UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
IZTAPALAPA
C B S
E
Para obtener el grado de
BIOLOGA EXPERIMENTAL
ASESOR Dr. Edmundo Bonilla González
3.
EFECTO DEL ETILEN GLICOL MONOMETIL ETER EN LA VIABILIDAD DE
CULTIVOS DE OVOCITOS IN VITRO
La gametogénesis es el proceso de diferenciación mediante el cual las células
diploides del ovario (ovogénesis) o del testículo (espermatogénesis) se transforman en
células haploides especializadas, ovocitos en la línea femenina, y espermatozoides en la
masculina.
La formación y desarrollo de los gametos se inicia en los mamíferos durante la
embriogénesis temprana, cuando las células germinales primordiales (PGCs) migran hacia
la gónada en formación. La sobrevivencia y migración de las PGCs depende de la
producción local de citokinas, incluyendo al ligando Kit y al factor de crecimiento Dl (Godsen y cols.,l997). Una vez establecidas en el ovario en desarrollo, las PGCs pierden
su capacidad de movimiento y se convierten en ovogonias (en las hembras) o
espermatogonias (en los machos).
El desarrollo temporal de la gametogénesis es diferente en los dos sexos. En el sexo
masculino, la diferenciación se inicia en la etapa prepuberal, y es un proceso continuo en el
que después de la primera oleada meiótica en la pubertad, se mantiene ininterrumpidamente
hasta la vida adulta, y a lo largo de ésta. En las hembras, en cambio, las ovogonias inician
la diferenciación meiótica durante la etapa fetal, progresando sincrónicamente hasta el
estado de diplotena de la profase I, situación que se observa al nacimiento, y que se
mantendrá así hasta la ovulación en la vida adulta (Canipari y cols.,1984).
Tras un periodo de proliferación mitótica, todas las oogonias se diferencian en ovocitos
primarios en el ovario fetal, por lo que las hembras nacen con un número determinado de
ovocitos. Los ovocitos primarios, con un diámetro entre 15-20 pm se encuentran rodeados
por una capa de células foliculares fusiformes dentro de los folículos primordiales. El
crecimiento de los ovocitos no se reanuda hasta la etapa adulta, bajo la influencia de la
1
hormona folículo estimulante (FSH). Los ovocitos alcanzan entre 70 y 100 pm de
diámetro, dependiendo de la especie, y se encuentran rodeados por varias capas de células
de la granulosa. La ovulación de los ovocitos de los foliculos antrales completamente
desarrollados, así como su maduración, se lleva a cabo bajo el estímulo de la hormona
luteinizante (LH) (Eppig., 199 1)
La transformación de las ovogonias en ovocitos primarios está acompañada por cambios
nucleares marcados por la entrada en meiosis. Esta se inicia con la síntesis de DNA y
duplicación de los centrosomas, análoga a la fase S de las células mitóticas. Cada
cromosoma, consiste en dos cromátidas, se aparea con su homólogo, posibilitando el
entrecruzamiento entre las cromátidas de los cromosomas apareados, la recombinación
génica y fundamentalmente, la segregación cromosómica correcta. Después de esta etapa
(paquitena) , los cromosomas que conforman el bivalente comienzan a separarse,
generándose la fase de diplotena. Los ovocitos en diplotena son más grandes que las
oogonias, tienen mayor número de orgánulos citoplásmicos, han llevado la recombinación
génica del DNA de origen paterno y materno, y se caracterizan por la presencia de
cromosomas difusos rodeados por una membrana nuclear intacta, estadio denominado de
vesícula germinal (VG). Los ovocitos quedan detenidos en este estado del desarrollo
alrededor del nacimiento del organismo, y sólo continúan su desarrollo en la pubertad, bajo
el estímulo de LH, que causa la disgregación de la membrana nuclear de los ovocitos y su
entrada en la fase M (proceso denominado maduración). L a cromatina se condensa en
pequeños bivalentes que se segregan a dos núcleos hijos. El citoplasma se divide de forma
muy asimétrica, produciendo dos ovocitos secundarios con tamaño muy diferente; uno es
un pequeño cuerpo polar y el otro es una gran célula con todo el potencial de desarrollo
(ovocito de segundo orden). En este momento la meiosis se detiene nuevamente. Los
ovocitos de segundo orden son ovulados, y la meiosis continúa sólo si éstos son
fertilizados; si es así, las cromátidas hermanas de cada cromosoma se separan y el
citoplasma del ovocito secundario grande se divide de nuevo asimétricamente dando lugar a
un óvu10 maduro, ya fecundado, y a un segundo corpúsculo polar, cada uno con un número
haploide de cromosomas. Los pequeños cuerpos polares posteriormente degeneran.
