Universidad de Colima
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS
DIVERSIDAD GENÉTICA DE Mycosphaerella fijiensis Morelet EN PLÁTANO ENANO GIGANTE (Musa acuminata AAA) CULTIVADO
CON DIFERENTE MANEJO
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS: ÁREA BIOTECNOLOGÍA
PRESENTA
GILBERTO MANZO SÁNCHEZ
Tecomán, Colima, México Junio de 2001
INDICE
Página
INDICE DE CUADROS Y FIGURAS v RESUMEN vii I INTRODUCCIÓN 1 II REVISIÓN DE LITERATURA 5 2.1 Interacción planta-patógeno 5
2.2 Genética y biología de poblaciones de hongos fitopatógenos 6
2.3 Estructura genética de poblaciones 7 2.4 Factores que influyen en la estructura genética 8
de poblaciones 8 2.4.1 Mutación 8 2.4.2 Recombinación 9 2.4.3 Flujo de genes 10 2.4.4 Selección 11
2.5 Uso de los marcadores de DNA en hongos fitopatógenos 12 2.5.1 Polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP) 13 2.5.2 DNAs polimórficos amplificados al azar (RAPD) 14 2.5.3 Polimorfismos de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) 15 2.5.4 Microsatélites o secuencias repetidas simples (SSR) 17
2.6 El cultivo del plátano (Musa spp.) 19 2.7 Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis Morelet) 20
2.7.1 Identificación y clasificación de M. fijiensis 21 2.6.2 Desarrollo de los síntomas de la enfermedad de
la sigatoka negra 26
2.6.3 Interacción Musa-Mycosphaerella fijiensis 27 2.6.4 Fitoalexinas de M. fijiensis 28 2.6.5 Variabilidad patógena 29 2.6.7 Marcadores de DNA 30 III MATERIALES Y MÉTODOS 33 3.1 Lugar de realización 33 3.2 Muestreo 35 3.3 Aislamiento de M. fijiensis 35 3.4 Cultivo de M. fijiensis en medio líquido 35 3.5 Extracción del DNA genómico de M. fijiensis 36
3.6 Marcadores RAPDs en M. fijiensis 37 3.7 Microsatélites en M. fijiensis 38 3.8 Visualización de los productos 39 3.9 Análisis de los datos 39
IV RESULTADOS 41 4.1 Caracterización morfológica de M. fijiensis 41 4.2 Análisis de los marcadores RAPDs 41 4.4 Análisis de los microsatélites 48 V DISCUSIÓN 54 5.1 Caracterización morfológica de M. fijiensis 54 5.3 Análisis de los marcadores de RAPD en M. fijiensis 54 5.4 Análisis de los marcadores de SSR en M. fijiensis 56
VI CONCLUSIÓN 58 VII BIBLIOGRAFÍA CITADA 59
INDICE DE CUADROS
Cuadro Descripción
Página
INDICE DE FIGURAS
Figura Descripción Pagina
1 Características y propiedades de distintas técnicas de marcadores de DNA. 17 2 Principales plagas y enfermedades que afectan al cultivo de plátano (Musa spp.) a nivel mundial
20 3 Fungicidas usados en las plantaciones de plátano en América Latina. 21 4 Características de los huertos de plátano cultivar enano gigante que fueron muestreados para el
aislamiento de Mycosphaerella fijiensis. 34
5 Lista de los iniciadores utilizados en la determinación de los RAPD de los aislados de Mycosphaerella fijiensis, obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.
38
6 Lista de los iniciadores utilizados en la determinación de los SSR de los aislados de Mycosphaerella fijiensis, obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.
39
7 Apariencia en medio PDA de la morfología de 3 aislados de Mycosphaerella fijiensis. INIFAP-Tecomán (INI-2), poblados de Puerta de Caleras (PC-3) y Cerro de Ortega (IB-2).
41
8 Aislamientos monospóricos obtenidos de Mycosphaerella fijiensis de la región productora del estado de Colima.
42
9 Iniciadores al azar, secuencia, número total de bandas amplificadas y polimórficas en los aislados de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de huertos de plátano con tres manejos distintos.
44
10 Secuencias de los iniciadores de microsatélites, tipo de repetición y número de alelos en los aislados de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.
51
1 Distribución de Mycosphaerella fijiensis en el mundo. 21 2 Conidios de Mycosphaerella fijiensis. 25 3 Ciclo de vida del hongo Mycosphaerella fijiensis causante de la sigatoka negra 27 4 Mapa de las localidades muestreadas para el aislamiento de Mycosphaerella fijiensis.
33 5 Características morfológicas de los aislados de Mycosphaerella fijiensis de tres predios de manejo
diferente de la región del Estado de Colima. INIFAP-Tecomán (INI-2); Puerta de Caleras (PC-3) y Cerro de Ortega (IB-2).
43
6 Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador A-01 (5 CAGGCCCTTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.
44
7 Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador H-12 (5´ ACGCGCATGT 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.
45
8 Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador M-07. (5 CCGTGACTCA 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.
46
9 Marcadores RAPD de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador P-13 (5´ GGAGTGCCTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb, carril 1: INI-3, carril 2 : INI-6, carril 3 : GLE-4, carril 4: PC-2, carril 5 : ORT-3 y carril 6 : GLE-4.
47
10 Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador M-O4 (5´ GGCGGTTGTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.
48
11 Marcadores RAPD de aislados de Mycosphaerella fijiensis generado por el iniciador H-06 (5´ ACGCATCGCA 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.
49
12 Dendrograma derivado de UPGMA de los análisis de seis iniciadores RAPD de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis de 6 campos con diferente manejo técnico (CA-2 e IN-3: Rústicos; IB-4 y CO-1: Intensivo; ORT-4 y FIE-3 : Semintensivo). Los números en los nodos representan un bootstrap para 1000 replicas.
50
13 Análisis de microsatélites para el locus MfSSR175 de 17 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de huertos de plátano con tres manejos distintos.
51
14 Análisis de microsatélites para el locus MfSSR005 de 17 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de huertos de plátano con tres manejos distintos.
52
15 Dendrograma derivado de UPGMA de los análisis de SSR de 16 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de huertos de plátano con tres manejos distintos. Los números en los nodos representan un bootstrap para 1000 replicas.
53
DIVERSIDAD GENÉTICA DE Mycosphaerella fijiensis Morelet EN PLÁTANO ENANO GIGANTE (Musa acuminata AAA) CULTIVADO
CON DIFERENTE MANEJO
GILBERTO MANZO SÁNCHEZ
Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
DNAs polimórficos amplificados al azar (RAPD) y secuencias simples repetidas (SSR) fueron usadas
para determinar la diversidad genética del hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet, causante de la sigatoka negra
del plátano, presente en la región productora del cultivar enano gigante del Estado de Colima. 20 aislamientos
monospóricos de M. fijiensis, fueron obtenidos de parcelas con diferente grado de manejo. Los iniciadores RAPD
obtuvieron 51 bandas polimórficas de un total de 58 bandas, el índice de similaridad entre los aislados fueron
analizados y el rango fue de 0.00-0.40. El método promedio aritmético de grupos de pares no ponderados
(UPGMA) reveló dos grupos, uno a los aislamientos procedentes de parcelas con manejo rústico (R) y el otro
grupo a los de manejo semintensivo (SI) e intensivo (IN). Sin embargo, con los SSR, todos los aislados
presentaron un solo haplotipo para el locus MfSSR175 y con el locus MfSSR005 se obtuvieron de uno a tres
alelos, demostrando con esto un elevado nivel de flujo de genes entre las localidades analizadas. Los resultados
muestran que el nivel de tecnificación influye en la diversidad genética del hongo M. fijiensis.
Palabras claves : sigatoka negra, marcadores de DNA, RAPD, SSR, diversidad genética, control químico.
GENETIC DIVERSITY OF Mycosphaerella fijiensis Morelet IN BANANA
GIGANT NAINE (Musa acuminata AAA) WITH DIFFERENT
MANAGEMENT
GILBERTO MANZO SÁNCHEZ
Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
Ramdomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeat (SSR) markers were used
to evaluated genetic diversity of fungi Mycosphaerella fijiensis Morelet, causal agent of black sigatoka of banana,
present in the growth region of cultivar gigant naine of Colima State. 20 single spore isolates of M. fijiensis, were
obtenied of farms with several level of management. The primers RAPD yielded 51 polymorphic bands of a total
of 58 bands, the similarities index between the isolates was analyzed and the range was from 0.00-0.40.
Unweighted pair-group method with arithmetic average (UPGMA) cluster analysis revelated two group, one
formed by isolates obtenied from fields with rustic handling (R) and the other group obtenied of semintensive
handling (SI) and intensive (IN). However, with the SSR, all the isolates presented a single haplotype for the
locus MfSSR175 and with the locus MfSSR005 was obtained of one to three alelos, demonstrating a high level of
gene flow between analyzed locations. The results showed that the level of tecnification influences in the genetic
diversity of fungus M. fijiensis.
