces dont une non- rongeur. Les femelles seront traitdes pendant toute I'organogdn~se et subiront une hystdrectomie en fin de gestation afin, d'une part, d'dtudier le pouvoir Idthal du produit et d'autre part, son pouvoir tdratog~ne. Seront donc ddnombrds les corps jaunes, les sites d'implantations, les embryons rdsorbds, les feetus vivants et morts, leur sexe et leur poids. Ces foetus seront examinds pour dd- tecter les anomalies externes, squelettiques et viscdrales.

Une dtude pdri et post-natale se ddroulera chez une seule esp~ce, le plus souvent le rat. Les femelles gestantes seront traitdes de la fin de I'organogdn~se jusqu'au sevrage de leurs pet i ts . Lb encore on pr~tera attention au ddroulement de la mise-bas. La survie et le ddveloppement des jeunes seront suivis encore plus prdcisdment que dans les dtudes de fertil itd. II est obligatoire de porter un soin tout particulier b I'observation des repbres ((clds>) du ddveloppement tels que I'apparition du rdflexe de retournement sur surface plane, du rdflexe d'agrippement, I'ouverture des yeux et des conduits auditifs, la pousse des poils, I'apparition des incisives, etc... II faut aussi mesurer I'impact de I'exposition au produit via le lait maternel sur I'olfaction, la vision, I'audition et le comportement des jeunes.

Ces dtudes sont toutes rdalisdes avec au moins trois groupes d'animaux traitds par la vole envi- sagde pour la thdrapeutique humaine et un groupe d'animaux tdmoins recevant le vdhicule dans les mdmes conditions. Chacun des groupes comporte un minimum de 10 ~ 12 femelles gestantes au jour de I 'hystdrectomie-ou de la mise-bas. A titre d'exemple, une dtude de fcetotoxicitd comprendra quatre-vingt femeiles rdparties sur quatre groupes expdrimentaux, ce qui entrainera I'examen d'au moins 400 foetus dans I'hypothdse la plus pessi- miste. Une dtude de ((fertilitd)) pourra impliquer 80 m~les et jusqu'~ 240 femelles ce qui permettra d'observer au moins 2 400 descendants de pre- miere gdndration...

APPLICATION A L'I~TUDE DES ANTIBIOTIQUES

L'application stricte de ces protocoles types I'dvaluation du risque gdndrd par un traitement antibiotique est rendue difficile par deux sortes de probldmes : ceux lids aux animaux de laboratoire couramment utilisds, et ceux lids ~ la toxicitd spdcifique de certains antibiotiques.

Les probldmes inhdrants aux animaux de laboratoire utilisds. L'exemple le plus~courant est celui du lapin. C'est I'animal de choix comme deuxi~me esp~ce (non-rongeur) pour les dtudes de fcetoto×i- citd. Dans le cas de I'dtude des effets adverses des antibiotiques, il s'av~re malheureusement inutili- sable dans une dtude cla~sique • un antibiotique, administrd le plus souvent par voie orale, et pendant toute I'organogdndse va ddtruire la flore cecale de faqon presque'immddiate ce qui va en- trainer soit la mort en quelques jours, soit une mortalitd embryonnaire quasi totale par carence. Bien que les mdcanismes en cause soient diffdrents, ce type d'effet pourrait apparaitre dans d'autres esp~ces pour peu qu~'les doses administrdes soient assez fortes. Les dtudes se trouvent donc invaliddes. Nous serons amends ~lans un tel cas, soit & choisir une autre esp~ce non rongeur, soit ~ modifier le protocole d'dtude. Travailler sur une autre esp~ce est toujours possible (primate, mini porc ou porc fermier, chien, chat, etc...) mais d'autres probl~mes apparaissent alors: dtude beaucoup plus Iongue, coQt tr~,s dlevd, prolificitd moindre, etc...

Ne reste alors que la possibilit6 de modifier le protocole d'dtude : il est admis par les autoritds que dans une telle situation on puisse administrer le produit ~ tester en sdquences courtes et succes-

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sives (un & trois jours) pendant I'organog6n~se plusieurs sous-groupes de femelles par dose ~tudier. On pourrait ainsi (<couvrir>> toute la p~- riode critique en minimisant le risque de toxicit~ maternelle ((parasite>>. II faut noter, par ailleurs, que cette technique du traitement s~quentiel est couramment utilis~e pour d~terminer la phase la plus sensible de I'organog~n~se & un t~ratog~ne quelconque, et ce, quel que soit I'animal utilis~.

L e s p r o b l ~ m e s i n h d r a n t s a u x f a m i l i e s d ' a n t i -

b i o t i q u e s utilisds. Comme il a ddj~ 6td dit plus haut, certaines classes d'antibiotiques sont recon- nues ou suspect~es responsables de I'apparition d'anomalies mineures ou majeures chez I'enfant. - L e s t6tracyclines entralnent une pigmentation des dents et une hypoplasie de I'dmail ainsi que des retards de croissance, voire mSme des anomalies de d~veloppement des os longs. - Depuis 1948, des cas de surdit~ chez des enfants n~s de m~res trait~es ~ la streptomycine ont ~t~ rapport~s. La kanamycine a, elle aussi, dt~ souvent mise en cause dans ce m~me groupe d'antibiotiques. - O n pourrait encore citer les exemples de la pdnicilline, de I'~rythomycine, du chloramphd- nicol, du PAS, de I'isoniazide, etc.., qui malgrd les rdsultats d'enqu~tes dpid~miologiques assez r6- centes, restent plus ou moins suspects. Si les r6sul- tats sont contradictoires chez I'homme, ils ne le sont pas moins dans les diff~rentes espdces ani- males les plus frdquemment utilis~es (tableau IV).