(figura 1).
2
O v o g é n e s i s
Ovogonias
Periodo Fetal
+ 1 er cuerpo polar
Meiosis I1
1 Cigoto
2" cuerpo polar +
División Mitótica
"""""""_ ....................... 1 1 .- Crecimiento del ovocito primario 2.- Formación de la zona Pelúcida
3
Zona Pelúcida
Fertilización
Los ovocitos en crecimiento presentan niveles de síntesis de RNA elevados, y éstos
disminuyen a valores mínimos durante la maduración de los ovocitos. El almacenamiento
de RNA durante la fase de crecimiento tiene dos funciones. La primera es usar este RNA
en el crecimiento, desarrollo y maduración del propio ovocito. La segunda es utilizarlo
para mantener el desarrollo del zigoto después de la fertilización, hasta que el genoma
embrionario pueda ser expresado (estadio de 2 células en el ratón, de 4 células en el cerdo,
y de 4 a 8 células en el humano) (Picton y cols.,1998).
Interacción entre el ovocito y las células foliculares.
El desarrollo completo del ovocito requiere de la participación de la células somáticas que
lo rodean (células de la granulosa). La comunicaci6n entre el ovocito y éstas células se
lleva a cabo por uniones en poro que se mantienen a lo largo del crecimiento y maduración
del gameto femenino. Al final del periodo de crecimiento folicular el ovocito se encuentra
rodeado de varias capas de células de la granulosa, a las que se les denomina células
cúmulo (Eppig, 1991). Las células de la granulosa proporcionan al ovocito nutrientes
(como piruvato) y precursores metabólicos (aminoácidos y nucleótidos) que además de
permitirle crecer, lo preparan para que pueda concluir la primera división meiótica
(Anderson y Albertini, 1976).
Sin embargo, el ovocito también contribuye en la proliferación, crecimiento y
desarrollo de las células de la granulosa. Se tiene evidencia de que los ovocitos producen
factores que regulan la proliferación, esteroidogénesis, y formación de la matriz
extracelular de las células de la granulosa (Vanderhyden y cols., 1993). Ha sido descrito
que el factor de crecimiento y diferenciación 9 (GDF-9), que se sintetiza sólo en el ovocito,
es esencial para el desarrollo folicular (McGrath y cols., 1995). Similarmente, Zhou y
cols. (1991) detectaron la presencia de transcritos del factor de crecimiento semejante a
insulina IGF-I en ovocitos, y se ha determinado la presencia de receptores para este factor
en células de la granulosa (Balboni y cols., 1987), lo que sugiere la participación del
ovocito en la iniciación del crecimiento folicular.