Key words : black sigatoka, DNA markers, RAPD, SSR, genetic diversity, chemical control.
I INTRODUCCIÓN
Las plantaciones agrícolas ocupan entre 100 y 130 millones de hectáreas (ha) a escala mundial (Swayer,
1993). Un gran porcentaje de la producción de estas plantaciones se ven afectadas por organismos fitopatógenos
y fitoparasitos, entre los que se encuentran los micoplasmas, bacterias, hongos, nematodos, protozoarios, virus y
plantas parásitas (Staskawicz et al., 1995).
Los daños causados por los organismos fitopatógenos, ascienden a billones de dólares por efecto en la
reducción de casi un 20% de la producción en los principales cultivos (Oerke et al., 1994; Baker et al., 1997). Las
pérdidas podrían ser más severas sí variedades altamente susceptibles son cultivadas extensivamente (Schwinn,
1992).
Lo anterior, explica por que el objetivo de varias investigaciones está enfocado hacia la protección de los
cultivos contra las enfermedades que son causadas por patógenos y así poder satisfacer y mantener la demanda de
los alimentos en el mundo (Herrera-Estrella y Simpson, 1995; Baker et al., 1997).
El control de las enfermedades se ha basado principalmente en la aplicación de agroquímicos, prácticas
culturales y uso de variedades resistentes (Herrera-Estrella y Simpson, 1995). Sin embargo, estas estrategias de
control en casos muy raros han mantenido su efectividad por un periodo largo (Johnson, 1984). Además, la
aplicación indiscriminada de agroquímicos ha generado efectos nocivos en el medio ambiente y en la salud
humana (James et al., 1993; De Waard et al., 1993; Garry, et al., 1989).
Lo anterior es una respuesta a que las poblaciones de patógenos deben de adaptarse a cambios en su medio ambiente para sobrevivir; sin embargo, en los ecosistemas agrícolas, los cambios ambientales según McDonald, (1997) pueden incluir el uso de variedades resistentes, aplicaciones de fungicidas químicos, fertilizantes, irrigación y rotación de cultivos. Es claro que las características de los sistemas agrícolas intensivos, basados en gran parte sobre la
uniformidad de cultivos imponen una fuerte selección direccional sobre las poblaciones de los patógenos, a través
de su habilidad para desarrollarse y adaptarse rápidamente a medidas de control genético o químico (Milgroom y
Fry, 1997; McDonald, 1997). Por lo tanto, el interés de las estrategias de control deberá ser una población en
lugar de un individuo, de tal modo que en los estudios patológicos de plantas, deberá enfocarse un mayor
esfuerzo sobre el entendimiento de la genética de poblaciones para entender como las poblaciones se
desarrollarán en respuesta a diferentes estrategias de control (McDonald, 1997).
La estructura genética de poblaciones, según McDonald y McDermott, (1993), es la cantidad y
distribución de la variación genética que existe dentro y entre poblaciones de los patógenos. Su conocimiento es
fundamental para saber con que rapidez se puede desarrollar y adaptar un patógeno y eventualmente esta
información puede ser usada para predecir en que periodo de tiempo un método de control puede ser más
efectivo, ya que las poblaciones con un alto nivel de variabilidad genética pueden adaptarse más rápidamente a
hospederos resistentes y/o fungicidas. Los factores que influyen en los cambios de la estructura genética de las
población según McDonald et al., (1989) son: mutación, recombinación, flujo de genes y selección.
El uso de pesticidas para el control de plagas agrícolas es una práctica común, las aplicaciones continuas
de estos provocan el desarrollo de la resistencia en las poblaciones de hongos fitopatógenos (Georgopoulos,
1987), siendo uno de los problemas mas serios en la agricultura a nivel mundial (Staub, 1991). Sin embargo, la
evolución de la resistencia involucra cambios en las frecuencias de genes que controlan la resistencia, un
entendimiento de los cambios genéticos a nivel de población es importante para desarrollar métodos adecuados y
eficientes en el manejo de enfermedades (Adachi et al., 1996)
La resistencia a fungicidas es una de las preguntas más importantes en el estudios de la genética de
poblaciones de hongos fitopatógenos enfocados sobre como las poblaciones de los patógenos reflejan en
particular este proceso de selección (McDonald, 1997), pero, en la actualidad existen pocos estudios sobre la
genética de la resistencia a fungicidas en hongos fitopatógenos (Adachi et al., 1996; Yourman et al., 2000). Este
tipo de estudios podrían demostrar los procesos que ocurren durante una evolución hacia la resistencia de
funguicidas (Adachi et al., 1996).
Una de las herramientas para poder determinar estos factores, son los marcadores de DNA como son los
polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLPs) (Botstein et al., 1980), DNAs polimórficos
amplificados al azar (RAPD) (Williams et al., 1990; Welsh y McClelland, 1990), los microsatélites o secuencia
repetidas simples (SSR) (Jeffryes et al., 1985; Tautz y Renz, 1984), y los polimorfismos de la longitud de
fragmentos amplificados (AFLPs) (Vos et al., 1995), estos se han utilizado ampliamente en el estudio de la
genética y biología de poblaciones de hongos fitopatógenos (Michelmore y Hulbert, 1987; Weising et al., 1995;
McDonald, 1997).
La enfermedad de gran importancia mundial que afecta al cultivo del plátano (Musa spp.) es la sigatoka
negra, causada por el hongo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis Morelet (Mourichon y Stover, 1998), el cual
provoca actualmente los mayores daños económicos, causa necrosis, reduce el área foliar de la planta y por lo
tanto disminuye el rendimiento de fruta (Stover, 1980), tiene los dos tipos de reproducción y es heterotálico
(Mourichon y Zapater, 1990), dando como consecuencia una mayor recombinación genética de este hongo. Esta
enfermedad es controlada principalmente con la aplicación de fungicidas (Stover y Simmonds, 1987), lo que
implica hasta el 40% del costo total de la producción y un aumento en el grado de contaminación ambiental y
daños en la salud humana (Stover, 1980; Henriques et al., 1997).
La utilización de las técnicas moleculares en el estudio del genoma de Mycosphaerella spp., se convirtió
en el objetivo de varios proyectos de investigación. La PCR fue usada para amplificar el espacio 1 interno
trascrito (ITS) de la región del DNA ribosomal para distinguir a M. fijiensis y M. musicola (Johanson y Jeger,
1993) y recientemente a M. eumusae (Carlier et al., 2000), para determinar la variabilidad genética de aislados
procedentes de América, África, Asia y Oceanía por medio de marcadores RFLP (Carlier et al., 1994), RAPD
(Johanson et al., 1994), huellas genéticas de DNA en aislados de diferente hospedero, localidad, dentro del
mismo hospedero y así como también de la misma lesión (Müller et al., 1997) y microsatélites en dos
poblaciones, una de México y la otra de Nigeria (Neu et al., 1999), los cuales han demostrado ser eficientes para
determinar el nivel de diversidad genética de este patógeno.
En M. fijiensis se ha detectado resistencia cruzada hacia algunos grupos químicos de fungicidas, como a
benomyl (Fullerton y Tracey, 1984; Romero y Sutton, 1997), carbendazim (Fullerton y Tracey, 1984),
propiconazol (Romero y Sutton, 1998) y azoxistrobin (Sierotzki et al., 2000). La resistencia que ha presentado M.
fijiensis hacia algunos fungicidas y el indiscriminado uso de estos para su control son elementos suficientes para
suponer que la diversidad genética del hongo esta fuertemente influida por manejo del cultivo. Para dar respuesta
a esta hipótesis, se plantearon los siguientes objetivos:
1. Aislar y caracterizar morfológicamente el hongo M. fijiensis en plantas de plátano enano gigante (Musa
acuminata AAA), cultivadas con manejo intensivo, semintensivo y rústico.
2. Determinar la diversidad genética de aislados de M. fijiensis, obtenidos de plantas de plátano cultivadas bajo
manejo intensivo, semintensivo y rústico.
II REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Interacción planta-patógeno
Una gran diversidad de organismos atacan a las plantas de interés agrícola, entre ellos se encuentran:
virus, micoplasmas, bacterias, hongos, nematodos, protozoarios y plantas parásitas (Baker et al., 1997). Los
daños causados por los organismos fitopatógenos, ascienden a billones de dólares por efecto en la reducción de la
producción en casi 20% en los principales cultivos según Oerke et al., (1994); Baker et al., (1997). Schwinn,
(1992) mencionan que las pérdidas podrían ser más severas sí variedades altamente susceptibles son cultivadas
extensivamente.