T A B L E A U IV

Aper(;u des effets t0ratog~nes de quelques antibiotiques chez I 'animal de labora to i re (d'apr~s Schardein, 1976)

Antibiotique Souris Rat Lapin Autres

A m p i c i l l i n e - - - -

P~n ic i l l i ne - - + , - - - - - ( s i n g e )

Cephalosporine -- -- - -

C h l o r a m p h e n i c o l - - -{-, - - - - - - ( s i n g e )

C h l o r t e t r a c y c l i n e -- -- Dihydrostreptomycine -I- --(cobaye) Doxycycline . . . . (singe)

Erythromycine -{-, - -

K a n a m y c i n e - - - - - - ( s inge ) Jc~cobaye)

Lividomycine Jr - Minocycline -{- -~- --(chien)

- - ( s inge )

- - -~chien) --(cobaye)

-- -I-(cobaYe)

Oxytetracycline - - -~', - -

S t r e p t o m y c i n e -I- __.

Te t racyc l i ne - - "}', --

Lorsque I'on pr~voit d'~tablir des dossiers pr~- cliniques en toxicologie de la reproduction avec des antibiotiques d~riv~s de ces families ((suspectes)) il est 6vident que I'on doit s'entourer d'un maximum de precautions quelle que soit I'esp~ce sur laquelle on doit travailler et quel que soit le type d'~tude envisag6 il faudra s'assurer, en premier lieu, du passage transplacentraire, de la distribution de la molecule tant chez la m~re que chez le fetus, de la pr6sence d'~ventuels m~tabolites etc... Cette recherche des m~tabolites par esp~ce est particuli~- rement importante, certains pouvant ~tre sp~ci- fiques d'une esp~ce animale et non de I'homme, ou I'inverse. Dans ce dernier cas, I'id~al serait de pouvoir isoler ce m6tabolite et de I'obtenir en quantit~s suffisantes pour le tester chez I'animal. Malheureusement ceci n'est souvent possible qu'~ un stade assez avanc~ du d~veloppement de la molecule et peut remettre en cause plusieurs ann~es de recherche.

Lorsque ces ~tudes pr~iiminaires auront 6t~ effectu6es et que I'on aura par ailleurs suffisam- ment d'informations sur la toxicit~ de la molecule chez I'animal adulte, que I'on aura d6termin~ le ou les organes ou fonctions cibles, on pourra adapter au mieux les protocoles de toxicologie de la reproduction en insistant sur les examens les plus adap- t~s au diagnostic d'une toxicit6 sp6cifique. C'est ainsi qu'avec une tetracycline on pourra effectuer des examens histologiques des bourgeons dentaires, mesurer syst~matiquement la taille des jeunes pendant la lactation et m~me apr~s sevrage ; avec les aminoglycosides on pr~tera une attention toute particuli~re aux probl~,mes d'audition et de nephro- toxicit6, etc...

Dans I'absolu, cette d6marche semble assez simple & r~aliser mais reste entier le probl~me sous- jacent du choix du module experimental. En effet, il est parfois bien difficile de concilier les d~sirs tout & fair justifies des I~gislateurs quant ~ la taille de I'~chantillon, la p~riode de traitement, la voie d'administration, etc.., et ceux, non moins justifies, du toxicologue qui aura connaissance d'un module animal et d'un protocole d'6tude appropri~s ~ la recherche d'une toxicit~ sp~cifique mais n'entrant pas - a priori - d a n s le cadre I~gal. C'est ainsi par exemple, que la kanamycine s'av~re sans effet sur la descendance du singe, du lapin et du rat (15, 16, 17) alors qu'elle entraine une ototoxicit~ chez le jeune cobaye (18), esp~ce peu utilis~e dans les protocoles classiques d'6valuation du risque t~ratog~ne.

•

Le d~veloppement des m~thodes in vitro ~tant tr~,s avanc~, o n peut aussi envisager des 6tudes de

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recherche de m~canismes sur des cultures d'embryons, d'6bauches, voire de cellules. Ces ~tudes, bien que non encore requises par les autorit~s, peuvent ~tre d'un grand secours pour ~tayer nos conclusions. En effet comme il nous sera toujours impossible d'aff irmer qu'un produit ne pr~sente aucune toxicit~ - tout 6tant question de dose, d'espece et de conditions exp~rimentales - notre premier souci est de fournir aux cliniciens le maximum d'informations pr~cises afin qu'ils puissent, en toute connaissance de cause, ~tablir leur th~rapeutique.

CONCLUSION

Si, grace aux recommandations I~gales en mati~re de toxicologie de la reproduction et aux adaptations de ces protocoles d'~tudes pr~-

cliniques, il est possible d'esp~rer cerner les risques potentiels moyens des antibiotiques, il n'en reste pas moins que tous les facteurs de risque li~s I'h6r~dit~, les conditions de vie 6u la sensibilit6 individuelle ne pourront jamais etre ~valu~s dans de telles ~tudes. C'est pourquoi, il nous semble qu'en particulier avec ces types de m~dicaments, la pharmacovigilance doit etre particuli~rement d~- velopp6e pour le b~n~fice du malade qui peut ainsi recevoir une th~rapeutique encore mieux adapt~e ~ son cas particulier.

* "k

S U M M A R Y In a first part, the international requirements or recommendations for reproductive toxicology are ex- posed. In a second part, the adaptation of the protocols to the safety evaluation of new antibiotics are proposed.

Key words :

Reproductive toxico[ogy - Laboratory animals - Antibiotics - Protocols.

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