4
IDENTIFICACI~N DE REPROT~XICOS
La identificación de agentes con efectos deletéreos sobre la reproducción
(reprotóxicos) se basa tanto en estudios en humanos como en animales de laboratorio. En
el primer caso, la información es obtenida de personas laboralmente expuestas de manera
rutinaria o accidental a los agentes potencialmente tóxicos (APTs). En el caso de los
animales de laboratorio, la información es obtenida a partir de exposiciones experimentales
controladas, Evidentemente, lo mejor par la identificación de reprotóxicos es seguir esta
última vía. Para hacer esta evaluación, se parte de los siguientes supuestos:
Un agente que produce un efecto reproductivo adverso en animales de laboratorio
puede tener ese efecto en humanos. Este punto se basa en comparaciones de los datos
obtenidos del efecto de APTs en humanos y en animales de laboratorio
(Kimmel., 1990).
Se asume que una agente que afecta la función reproductiva en un sexo, afectará
también la función reproductiva en el otro sexo. Los mecanismos de daño causados por
este agente, además, serán similares en los sistemas reproductores masculino y
femenino, dada la similitud en los procesos biológicos que se llevan a cabo en machos
y hembras.
En ausencia de información para determinar cuál es la especie animal más apropiada
para evaluar el riesgo reproductivo, se deben usar los datos obtenidos de la especie
animal más sensible, ya que se observado que los humanos son más sensibles que la
mayoría de las especies animales empleadas en los estudios de toxicidad reproductiva
(Working.,l989).
En un análisis cuantitativo para evaluar toxicidad reproductiva, la curva dosis-respuesta
será lineal a partir de un cierto umbral. Esto se basa en el hecho de que las células y
órganos del sistema reproductivo tienen cierta capacidad para evitar o reparar el daño
producido. Frecuentemente se presenta un umbral en las dosis utilizadas, a partir del
cual se produce el daño.
5
IESGO GENOTOXICO DE AGENTES QU~MICOS Y FARMACOL~GICOS EN
A GAMETOGÉNESIS
Durante los últimos años se ha suscitado una preocupación social sobre la salud
zproductiva animal, incluida la humana. La incidencia de tumores gonadales ha
umentado considerablemente, especialmente en países desarrollados con población
iaucásica, y se estima que una de cada cinco parejas es involuntariamente estéril (Nunziata,
,998). Otras anormalidades del sistema reproductor masculino, tales como criptorquidia,
lipospadias y oligospermia, parecen haber aumentado, aunque no tan significativamente
:Skakkebaeck,l998). Carlse y cols. (1 992) observaron en un amplio estudio retrospectivo
que la concentración de espermatozoides por eyaculado en el hombre ha disminuido
1 13 x lo6 por ml, en los años 50, a 66 xl0' m1 en los años siguientes. Se estima que entre
32 y 34 % de los óvulos fertilizados e implantados no llegan a término
(Zinaman y cols 1996), y que aproximadamente 3% de los niños recién nacidos presentan
malformaciones o alguna variación morfológica o bioquímica (Shepard., 1986)
El hecho de que estos cambios en la salud reproductiva hayan ocurrido en un
periodo de tiempo corto, sugiere que pudieran ser causados por la exposición a sustancias
potencialmente tóxicas en el ambiente. Actualmente, hay cerca de 100,000 productos
químicos de uso comercial, y se estima que se generan entre 700 y 1000 nuevos
compuestos anualmente. Alrededor de 1,500 de estos productos químicos tienen un
elevado volumen de producción, que supera las 10,000 toneladas por año (Koeter, 1993).
Estos compuestos pueden afectar los sistemas reproductivos de los individuos expuestos,
pero además pueden producir daño genético que puede ser trasmitido a futuras
generaciones, pudiendo causar infertilidad, malformaciones, abortos espontáneos, etc.
6
Los estudios sobre el riesgo genotóxico de agentes químicos y farmacológicos sobre
las células germinales de mamíferos son escasos, y se llevan a cabo especialmente en los
machos, en los que la diferenciación de espermatogonias a espermatozoides ocurre desde la
etapa prepuberal, y se mantienen interrumpidamente hasta la vida adulta, y a los largo de
ésta. En las hembras, en cambio, la diferenciación de oogonias a ovocitos de primer orden
ocurre en un Único proceso de diferenciación que se desarrolla en la vida fetal, lo que hace
que sea relativamente inaccesible a la manipulación experimental, y que la cantidad de
material biológico disponible para su análisis sea escaso (Canipari y cols., 1984). Por esta
razón, el estudio de la gametogénesis en los mamíferos se ha basado en la
espermatogénesis, existiendo muy pocos trabajos sobre la ovogénesis.