Las bases genéticas de la resistencia localizada están descritas por la hipótesis de Flor (1971), la cual
describe que en las interacciones gene-por-gene entre las plantas y sus patógenos, la incompatibilidad (no
enfermedad) requiere genes de resistencia (R) dominantes y semidominantes de la planta y un gene
correspondiente de avirulencia (avr) del patógeno y mientras que en la compatibilidad sucede cuando las plantas
no tienen genes R y el patógeno presenta genes de virulencia. Esta hipótesis según Keen, (1990); Crute y Pink,
(1996); Scofield et al., (1996); Bonas y Van de Ackerveken, (1999) la han reportado en algunas interacciones de
hongos, virus, bacterias y nematodos con sus respectivos hospederos.
Principalmente se han identificado los genes R contra bacterias, hongos y virus, aislado y algunos
clonados en plantas tal y como lo reportan Martin et al., (1993); Joosten et al., (1994); Jones et al., (1994);
Mindrino et al., (1994); Bent et al., (1994); Whitham et al., (1994); Grant et al., (1995); Dixon et al., (1996) y
Parniske et al., (1997), tales genes pueden ser usados para el control de enfermedades por los fitomejoradores en
un futuro muy cercano (Lamb, 1994; Staskawicz et al., 1995; Hammond-Kosack y Jones, 1996; Jones, 1997;
Innes, 1998).
2.2 Genética y biología de poblaciones de hongos fitopatógenos
La genética y biología de poblaciones de los hongos patógenos de las plantas han generado un gran
interés desde los años 80, un gran número de recientes revisiones de conceptos y métodos apropiados sobre los
estudios de genética y biología de poblaciones de hongos fitopatógenos han sido publicados (Burdon, 1993;
Leung et al., 1993; McDermott y McDonald, 1993, McDonald y McDermott, 1993; Anderson y Kohn, 1995;
Milgroom, 1995; 1996; Milgroom y Fry, 1997).
Los hongos muestran una de las formaciones más diversas de vida, que hacen de estos un modelo para el
estudio de muchos procesos básicos en la biología poblacional. Los hongos podrían tener exclusivamente
reproducción sexual, asexual o una combinación de estas dos. Las esporas de los hongos podrían ser
especializadas por cualquier tipo de dispersión ya sea local o de larga distancia provocadas por el viento, insectos
vectores o semillas (McDonald y McDermott, 1993).
Los principales objetivos de los fitopatólogos según Johnson, (1984), han sido elaborar estrategias de
control de las enfermedades causadas por los hongos. Estos métodos se han basado principalmente sobre la
resistencia genética de las plantas hospederas o la resistencia hacia fungicidas. En raros casos, genes individuales
de resistencia o ha fungicidas han mantenido sus efectos por varias décadas.
Sin embargo, McDonald y McDermott, (1993), mencionan que en la década reciente en el incremento de
la agricultura intensiva, basada en gran parte de cultivos uniformes o clones, es una habilidad de las poblaciones
de patógenos para desarrollarse y adaptarse a medidas genéticas o de control químico, provocando esto una
rápida adaptación del patógeno.
Para poder asegurar un largo periodo de suministro de productos alimenticios, nuevas estrategias podrían
ser desarrolladas, basadas sobre el entendimiento de la genética y biología poblacional de las interacciones
planta-patógeno, que podrían aplicarse como herramienta de control para las enfermedades (Allard, 1990; Wolfe,
1985).
Según McDonald (1997), existen tres preguntas que podrían ser consideradas por los fitopatólogos para
realizar experimentos en poblaciones genéticas con un nuevo patógeno. La primera es sobre la estructura genética
de las poblaciones de los patógenos: i) que tanta diversidad genética existe en una población?, ii) como está
distribuida la diversidad genética dentro de las poblaciones (y sobre que escala espacial)? y iii) como está
distribuida la diversidad genética entre las poblaciones (y sobre que escala espacial)?
Las siguientes tres preguntas se relacionan con la especificidad de los procesos evolutivos: i) como
afecta la reproducción sexual y asexual a la estructura poblacional del patógeno?, ii) como su migración y su
movimiento genético afecta la estructura poblacional? y iii) como afecta la selección la estructura poblacional?
(McDonald, 1997).
La tercera pregunta se relaciona específicamente a la patología sobre la planta: i) cual es la mejor
definición de una "población" para el patógeno en estudio (cuales son los límites geográficos y de especies que
pueden ser definidos por el flujo de genes), ii como afectan las diferentes estrategias de control la estructura
genética de las poblaciones del patógeno? y iii) cual es el potencial evolutivo de este patógeno? (¿Este
probablemente evolucione rápidamente o muy poco en un medio ambiente cambiante?) (McDonald, 1997).
2.3 Estructura genética de poblaciones de hongos fitopatógenos
La estructura genética de poblaciones, se refiere a la cantidad y distribución de la variación genética
dentro y entre poblaciones (McDonald et al., 1989b; McDonald y McDermott, 1993). El conocimiento de la
estructura genética de poblaciones de los hongos fitopatógenos como una aplicación directa, es saber la cantidad
de la variación genética que se mantiene dentro de una población, indicando que tan rápidamente un patógeno
puede evolucionar y esta información podría ser usada para predecir que tan efectivo que pueda ser un método de
control. Por ejemplo, las poblaciones con un alto nivel de variabilidad genética pueden adaptarse más
rápidamente a hospederos resistentes y/o fungicidas (MacDonald y McDermott, 1993). Los estudios de mayor
información han usado esquemas de muestreo jerárquico para fraccionar la diversidad genética dentro de varios
niveles, correspondientes a diferentes escalas geográficas, cuya escala de muestreo podría ser tan pequeña, como
diferentes aislamientos hechos de una sola lesión, en una hoja y tan grande como colecciones hechas de
diferentes regiones sobre el mismo continente o sobre diferentes continentes (McDonald et al., 1995; McDonald
et al., 1999b).
En varios casos, los marcadores de DNA han demostrado que las poblaciones de los hongos
fitopatógenos podrían contener un alto grado de diversidad genética que esta frecuentemente distribuida sobre
una escala espacial muy pequeña, como lo fue demostrado en los hongos Mycosphaerella graminicola
(McDonald y Martinez, 1990b), Sclerotinia sclerotum (Kohli et al., 1992), Stagonospora nodorum (McDonald et
al., 1994); Magnaporthe grisea (Xia et al., 1993); Ascochyta rabie (Morjane et al., 1994); Mycosphaerella
fijiensis (Müller et al., 1997) y Eutypa lata (Péros et al., 1997).
2.4 Factores que influyen en la estructura genética de poblaciones
2.4.1 Mutación
La mutación es un factor importante como fuente de variación genética en las poblaciones de hongos
fitopatógenos (McDonald et al., 1989b), cuya causa se atribuye principalmente a la fase sexual (Wolfe y
McDermott, 1994), debido a que grandes cantidades de DNA repetitivo provocan la alteración de la meiosis y
recombinación dentro de diferente aislados (Rasmussen et al., 1993). Aunque el rango de las mutaciones es
generalmente bajo por locus, la mutación es persistente y sobre un tiempo genera mucha variabilidad que es
preservada sobre todos los loci. Las mutaciones espontáneas de avirulencia hacia virulencia es bien reconocida
como un medio importante por el cual las poblaciones naturales de un amplio rango de hongos responden a
cambios en las resistencias de las poblaciones de su hospedero (Burdon, 1993).
2.4.2 Recombinación
La recombinación o el tipo de reproducción tanto sexual, asexual o una combinación de ambas,
incrementa la diversidad genética en las poblaciones permitiendo la formación de nuevas combinaciones
genéticas (McDonald et al., 1989; Burdon, 1993b; Wolfe y McDermott, 1994; Leslie, 1995; McDonald et al.,
1995). Los hongos fitopatógenos que se reproducen de forma sexual tienden a ser más diversos genéticamente
que las poblaciones asexuales de la misma especie (Milgroom, 1996).
En muchos casos, la reproducción asexual es baja, pero ocurre mas frecuente que la sexual, por esta
razón un número limitado de clones o líneas clonales son diseminados a través de un rango geográfico mundial
(Goodwin et al., 1997), mientras que las poblaciones que se reproducen sexualmente pueden tener un potencial
más evolutivo de largo plazo (Zhan et al., 1998). Por esta razón las recombinaciones permiten mucho mas
combinaciones de alelos, mientras que las poblaciones asexuales son limitadas por la mutación que ocurre dentro
de líneas clonales (McDonald et al., 1999b).
Los apareamientos que ocurren durante un ciclo de la enfermedad causada por M. graminicola , registró
más capacidad de reproducción asexual que sexual, por lo tanto las poblaciones mantienen una estructura
genética más consistente con apareamientos al azar durante todo el ciclo de la enfermedad (Chen y McDonald,
1996), como también en un periodo de 3 años donde se mantiene una estabilidad genética (Chen et al., 1999),
similarmente ocurre en Colletotrichum graminicola (Rosewich et al., 1998). De esta manera la mayor variación
genética se distribuye a una escala pequeña, entre diferentes localidades dentro de un mismo campo, indicando
que la mayor variación genética puede ser concentrada en áreas tan pequeñas como a pocos metros cuadrados
(McDonald y Martinez, 1990b). Algo similar ocurre en M. fijiensis, donde se determinó una alta diversidad
genética en una amplia escala geográfica, entre diferentes hospederos (cultivares), dentro de la misma planta y de
la misma lesión (Müller et al., 1997). Los genotipos existentes de M. graminicola en el curso de una epidemia
estuvieron en equilibrio gamético, demostrando apareamientos al azar, por lo que se concluye que la infección es
causada por ascósporas (sexuales) (Zhan et al., 1998).
La ausencia de recombinación sexual en muchas poblaciones podrían consistir de líneas propagadas
clonalmente (Koenig et al., 1997); sin embargo, en poblaciones donde la recombinación ocurre a través de
procesos parasexuales se pueden forman rápidamente nuevas combinaciones de alelos virulentos (Zeigler et al.,
1997).
2.4.3 Flujo de genes
El flujo de genes se refiere a los mecanismos resultantes en el movimiento de genes de
una población a otra, dando como resultado cambios debidos al movimiento de gametos y de
individuos o grupos de individuos de un lugar a otro, seguido por la recolonización, o el
movimiento de segmentos extranucleares de DNA tales como mitocondria, plásmidos, entre
otros (Slatkin, 1987). Por lo tanto, cuando ocurre un alto flujo de genes, facilita la similitud
genética entre poblaciones, actualmente los marcadores de DNA se han utilizado para
determinar el flujo de genes entre poblaciones de algunos hongos fitopatógenos (McDermott y
McDonald, 1993).
En aislados de M. graminicola obtenidos de localidades separadas aproximadamente a 750 km se
encontraron alelos comunes, asumiendo que este movimiento a gran distancia es por medio de ascósporas y que
una población genética puede ser representativa a este nivel geográfico (Boeger et al., 1993), mientras que Keller
et al., (1997) en Phaeosphaeria nodorum determinaron un flujo de genes entre poblaciones de Texas, Oregon y
Suiza; la poca evidencia para la subdivisión de la población sugiere que el flujo de genes no fue restringido entre
las poblaciones, ya que mu chos haplotipos de multilocus se encontraron en cada población y los pares de alelos
fueron en equilibrio gamético, por lo que los datos fueron consistentes con los sistemas de apareamientos al azar
dentro de cada población del hongo (Keller et al., 1997b).
También en Rhyncosphorium secalis (McDonald et al., 1989a), ya que aislamientos de dicho hongo
procedente de tres continentes tuvieron un flujo de genes considerable, aunque con cierta recombinación en
algunas poblaciones (Salamati et al., 2000), sin embargo el flujo de genes en Rhyzoctonia solani AG-1 IA de seis
campos de arroz separados a 280 km de distancia, indicó una alta diversidad genética, demostrando un flujo de
genes y heterotálismo (Rosewich et al., 1999).
Sin embargo, Goodwin et al., (1994), demostraron que las poblaciones de Phytophthora infestans de
México, fueron el inóculo principal para que se diseminara a Estados Unidos y Canadá por medio de material
infectado. Mientras que en Mycosphaerella fijiensis, Carlier et al., (1996) y Neu et al., (1999), demuestran que
las esporas (ascosporas) de este hongo no pueden desplazarse por el viento entre continentes (América-África),
ya que ambas poblaciones no tuvieron una similitud genética. En una colección de aislados de M. graminicola y
P. nodorum de diferentes países se encontró un alto nivel de flujo de genes entre esas poblaciones, así como
también dentro de poblaciones separadas por cientos de kilómetros, ya que se encontraron alelos comunes de loci,
concluyendo que ambos patógenos tiene una gran capacidad para el flujo de genes (McDonald et al., 1999).
2.4.4 Selección
La selección también llamada coevolución se ha definido como "cambios genéticos recíprocos que
ocurren en dos o más especies que interactúan ecológicamente" (Futuyma y Slatkin, 1983). Sin embargo, esta
definición es muy simple y se enfoca simplemente en términos de la coevolución, debido a que los
fitomejoradores en sus experimentos controlan la mitad de la interacción coevolutiva en patosistemas agrícolas
(McDonald et al., 1996). Si la selección natural o coevolución, está presente en poblaciones de hongos
fitopatógenos, es posible mantener altos niveles de flujo de genes.
La diferenciación poblacional, definida en términos de diferencias en la frecuencia de alelos dentro de
subpoblaciones, puede ser causada por una selección y movimientos genéticos (Slatkin, 1987), que pueden
ocurrir en un gran número de propágulos de patógenos dispersados dentro de campos con diferentes cultivares.
Esto genera que los patotipos incompatibles no podrían sobrevivir en poblaciones de hospederos resistentes y por
lo tanto el flujo de genes podría ser mínimo (Milgroom y Lipari, 1995), ya que la población de un hongo
fitopatógeno es forzada a responder a cualquiera de los cambios hechos en las poblaciones de su hospedero de tal
manera que la evolución de las poblaciones del patógeno refleja igualmente la evolución directa hecha por el
hombre en el hospedero (McDonald et al., 1996).
La introducción de genotipos de hospederos conteniendo un gene mayor de resistencia fue una estrategia común
(Vanderplank, 1963) para mostrar que las poblaciones del patógeno experimentan un rápido incremento en la
frecuencia de un gene de virulencia, causando que los genes de resistencia de las plantas pierdan su eficiencia
(Flor, 1971; Staskawicz et al., 1995).
En poblaciones de R. secalis, de diferentes genotipos de cebada tuvieron una diferencia significativa en
la estructura genética, sugiriendo que estas tuvieron historias evolutivas independientes y esas diferencias
probablemente son un resultado de la coevolución conducida por diferencias en la composición genética de los
hospederos (McDonald et al., 1989a), similarmente González et al., (1998), agruparon aislados de Colletotrichum
lindemuthianum de diferentes estados de México dependiendo de su origen y su hospedero. De manera similar, el
análisis de diferentes aislados de M. graminicola de un campo de cuatro diferentes genotipos de hospederos de
diferente grado de resistencia, sugirió que el sistema de apareamiento podría tener un gran impacto dentro de la
selección natural sobre la estructura genética de poblaciones del hongo, pero no se pudo demostrar con el uso de
RFLP (McDonald et al., 1996). La selección parece operar en los DNAmt y nuclear de M. graminicola, por lo
que podría incrementar la frecuencia de genotipos en el curso de una estación (McDonald et al., 1999b).
2.5 Uso de marcadores de DNA en hongos fitopatógenos
Los estudios sobre la biología y genética en los hongos fitopatógenos se han basado en el análisis de sus
características morfológicas, bioquímicas y aloenzimas. Sin embargo, estos métodos han demostrado ser
insuficientes (Weising et al., 1995), en años recientes, la introducción de las técnicas de hibridación de DNA y
las que se basan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se han usado para tener un diagnostico muy
preciso de las enfermedades causadas por hongos (Erlich et al., 1991; Henson y French, 1993), para la
identificación y taxonomía (Cunfer y Ueng, 1999), la determinación de los modos reproductivos de hongos
asexuales (Taylor et al., 1999), su sistemática (Samuels y Seller, 1995; Bruns et al., 1995). Sin embargo, una de
las herramientas disponibles para hacer estudios sobre la genética de las poblaciones de los patógenos son los
marcadores de DNA (Rosewich y McDonald, 1994; McDonald, 1997), estos son las características de uno o más
loci del genoma en estudio, cuya variación es detectable por métodos analíticos (Winter y Kahl, 1995; Staub et
al., 1996; Jones et al., 1997).
2.5.1 Polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLPs)
El mapeo genético fue revolucionado por la realización de los RFLPs entre individuos, que podría ser
detectada en huellas usando sondas de DNA marcadas radioactivamente que híbridizan para una sola secuencia
blanco en el genoma (Botstein et al., 1980). El mapeo de los RFLP involucra los siguientes pasos generales: i)
Generación de las sondas, ii) Generación de una población segregante, iii) Identificación de polimorfismos entre
los padres mapeados o individuos de interés, iv) Determinación del genotipo de los individuos en la población
segregante, usando sondas que detectan polimorfismos y v) El análisis de los datos de segregación para producir
un mapa genético. Algunos de los pasos (ii, iv, v) podrían ser eliminados si el objetivo no es mapear, sino
determinar la diversidad genética en una población (Botstein et al., 1980; Staub et al., 1996; Rafalski et al.,
1996).