Los ensayos in vivo que se emplean hoy en día para las valoraciones toxicológicas
de los diversos agentes sobre células germinales en manlíferos tienen un costo y duración
considerable, y se necesita de un elevado número de animales de experimentación, por lo
que resultan inviables para evaluar el riesgo genotóxico de los cientos de productos
químicos producidos cada año. Es por esto que en los últimos aííos se ha dado énfasis al
desarrollo de ensayos in vitro. Estos ensayos, además de realizarse en un periodo de
tiempo corto y de requerir de un bajo número de animales de experimentación, permiten
estudiar los mecanismos de acción de los diferentes agentes, consiguiéndose una mejor
valoración toxicológica (Lamb y cols., 1993).
En el presente estudio se estableció el cultivo in Vitro de ovocitos de ratón a partir
de ovarios fetales, y se llevó cabo la valoración toxicológica del EGME.
7
Etilén Glicol Monometil Eter (EGME).
Sinónimos:
0 2-Metoxietanol
0 Metil de celusoven
Peso Molecular: 76.09
H H H I I I
I 1 I H-"-C<-"-C-H
H H H
Este compuesto, así como su ester de acetato (EGMEA) son líquidos altamente
flamables, incoloros, moderadamente volátiles y con muy buenas propiedades de
solubilidad. Utilizados en la fabricación de pinturas, lacas, colorantes, plásticos usados
para envolver alimentos, como sellador, barnices y esmaltes de secado rápido, en la
industria como semiconductor y también se usa como anticongelante en los fluidos
hidráulicos y combustibles del motor de reacción. EGME y EGMEA es rápidamente
convertido en EGME en el cuerpo, y ambas sustancias han mostrado toxicidad similar en
animales. Por consiguiente, las dos substancias deben ser consideradas como toxicas al
hombre (Bolon y cols., 1997).
En personas laboralmente expuestas a estos agentes se han descrito alteraciones en
la hematopoyesis, así como daño testicular e incluso sobre la morfología espermática.
Varios estudios muestran un aumento en la frecuencia de abortos espontáneos, alteraciones
en el ciclo menstrual y subfertilidad en mujeres laboralmente expuestas a EGME, por lo
que la valoración toxicológica de esta sustancia resulta fundamental (Johanson, 2000).
8
Las concentraciones (O. 1% a 0.4%) de EGME en ratonas en gestación digiriendo durante
13 semanas, producen una marcada reducción en el numero de crías y en el índice
reproductivo de las crías sobrevivientes, pero sin cambios en el peso corporal, pero sí en el
peso del hígado de las hembras, los efectos reproductivos ocurren en presencia de toxicidad
somática. (Chapin y Sloane., 1997).
El efecto el EGME sobre la salud reproductiva femenina es mayor que el observado
en el sexo masculino debido a que las hembras nacen con un número fijo de ovocitos,
mientras que los machos cuentan con la capacidad de regeneración del epitelio seminífero.
Por esto, la exposición de las hembras a una gran cantidad de agentes que dañan al ovario,
generalmente causan esterilidad permanente.
Con la finalidad de profundizar sobre los mecanismos moleculares que regulan el
proceso de diferenciación de células germinales primordiales a ovocitos, así como sobre las
alteraciones en la expresión génica causada por agentes químicos en la ovogénesis
temprana, en el presente proyecto se estudio la viabilidad en cultivos in Vitro de ovocitos
fetales expuestos al solvente Etilén glicol monometil éter.