La técnica de RFLP, se ha utilizado para el estudio de las relaciones entre la patogenecidad y filogenía
de Leptosphaeria maculans (Koch et al., 1991), diversidad genética a nivel de un sólo campo de M. graminicola
(McDonald y Martinez, 1990b), en Bremia lactucae (Hulbert y Michelmore, 1988), P. infestans (Goodwin et al.,
1992), Mycosphaerella fijiensis (Carlier et al., 1994; Carlier et al., 1996), Rhyncosporium secalis (McDonald et
al., 1999a), Ustilago maydis (Valverde et al., 2000), para determinar la diversidad genotípica en M. graminicola
(Chen et al., 1994), para evaluar la similitud genética dentro de individuos (McDonald y Martinez, 1991), para
determinar la contribución de la reproducción sexual y asexual (McDonald et al., 1994).
En la determinación del flujo de genes en M. graminicola (Boeger et al., 1993), Phaeosphaeria nodorum
(Keller et al., 1997a), Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Rosewich et al., 1999b), Rhyzoctonia solani
(Rosewich et al., 1999a), para correlacionar el origen entre los hospederos, grupo de compatibilidad vegetativa
(VCG) y diferentes razas de Colletotrichum orbiculare (Correl et al., 1993) y así como también para hacer mapas
de ligamiento en Erysiphe graminis (Christiansen y Giese, 1990), en M. grisea (Dioh et al., 2000).
Las desventajas de los marcadores RFLPs es la gran cantidad de DNA genómico de alta calidad
requerida (1-10 mg), generación de sondas, clonación, etc., pero este método es conveniente por un gran número
de razones, ya que son codominantes, permitiendo la detección y caracterización de alelos múltiples en un locus
dentro de individuos de una población (Rafalski et al., 1996; Staub et al., 1996).
2.5.2 DNAs polimórficos amplificados al azar (RAPDs)
El uso de iniciadores de oligonucleótidos de secuencia arbitraria para la amplificación de segmentos de
DNA distribuidos al azar usando la PCR (Saiki et al., 1985) fue descrito por Williams et al., (1990) y Welsh y
McClelland (1990). Los productos son visualizados en geles de agarosa. Los avances han resultado como una
tecnología que puede ser rápidamente empleada por su simplicidad y por su amplia habilidad, ellos se
manifiestan en la presencia o ausencia de un producto (s) amplificado(s) (Williams et al., 1993). La facilidad de
su uso, bajos costos, de fácil acceso y su potencial de automatización son características atractivas (Rafalski et
al., 1996).
La utilización de RAPD en hongos fitopatógenos ha sido eficaz para la identificación de L. maculans
(Goodwin y Annis, 1991), M. fijiensis (Johanson et al., 1994), F. oxysporum f. sp. dianthi (Manulis et al., 1994),
linajes de F. oxysporum f. sp. canariensis (Plyler et al., 1999), determinar grupos virulentos de Puccinia triticina
(Kolmer y Liu, 2000), para determinar la diversidad genética de Erysiphe graminis (McDermott et al., 1992;
McDermott et al., 1994; Caffier et al., 1999), Pyrenosphora teres (Peever y Milgroom, 1994), F. oxysporum f.
sp. cubense (Koenig et al., 1997), Venturia inaequalis (Tenzer y Gessler, 1997), Setosphaeria turcica (Borchardt
et al., 1998), Eutypa lata (Péros et al., 1997; 1999), así como dentro de progenies de E. lata (Péros y Berger,
1999), para determinar grupos virulentos de F. oxysporum (Mes et al., 1999), para demostrar heterotalismo en M.
graminicola (Kema et al., 1996).
En la determinación de la estructura genética de Alternaria spp. (Peever et al., 1999), así como también
en su diferenciación genética (Peever et al., 2000), para determinar la variabilidad genética entre especies del
género Tilletia (Shi et al., 1996; Pimentel et al., 2000), la creación de mapas genéticos moleculares en
Pyrenophora teres f. sp. teres (Weiland et al., 1999), Pyricularia graminis (Zambino et al., 2000) y en
Magnaporthe grisea (Dioh et al., 2000).
Los RAPDs son marcadores dominantes, estos tienen algunas desventajas en comparación a los RFLP,
tales como la inhabilidad para la identificación de heterocigotos en poblaciones F2, poco reproducibles. Sin
embargo, proporcionan una tecnología innovadora para el mapeo de DNA y huellas genéticas por medio del uso
de la PCR. Las ventajas es que requieren cantidades extremadamente pequeñas de DNA las cuales pueden ser de
baja calidad, sino que también elimina la necesidad de huellas de DNA y el uso de radioactividad (Rafalski et al.,
1991; Waugh y Powell, 1992; Hadrys et al., 1992; Tingey y Tufo, 1993; Williams et al., 1993; Winter y Kahl,
1995; Rafalski et al., 1996).
2.5.3 Polimorfismos de la longitud de fragmentos amplificados (AFLPs)
La técnica de AFLP, consta de tres pasos principales: i) el DNA genómico es cortado con endonucleasas
de restricción (Eco RI y Mse I) y ligado a adaptadores específicos (Eco RI y Mse I), ii) amplificación por PCR de
los fragmentos cortados y iii) el análisis de los fragmentos amplificados en geles de poliacrilamida por medio de
radioisótopos (Vos et al., 1995) o tinción con plata (Zhong y Steffenson, 2000) y en geles de agarosa (Mueller et
al. 1996; Vandermark et al., 2000).
Los AFLP se han aplicado para determinar la diversidad genética en hongos micorrízicos (Rosendhal y
Taylor, 1997), en hongos que son cultivados por las hormigas Cryphomyrmex minutus (Müller et al., 1996),
entomopatógenos Nomuraea rileyi (Boucias et al., 2000ab). Sin embargo, recientemente se ha aplicados para
estudios en hongos fitopatógenos, como por ejemplo, para la detección de la diversidad genética de
Cladosporium fulvum y Pyrenopeziza (Majer et al., 1996), Colletotrichum lindemutianum (González et al.,
1998), Cercospora zea-maydis (Wang et al., 1998; Dunkle y Levy 2000), Septoria tritici (Schnieder et al., 1998),
Ophiosphaerella spp. (Wetzel et al., 1999), L. maculans (Pongam et al., 1999; Purwantara et al., 2000),
Macrophomina phaseolina (Vandermark et al., 2000), Cephalosporium maydis (Zeller et al., 2000) y Claviceps
africana (Tooley et al., 2000).
Para la identificación de aislados del género Colletotrichum (O´Nelli et al., 1997), del género Eutypa
(DeScenzo et al., 1999), para diferenciar los hongos Plespora papaveracea y Dendryphion penicillatum (Farr et
al., 2000), para identificar formas especiales de F. oxysporum (Baayen et al., 2000), para la caracterización de
híbridos naturales de P. infestans (Bonants et al., 2000), como marcadores filogenéticos en hongos del género
Ustilaginomycetos (Bakkeren et al., 2000), así como también, para la construcción de mapas de ligamiento de P.
infestans (Van der Lee et al., 1997), M. graminicola (Kema et al., 1999) y L. maculans (Pongam et al., 1998).
Una de las desventajas de los RAPD y AFLP es que son marcadores no específicos, por lo que puede
suceder algunos errores en la interpretación de los análisis por contaminación de DNA de bacterias (Dyer y
Leonard, 2000). Los AFLP generan cientos de marcas de DNA replicables, en un tiempo corto, los costos de su
eficiencia y resolución son más superiores que otros tipos de marcadores como los RFLP y RAPD, su facilidad
de automatización (Vos et al., 1995; Breyne et al., 1997; Simpson, 1997; Mueller y Wolfenbarger, 1999), dando
como resultado una técnica muy poderosa para estudios en hongos fitopatógenos.
Cuadro 1. Características y propiedades de distintas técnicas de marcadores de DNA. RFLP RAPD AFLP SSR
Principio Restricción por endonucleasas
Transferencia Souther Hibridación
Amplificación por PCR de
DNA con iniciadores al azar
Amplificación por PCR entre secuencias
simples repetidas espaciadas
Amplificación por PCR de repeticiones de secuencia simple
Tipo de polimorfismo
Cambios de una sola base
Inserciones Supresiones
Cambios de una sola base
Inserciones Supresiones
Cambios en una sola base
Inserción Deleción
Cambios de una sola base y de longitud de
las repeticiones Inserciones Supresiones
Abundancia genómica
Alta Alta Alta Alta
Nivel de polimorfismo
Medio
Medio
Alto
Alto
Herencia Codominante Dominante Dominante/Codominante Codominante
Número de loci
detectados
1-5
1-10
30-100
1 o más
Infor mación de secuencia
No No No Si
Dificultad técnica
Media Baja Media/Alta Baja
Uso de radioisótopos
Si/No
No
Si/No
Si/No
Costos de iniciación
Regulares
Bajos
Altos
Regular
Fuente (Rafalski et al., 1996; Staub et al., 1996; Winter y Kahl, 1995; Weising et al., 1998).
RFLP: polimorfismo de fragmento de restricción; RAPD: DNA polimórfico amplificado al azar; AFLP: polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados; SSR: secuencias repetidas simples.
2.5.4 Microsatélites o secuencias repetidas simples (SSRs)
El DNA repetitivo está clasificado dentro de tres principales clases según Tautz y Renz, (1984): i) DNA
satélite el cual consta de más de 300 pares de bases (pb), ii) minisatélites, el cual consta de monómero que
comprenden de 9-100 pb y iii) microsatélites o secuencias repetidas simples que son unidades repetidas de 1-6 pb
en longitud, los microsatélites están dispersados en los genomas.
Los métodos más comunes para la identificación de SSRs incluyen los siguientes pasos i) construcción
de bibliotecas genómicas, ii) prueba de la biblioteca por hibridación, iii) determinación de la secuencias de DNA
de los clones positivos, iv) diseño de iniciadores de locus específicos, v) análisis por PCR y la identificación de
los polimorfismos y vi) mapeo de los marcadores polimórficos (Weising et al., 1998).
En 1993, los oligonucleótidos complementarios de microsatélites fueron introducidos como iniciadores
en la PCR “iniciador de microsatélite-PCR” (MP-PCR), (Meyer et al., 1993), una técnica similar “Inter-SSR-
PCR”, usa microsatélites anclados a 5´ o 3´ de los nucleótidos repetidos (GG[CA]7), los cuales son visualizados
en geles de acrilamida (Zietkiewicz et al., 1994), otras de las variantes fue la combinación de iniciadores de
microsatélite 5´ con un iniciador arbitrario (decámero) “microsatélites polimórficos amplificados al azar”
(RAMPs) (Wu et al., 1994), otra de las técnicas es el uso DNA mancha e hibridación de productos de RAPDs
con sondas de microsatélites complementarios, “oligonucleótidos polimórficos de microsatélites amplificados al
azar” (RAMPO) (Richardson et al., 1995) o “secuencias de microsatélites amplificados al azar” (RAMS) (Ender
et al., 1996).
El uso de los microsatélites como marcadores de DNA se implementaron en hongos del género
Trichoderma (Meyer et al., 1992a), en hongos cultivados por las hormigas (Villesen et al., 1999), en hongos
fitopatógenos, los han usado para determinar la diversidad genética de C. gloesporoides (Braithwaite y Manners
1989), identificación de cepas y especies de Aspergillus, Penicillium y Trichoderma (Meyer et al., 1991), grupos
agresivos de L. maculans (Meyer et al., 1992b), Ascochyta rabie (Weising et al., 1991) y Podospora anserina
(Osiewacz et al., 1997).
Para determinar la variabilidad genética de patotipos de Sclerospora graminicola (Sastry et al., 1995),
para determinar la diversidad genética en A. rabie a nivel de un solo campo (Morjane et al., 1994), como también
de una región (Udupa et al., 1998), en la determinación de la herencia Mendeliana entre aislados virulentos y no
virulentos de A. rabie (Gestlinger et al., 1997a), determinar la variación alélica del locus ArMS1 (Gestlinger et
al., 1997b). En poblaciones asexuales de Stagonospora spp. y Septoria para determinar que es una fuente de
variabilidad genética (Czembor y Arseniuk, 1999) y en progenies sexuales del hongo P. nodorum (Czembor y
Arseniuk, 2000).
El uso de microsatélites específicos se iniciaron en el género Epichloe, en estudios de su diversidad
genética (Groppe et al., 1995), en M. fijiensis (Neu et al., 1999) y V. inaequalis (Tenzer et al., 1999). Los
microsatélites tiene las ventajas de ser: específicos, codominantes de un solo locus, de fácil manejo, altamente
reproducibles, alta calidad de información alélica, uso de la PCR y requerimiento de pequeña cantidad de muestra
(Weising et al., 1998; Rosewich y McDonald, 1994).
2.6 El cultivo de plátano (Musa spp.)
La planta de plátano es una herbácea triploide perenne de las regiones tropicales y subtropicales
(Gowen, 1995). Dos especies diploides Musa acuminata Colla (A) y M. balbisiana Colla (B) son los ancestros
comunes de todos los cultivares triploides conocidos (Simmonds y Shepherd, 1955).
El plátano (Musa spp.) es la segunda fruta tropical más importante por su consumo a nivel mundial
después de los cítricos (Hallam, 1995), así como por su contenido de fuentes de carbono, almidón, vitaminas y
minerales que son consumidos como fruta fresca (Robinson, 1996), la producción anual en el mundo asciende a
los 80 millones de toneladas al año, de la cual solamente el 15% se exporta y el resto es para el consumo local
(FAO, 1998). Sin embargo, la producción de este vital fruto es afectado por plagas y enfermedades (Cuadro 2),
las cuales pueden causar severos daños en las plantaciones (Robinson, 1996).
Cuadro 2. Principales plagas y enfermedades que afectan al cultivo de plátano (Musa spp.) a nivel mundial.
2.7 Sigatoka negra Mycosphaerella fijiensis Morelet
La enfermedad que actualmente provoca más daños a nivel mundial en plantaciones de plátano es la sigatoka negra, esta se encuentra en todas las regiones productoras (Fig. 1). Es causada por el hongo ascomiceto M. fijiensis, provoca necrosis y reducción del área foliar, dando como resultado un abatimiento del rendimiento entre 33 y 50% (Stover, 1983; Mobambo et al., 1993).
Uno de los métodos de control de la enfermedad es por medio de la obtención de plantas híbridas (Rowe
y Rosales, 1996 y Vuylsteke et al., 1997) y transgénicas resistentes (Mason et al., 1995; Sagí et al., 1995; Pérez
et al., 1999 y Becker et al., 2000), ha sido uno de los objetivo prioritario durante varios años. Esta enfermedad es
controlada principalmente con la aplicación de fungicidas (Stover, 1990), de diferente grupo químico (Cuadro 3).
Esto ha originado que además del incremento en los costos de producción del cultivo, se estén presentando
problemas de contaminación ambiental, de salud humana y de resistencia a fungicidas, debido a la gran cantidad
de productos químicos y de citrolina que se depositan en los huertos de plátano (Henriques et al., 1997).
Cuadro 3. Fungicidas usados en las plantaciones de plátano en América Latina.
Bitertanol Chlorothanolonilo
Tridemorph Benomyl
Organismo Distribución Referencia
Bacterias Pseudomonas solanacearum
Asia, América
Buddenhagen y Kelman 1964.
Insectos Cosmopolites sordidus
Asia, África, América
Frogatt, 1925.
Hongos Mycosphaerella musicola M. fijiensis M. eumusae Fusarium oxysporum f sp. cubense Colletotrichum musae
Asia, África, América y Oceanía Asia, África, América y Oceanía Asia y África Asia, África, América y Oceanía Asia, África, América y Oceanía
Stover, 1962a. Mourichon y Fullerton, 1990. Carlier et al., 2000 Stover, 1962b Meredith, 1960
Nematodos Pratylencus spp. Helicotylencus multicinctus Meloidogyne spp. Radopholus similis
Asia, África, América y Oceanía Asia, África, América y Oceanía Asia, África, América y Oceanía Asia, África, América y Oceanía
Gowen, 1994 McSorley, 1994 De Waele y Davide, 1998. Gowen, 1994
Virus Virus del Bunchy Top (BBTV) Virus del mosaico del plátano (BMV) Virus del mosaico de la bráctea (BBrMV)
Virus del estriado del plátano (BSV)
Asia, África y Oceanía Asia, África, América y Oceanía Asia, África Asia, África, América y Oceanía
Dale, 1987 Niblett et al., 1994. Mangaye y Espino, 1990. Lockhart, 1986.
Propiconazol Thiobendazol
Mancozeb Metil tiofeno
Henriques et al., 1997. Enviromental Toxicology and Chemistry.
Figura 1. Distribución de Mycosphaerella fijiensis en el mundo (Stover, 1980; Mourichon y Fullerton, 1990).
Existen evidencias de ciertos plaguicidas que pueden causar toxicidad aguda y actuar como inductores
moleculares de la actividad celular responsable de las funciones neuroendocrinas que regulan el control hormonal
de la reproducción, diferenciación del sexo, proliferación de células y competencia del sistema inmune
(Chambers y Yarbrough, 1982). La forma en que los humanos y la fauna son expuestos a los plaguicidas es por
medio de las aplicaciones aéreas, productos alimenticios y agua potable contaminada. En plantaciones de plátano,
la aspersión aérea es una técnica rápida para aplicar plaguicidas en áreas grandes; sin embargo, el escurrimiento
de los sitios de almacenamiento y pistas de aterrizaje, así como la deriva de agroquímicos de los sitios tratados
pueden contaminar los sistemas acuáticos y terrestres cercanos (Henriques et al., 1997).