9
OBJETIVO GENERAL :
Determinar el efecto del Etilén Glicol Monometil Éter en la viabilidad de cultivos de
ovocitos in vitro
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
l. Estandarizar la técnica de cultivos de ovocitos fetales in vitro
2. Determinar el efecto de EGME sobre la viabilidad de los ovocitos en cultivo.
10
MATERIAL Y METODO:
Ratonas:
-Mus musculus Swiss
Medios de Cultivo:
Medio para recolección de ovarios: Medio mínimo esencial (MEM) (GIBCO 123600-
03 S).
Suplementado:
BSA lmg/ml (FR V, SIGMA)
Penicilina-estreptomicina 100pg/ml
Medio de cultivo de ovocitos: Medio Waymouth (GIBCO 1 1220-035)
Suplementado:
Suero de caballo al 5% (v/v)
Suero fetal de bovino 2.5% (v/v)
Penicilina-estreptomicina lOOpg/ml
Solución stock de EGME:
solución 1 OOpM con H20
solución 1 pM con H z 0
11
METODO:
CULTIVO DE OVOCITOS FETALES IN VITRO
Se llevó a cabo básicamente según la metodología descrita por Defelici y Dolci,
(1987). Ovarios de embriones de ratón de 17 días post-coito(dpc) fueron disectados en
medio de recolección (ver materiales). Cada ovario se cortó en fragmentos de 0.5-1 mm
utilizando agujas finas (G 27) bajo el estereomicroscopio. Los fragmentos se colocaron en
500 p1 de cultivo en cajas de 4 pozos, se incubarón a 37" C en una atmósfera con 5% de
COZ. Después de 2-3 días, cuando los explantos de ovario estaban adheridos se agrego
5 0 0 ~ 1 de medio de cultivo por pozo. Se observó diariamente el buen crecimiento y
desarrollo de los ovocitos. En el día 10 de cultivo, la mayoría de los ovocitos alcanzaron el
estadio de vesícula germinal.
EFECTO DE EGME EN LA VIABILIDAD DE LOS CULTIVOS DE OVOCITOS
IN VITRO
Después de 10 días de cultivo, se contabilizó el número de ovocitos en estadio de
vesícula germinal, y fueron tratados durante 24 h con diferentes dosis de EGME. Las dosis
empleadas fueron: 1 pM, 100 pM, 500,750, 1000 pM. Después de 24 h de exposición a el
EGME, los cultivos fueron lavados, se añadió medio de cultivo fresco, y durante los
siguientes 15 días se evaluó la supervivencia de los ovocitos, contando el número de éstos
por pozo de la cajas.
12
RESULTADOS
CULTIVO IN VITRO DE OVOCITOS FETALES
Se establecieron las condiciones que permitieron el desarrollo in vitro de ovocitos a
partir de ovarios de 17 días post coito, hasta alcanzar el estadio de vesícula germinal. Se
observa que a los 4 días de cultivo los explantos de ovario se habían adherido a la placa, e
iniciaron su crecimiento y desarrollo (fig 1). Después de 10 días de cultivo, los ovocitos
alcanzaron un diámetro de aproximadamente 70 pm, y tanto la zona pelúcida que rodea a
los ovocitos, como la vesícula germinal, se observaban claramente (fig. 2).
EFECTO DEL EGME EN LA VIABILIDAD DE LOS CULTIVOS DE OVOCITOS
Una vez que’ fueron estandarizados los cultivos de ovocitos de ratón a partir de
ovarios fetales, se procedió a tratarlos con el EGME. Los cultivos de ovarios fetales fueron
tratados con el EGME en el día 10 de cultivo in vitro, cuando la mayoría de los ovocitos
habían alcanzado el estadio de vesícula germinal.