El propiconazol se ha usado por casi dos décadas para el control de sigatoka negra en México. Este fungicida puede encontrarse en concentraciones altas en agua de drenes adyacentes a las plantaciones de plátano, tal y como ha sido demostrado en áreas bananeras de Costa Rica, en donde se han detectado concentraciones hasta de 24.2 µg/l de agua (Mortensen et al., 1998). Por otra parte, a partir de 1995 el mancozeb ha sido un fungicida clave en los programas de control a base de protectantes en México.
En Costa Rica, después de una aplicación se han registrado residuos de mancozeb de
0.77 a 2.38 µg/cm² en canales (Mortensen et al., 1998). Los fungicidas son aplicados uniformemente en las plantaciones plataneras y tienen un contacto directo con muchos organismos terrestres y acuáticos. El clorotalonil es conocido a ser tóxico a invertebrados
acuáticos y peces, mientras que el mancozeb posee propiedades carcinógenas y el benomyl es teratogénico (Lacher et al., 1997).
Por otra parte, el uso intensivo de algunos fungicidas de acción sistémica ha provocado problemas de
resistencia en el hongo M. fijiensis, causante de la sigatoka negra (Fullerton y Tracey, 1984; Romero y Sutton,
1998). Esto se atribuye a que ciertas clases de fungicidas sistémicos (benzimidazoles y triazoles), poseen una
actividad elevada en dosis bajas y actúan en un solo sitio del patógeno. Los problemas de resistencia han tenido
como consecuencia que el combate de sigatoka negra se vuelva más complejo y costoso, debido a la pérdida de
sensibilidad de los fungicidas y por lo tanto se requiere un mayor número de aplicaciones y más recientemente a
los triazoles (Romero y Sutton, 1998).
La evaluación de nuevas moléculas de fungicidas con acción diferente a las actuales y
sin o poco efectos nocivos al medio ambiente y salud humana es prioritario para la búsqueda
de nuevas alternativas de manejo de sigatoka negra. Dentro de este grupo de fungicidas se
encuentra el azoxistrobin que es seguro desde el punto de vista ambiental.
En la actualidad, el número de fungicidas sistémicos utilizados para el control de sigatoka negra es
reducido, por lo que es de suma importancia un manejo racional de los mismos para darles una vida mayor útil,
manteniéndose de esta manera una eficacia apropiada contra el hongo (Stover, 1990).
2.7.1 Identificación y clasificación de Mycosphaerella fijiensis
El ciclo de vida de M. fijiensis esta caracterizado por dos estados: el estado perfecto e imperfecto
(Alexoupoulos y Mims, 1979). Ambos estados son importantes en la infección a su hospedero.
Estado perfecto
Clase: Ascomycetae
Subclase: Eu-ascomycetae
Orden: Pseudospaeriles
Familia: Mycosphaerellaceae
Este estado esta caracterizado por la formación de peritecios, espermagonios y ascosporas. El peritecio y
espermagonio se encuentran en proporciones variables durante los estados 2 y 3 (ver capitulo 2.4.2 Ciclo de la
enfermedad de la sigatoka negra). Los espermagonios son más abundantes en la superficie adaxial de la hoja,
ellos frecuentemente se desarrollan en la cámara subestomal del estoma, los espermagonios maduros contienen
espermatia hialina (Meredith y Lawrence, 1969).
Las diferencias en el estado sexual es muy pequeña, de tal manera que las ascosporas entre M. fijiensis y
M. musicola son indistinguibles, las cuales son liberadas de los pseudotecios. El tamaño de las ascosporas de M.
fijiensis tienen un rango de 10.8 a 15.5 x 2.6 a 4.8 µm con un promedio de 13.1 x 3.8 µm, mientras que el tamaño
de las de M. musicola es de 14.0 a 17.6 x 3.1 a 4.5 µm con un promedio de 15.5 x 3.3 µm, éstas son usualmente
hiliadas y con un septo, con una pequeña constricción en el septo (Mülder y Stover, 1976).
La morfología del estado asexual de M. fijiensis (conocido como Paracercospora fijiensis Morelet). Los
conidios son hialinos, obclavados a cilíndricos, rectos o ligeramente curvos, 6 a 9 septos, delgados en el ápice y
más anchos en la base con una cicatriz en el hilum basal del conidio (punto de unión entre el conidio y el
conidióforo), miden de 30 a 132 µm de longitud y 2.5 a 5 µm en la parte más ancha son de forma recta o
ligeramente curveados con 6 a 9 septos (Fig. 2). En cambio los conidios de M. musicola son normalmente rectos
con máximo de 6 septos y carecen de cicatriz en la base del conidio. Los conidióforos pueden emerger
directamente por el estoma de manera individual o en grupos, o bien pueden formar fascículos sobre un estroma
erumpente de color oscuro (Mülder y Stover, 1976).
Estado imperfecto:
Estado imperfecto: Deuteromycetae (Hongo imperfecto)
Clase: Hyphomycetae
Orden: Hyphomycetales
Familia: Dematiaceae
Genero: Cercospora
Los pseudotecios son las estructuras femeninas y aparecen en los estados 4 y 5 que produce M. musicola,
mientras que en M. fijiensis aparecen en los estados 5 y 6, los cuales son anfígenos, globosos con un ostiolo
esférico papilado, de paredes pardo oscuras y células poligonales, tienen un diámetro de 42 a 81 µ y una media de
57 µ (Mülder y Stover, 1976).
Los espermagonios constituyen la parte masculina, éstos producen los espermacios que actúan como
gametos masculinos y su función es la de fertilizar a los pseudotecios. Una vez realizada la fertilización, se
desarrollan en su interior las ascas que contienen a las ascosporas en un número de ocho (Stover, 1980).
Figura 2. Conidios de Mycosphaerella fijiensis (Meredith y Lawrence, 1969).
Las hojas densamente infectadas, liberan ascosporas durante un período de dos a cuatro semanas más
que cuando se cortan (saneamiento) y se colocan en el suelo (Stover, 1980). Estas, son las principales fuentes de
inóculo de la enfermedad (Stover, 1980), las cuales son diseminadas por el viento y depositadas en las hojas más
jóvenes, principalmente en la hoja “cigarro” y en las cuatro hojas más jóvenes (Mülder y Holliday, 1974; Mülder
y Stover, 1976).
Recientemente, Carlier et al., (2000), descubrieron una nueva enfermedad similar a la sigatoka negra,
esta es causada por el hongo Mycosphaerella eumusae, los conidios son fusiformes, hialinos, tienen tres a cinco
septos y con una medida de entre 21.2 y 41.6 µm de longitud. Este estado fue identificado como Septoria, el
peritecio tiene un diámetro de 42 a 51 µm, este fue amfigeno, de forma irregular y globosa, con un ostiolo corto,
las ascósporas fueron de 12.0 a 16.5 x 3.0 a 4.5 µm, este hongo fue identificado en el Sureste de la India, Sry
Lanka, Tailandia, Malasia, Vietnam, Mauritus y Nigeria. Por último es necesario realizar investigaciones sobre
todos los aspectos de la biología de este hongo, incluyendo estudios de las interacciones hospedero-patógeno y
análisis de la estructura de poblaciones.
2.7.2 Desarrollo de los síntomas de la enfermedad de la sigatoka negra
Después de la germinación de las ascósporas y la penetración de la hifa por los estomas de las hojas de
las plantas, seis estados de los síntomas de la enfermedad se han reconocido (tres de raya, una de transición y dos
de mancha) (Meredith y Lawrence, 1969; Fouré, 1982):
Estado 1. Aparecen pequeñas puntuaciones de color amarillo pálido de 0.25 mm de diámetro que son visibles por
el envés de la hoja.
Estado 2 . Los puntos se alargan como rayas de 1 mm de ancho por 2 mm de largo, generalmente de color castaño
y son visibles por el haz.
Estado 3. Las rayas se alargan hasta alcanzar 20-25 mm de longitud y 2 mm de ancho; toman una coloración
marrón oscuro y son visibles sobre el envés como rayas amarillas.
Estado 4. Sobre el envés, las rayas se ensanchan, se tornan de un color marrón oscuro y son rodeados por una
zona amarilla pálida. Puede considerarse el primer estado de mancha.
Estado 5. Los centros de color negro de las manchas empiezan a colapsarse mientras rodean el tejido como un
halo amarillo.
Estado 6. Los centros de las manchas secas se ponen de color gris claro y son rodeados por un anillo negro bien
definido, el cual también es rodeado por un halo amarillo.
Figura 3. Ciclo de vida del hongo Mycosphaerella fijiensis causante de la sigatoka negra (González, 1975).
2.7.3 Interacción Musa-Mycosphaerella fijiensis
La resistencia a M. fijiensis es genéticamente controlada, los análisis genéticos del efecto del patógeno se
ha llevado en progenies diploides y tetraploides de cruzas obtenidas de triploides x diploides (Vuylsteke et al.,
1993). La resistencia a sigatoka negra es principalmente el resultado de la interacción de alelos recesivos en un
locus mayor (bs1) y de dos genes menores independientes con efecto aditivo (bsri) (Ortiz y Vuylsteke, 1994).