Se utilizaron diferentes dosis (1, 100, 500, 1000 pM) de EGME. Las dosis de 500,
750, 1000pM mostraron una efecto importante sobre la viabilidad de los ovocitos ( cerca
del 50 % de la sobrevivencia) tras 24 h de exposición al EGME (ver tabla). Las dosis
menores a 500 pM no afectaron la viabilidad de los ovocitos en cultivo después de 24 11 de
exposición, por lo que no se continuo trabajando con estas dosis, ya que el presente forma
parte de un proyecto en el que se estudiarán los cambios en la expresión génica en los
ovocitos expuestos, y se busca un efecto importante sobre esta para desarrollar dicho
análisis.
13
Fig. 1 Se observa el desarrollo de los cultivos de ovarios fetales.
Fig. 2 Ovocitos en cultivo in vitro en diferentes días (6 y 7 )
Efecto de EGME sobre la viabilidad de cultivos de ovocitos in vitro.
RESULTADOS
Solución 1000pM
31 55 64 65 1 O0 Promedios 19 33 48 72 1 O0 Exp. 4 21 44 60 76 1 O0 Exp. 3 47 83 92 38 I O0 Exp. 2 38 60 57 73 1 O0 Exp. 1
Día22 Día20 Día 15 Día 11 Día 10
Desviacion Estandar 14 22 19 18 O I
I I I I I I I
16
-I-
15 I
20
Grafica I : Efecto de EGME en ovocitos de cultivo in vifro. En el día 10 de cultivo de cada
experimento, se contó el número de ovocitos en estadio de vesícula germinal y fueron tratados durante 24 h con EGME la sobrevivencia de los ovocitos se evaluó durante los siguientes 15 días.
17
I
DISCUSI~N
En los mamíferos, la gametogénesis es el proceso de diferenciación de las células germinales que, a través de complejos mecanismos de regulación génica. lleva a la formación de óvulos en las hembras y de espermatozoides en los machos. Las alteraciones en estas cascadas de regulación pueden afectar no sólo la fertilidad de los individuos, sino que además pueden ser el origen de daño genético severo transmisible a futuras generaciones. La prevención de estas consecuencias deletéreas requiere de: 1) la identificación de la naturaleza del efecto tóxico de los APTs sobre el sistema reproductivo, y en especial sobre las células germinales (estudios cualitativos). 2) La evaluación de las dosis necesarias para inducir el que se llevan a cabo en los sistemas celulares tras la exposición a los APTs (Koeter, 1993). Los estudios in vivo sólo pueden, en general, dar respuestas a los dos primeros aspectos. El esclarecimiento de los mecanismos moleculares del daño toxicológico se puede llevar a cabo con mayor facilidad mediante estudios in vitro, donde es posible un mejor control de las variables, así como la evaluación toxicológica de metabolitos de los agentes tóxicos y compuestos relacionados a éstos estructural o biológicamente (Lamb y cols., 1993).
La valoración toxicológica de APTs sobre la células germinales de mamíferos se ha realizado generalmente en estudios in vivo en machos, en los que la espermatogénesis se lleva a cabo de manera continua desde la pubertad. Sin embargo, esta característica ha permitido también la realización de ensayos in vitro, facilitando así el estudio de los mecanismos moleculares que se llevan a cabo durante la espermatogénesis en condiciones normales o bajo la exposición de PGCs a ovocitos de primer orden se lleva a cabo exclusivamente en estadios fetales, lo que ha dificultado tanto el estudio de la ovogénesis temprana como la realizacion de valoraciones toxicológicas.
La primera aproximación a éstos estudio fue la adaptación de los sistemas de cultivo in vitro de ovocitos fetales (De Felice, 1987) y el análisis de su viabilidad bajo condiciones de estrés tóxico. En el presente estudio, esta metodología fue estandarizada para determinar el efecto de EGME sobre la viabilidad de los ovocitos en cultivo. Los cultivos de ovocitos se desarrollaron a partir de ovarios fetales de 17 dpc. Después de 1 O días de cultivo in vitro, los ovocitos completaron la profase meiótica y se encontraban detenidos en el estadio de diplotena. En este momento, los ovocitos fueron tratados con diferentes dosis de EGME. y se analizó el efecto sobre su viabilidad los días 10,11,15, y 25 de cultivo. Se encontró que a dosis menores a 500 pM no tuvieron efecto sobre la viabilidad de los ovocitos en cultivo in vitro a 24h de exposición. Sin embargo las dosis de 500, 1000 pM mostraron un efecto importante sobre la viabilidad de los ovocitos (cerca del 50 % de la sobrevivencia) tras 24 h de exposición al EGME.
Existen otros estudios relacionados con el efecto del EGME sobre células germinales: Aich y Manna (1996) realizaron un estudio utilizando como modelo al ratón, encontrando que el EGME a las concentraciones de 500 mg/kg por vía peritoneal causa problemas severos en la movilidad de espermatozoides y produce una reducción del número de espermatozoides por eyaculado.
18
Por otro lado For y cols (2001) demostraron que el EGME tiene efecto sobre la reproducción en Xenopus Zaevis. En este estudio se utilizarón, machos y hembras, a los cuales se les administrarón concentraciones subletales de EGME durante 30 días, y observaron una disminución en la capacidad de desarrollo de los ovocitos, y en la movilidad de los espermatozoides.
Shih y cols. (2000) investigaron los efectos de EGME en obreros expuestos laboralmente. La valoración de semen en los obreros no mostró cambio significativo. Sin embargo, la hemoglobina disminuyó significativamente en un 26.1 % en los obreros expuestos no así en los sujetos control en la que la hemoglobina disminuyó en un 3.2 %. Por lo tanto el EGME causó anemia en los obreros.
En este trabajo, el EGME tubo un impacto sobre la viabilidad de los ovocitos en cultivo. La muerte celular de ovocitos puede ocurrir por necrosis o por apoptosis. Liu y cols. (1996) determinaron que la activación de las caspasas, proteasas efectoras de las señales de apoptosis, depende de la liberación de citocromo c de la mitocondria. La liberación de este citocromo puede ocurrir de dos maneras: una está asociada a un desequilibrio osmótico que provoca la expansión de la mitocondria, con la subsecuente ruptura de sus membranas que desencadena un proceso de muerte celular por necrosis. La otra vía de liberación de proteínas activadoras de caspasas mitocondriales tiene que ver con la apertura de canales en la membrana externa de la mitocondria, sin que ocurra expansión o ruptura del organelo, por lo que se libera citocromo c hacia el citosol. Citocromo c se une a Apaf- 1, y activa a la procaspasa 9, que a su vez activa el resto de las caspasas, iniciando una cascada proteolítica que culmina con una muerte celular por apoptosis (Green y Reed, 1998).
Se requiere de más estudios para definir el tipo de muerte celular causada a los ovocitos por EGME, así como de análisis de la expresión génica en estas para determinar los mecanismos moleculares del daño causado. Estos estudios se realizarán a continuacion en nuestro laboratorio, mediante el desarrollo de genotecas de expresión y análisis diferenciales. La estandarización del sistema de cultivo in vitro de ovocitos a partir de ovarios fetales llevada a cabo en el presente trabajo será la base para el desarrollo de estos estudios.
19
0 L a técnica de cultivo de ovocitos fetales in vitro mantiene la viabilidad de los
ovocitos, por lo que es apropiada para determinar el efecto de diferentes agentes
potencial mente tóxicos.
0 El EGME afecta la viabilidad de los cultivos de ovocitos fetales in vitro.
0 Las concentraciones menores a 500 pM de EGME no tuvieron efecto en la
viabilidad de los ovocitos cultivados in vitro. Después de 24 11 de exposición.
Las concentraciones de 500, 750 y 1000 pM causaron una disminución en la
viabilidad cercana al 50 % tras 24 h de exposición .
20
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