Se han reportado tres distintos niveles de respuesta del hospedero a M. fijiensis y se han definido según
Ortiz y Vuylsteke, (1994): como susceptible, poco susceptible y parcialmente resistente. Estas respuestas
diferentes son el resultado de la segregación de tres loci independientes. Los diploides con dos alelos favorables
en estado homocigoto (bs1/bs1) podrían tener una resistencia parcialmente o una menos susceptible. Un modelo
similar explica la resistencia parcial exhibida por los tetraploides a causa de la dosificación del efecto de las
cuatro copias del alelo de la resistencia bs1 (Ortiz y Vuylsteke, 1994).
La acción del locus de la resistencia bs1 en híbridos diploides y tetraploides de plátano, fue demostrado
que su efecto comb inado de ploidía y resistencia a M. fijiensis fue parcialmente responsable para la característica
cuantitativa de variación en el rendimiento. Como un resultado del gene de la interacción en el locus bs1 de
resistencia, los fenotipos de la resistencia parcialmente y menos susceptibles demostraron un alto rendimiento
(Craenen y Ortiz, 1996). La (s) acción (es) en el locus bs1 podría proveer una resistencia durable a M. fijiensis por
un retardo en el desarrollo de la enfermedad sobre la planta hospedera (Craenen y Ortiz, 1997). Ortiz y Vuylsteke
(1994) consideran como un tipo de resistencia vertical el contenido de polifenoles presentes en las hojas, la cual
desaparece cuando un patotipo virulento afecta al hospedero.
2.7.4 Fitotóxinas de M. fijiensis
El primer reporte de la actividad fototóxica de extractos crudos de M. fijiensis fue realizado por Molina y
Krausz (1989), quienes probaron diferentes extractos del hongo sobre hojas de 7 diferentes cultivares (enano
gigante, plátano cuerno, 3A-105-7, Sabá, 3A -106-6, SH 3437 y IV-9), encontraron que el cultivar enano gigante
presentó la mayor sensibilidad a dichos extractos, tal y como se observa en campo, posteriormente Stierle et al.,
(1991), encontraron que el más abundante y fitotóxico de los componentes aislados del extracto del hongo M.
fijiensis fue 2,4,8-trihidroxitetralon, el cual indujo las lesiones necróticas a 5 µg/5 ml en menos de 12 h sobre
cultivares sensibles. Otro de los compuestos encontrados fue la juglona en una cantidad menor, algunas de la
fitotóxinas aisladas son melaninas, las cuales hacen de este hongo como único dentro de los patógenos que la
producen.
Recientemente Hoss et al., (2000), usaron distintos cultivares de Musa: dominico Hartón, Cachaco,
Yangambi km 5, investigaron las interacciones de los metabolitos secundarios (flaviolona, 2-hidroxijuglona,
juglona y 2,4,8-trihidroxitetralona) del patógeno, detectando que en el cultivar Yangambi km 5 se activa una
acumulación de fenilalanina amonialiasa (PAL) y una acumulación subsecuente de substancias que bloquean el
crecimiento del hongo. Estos resultados podrían ser usados para la inducción de mecanismos de defensa
correlacionados con reacciones hipersensitivas después del ataque del patógeno.
El uso de las fitotóxinas de M. fijiensis para la selección de cultivares de plátano resistentes a sigatoka
negra es muy importante, dentro de los ensayos para determinar la resistencia de los cultivares a nivel de
invernadero, reduciendo costos y manejo de cultivares introducidos en nuevas áreas de producción (Harelimana
et al., 1997), así como también la aplicación de secciones de micro cortes de plátano por medio de cultivo de
tejidos para la regeneración de plantas resistentes a sigatoka negra (Okole y Schulz, 1996).
2.7.5 Variabilidad patógena de M. fijiensis
La variabilidad patógena de M. fijiensis fue demostrada por Fullerton y Olsen (1995), quienes utilizaron
sesenta y seis aislados obtenidos de diferentes hospederos de Musa procedentes de diferentes países y localidades
productoras. Este estudio demostró que algunas cepas que son virulentas sobre un hospedero no lo fueron sobre
otro. Algunos hospederos fueron susceptibles prácticamente a todos las cepas, mientras otros como T8 y Calcutta,
fueron resistentes a algunos aislados pero susceptibles a otros. Las cepas de Papua, Nueva Guinea y de las Islas
del Pacífico mostraron un amplio rango de diversidad patogénica sobre los cultivares comúnmente usados como
fuente de resistencia de programas de mejoramiento como Calcutta, Paka y Pisang Lilin.
Otro de los estudios sobre la variabilidad patógena lo realizaron Romero y Sutton (1997), quienes
evaluaron la reacción de dos híbridos (FHIA 1 y FHIA 2) con resistencia y dos cultivares altamente susceptibles
(enano gigante y falso cuerno) a M. fijiensis, determinaron su reacción con diferentes aislados del hongo y a tres
temperaturas (22, 26 y 30°C), pudieron concluir que los híbridos mostraron resistencia a todos los aislados y en
las tres temperaturas, mientras que los susceptibles fueron afectados por todos los aislados y en las tres
temperaturas, provocando mayor daño a 26°C, tal y como se ha reportado como la temperatura para el desarrollo
óptimo de la enfermedad en genotipos susceptibles de Musa (Stover, 1983; Jacome y Schuh, 1992).
2.7.6 Marcadores de DNA en Mycosphaerella spp.
La utilización de las técnicas moleculares en el estudio del genoma de Mycosphaerella spp., se convirtió
en el objetivo de varios proyectos de investigación. La PCR fue usada para amplificar el espacio 1 interno
trascrito (ITS) de la región del DNA ribosomal para distinguir a M. fijiensis y M. musicola (Johanson y Jeger,
1993), utilizando los iniciadores MF137: 5´ GGCGCCCCCGGAGGCCGTCTA 3´ para detectar a M. fijiensis y
el iniciador MM137: 5´ GGCGCCCCCGGAGGTCTCCTT 3´ para M. musicola, detectaron a ambos patógenos
estando presentes en las hojas de plátano y a algunos otros microorganismos como M. musae, M. minima,
Aspergillus niger, Botryodiploida theobromae, F. moniliforme y C. gloesporoides. Por lo que se concluye como
una técnica muy sensible y confiable para la detección de estos dos patógenos que afectan a los cultivos de
plátano.
La identificación de la variabilidad genética se ha demostrado por varias técnicas como RFLPs. Carlier
et al., (1994), quienes identificaron una importante variabilidad genética entre las poblaciones de M. fijiensis, M.
fijiensis var. difformis y M. musicola de diferentes regiones geográficas (Sudeste Asiático, incluyendo Filipinas y
Papua Nueva Guinea, Islas del Pacífico, África y América Latina). Los niveles más altos de diversidad genética o
alélica se hallaron en las dos poblaciones del sudeste asiático. Estos resultados concuerdan con la hipótesis según
la cual M. fijiensis sería originaria del Sudeste Asiático (Stover, 1978; Mourichon y Fullerton, 1990). Otros de los
resultados sobresalientes fueron que los sinónimos de M. fijiensis y M. fijiensis var. difformis no reflejaron una
variación genética, por lo que se descarta que M. fijiensis var. difformis , sea una variedad, como antes ya lo
habían identificado (Mulder y Stover, 1976; Pons, 1987).
La utilización de RAPDs (Johanson et al., 1994), demostraron la diferencias de los DNAs genómicos de
M. fijiensis, M. musicola y otras especies de Mycosphaerella presentes en las hojas de las Musaceas como M.
musae y M. minima , dando como resultado distintas bandas alélicas, usando el iniciador RC07
(TGCGACAATC), el cual amplificó fragmentos de 1250 pb de todos los aislados de M. fijiensis obtenidos de 11
regiones distintas. Estos fragmentos no se presentaron en las otras especies de Mycosphaerella, sirviendo esta
técnica para realizar diagnósticos precisos de este hongo, semejante a la reportada por Johanson y Jeger, (1993),
quienes usaron la PCR.
El estudio realizado por Müller et al., (1997), quienes utilizaron huellas genéticas de DNA con
oligonucleotidos sintéticos repetitivos simples tales como (CA)8 o (CAA)5, obteniendo una diversidad genética
entre escalas macro y microgeográficas, así como también entre una lesión, entre lesiones de una planta, entre
plantas, diferentes cultivares y en distintas localidades geográficas, lo que demuestra que el estado sexual del
hongo representa una fuente importante para la variación genética, ya que es un hongo heterotálico (Mourichon y
Zapater, 1990).
Los estudios realizados por Neu et al., (1999), ellos obtuvieron once iniciadores de microsatélites,
usándolos en dos poblaciones de M. fijiensis (Nigeria y México). El rango del número de alelos fue de 2 a 7 por
locus. La diversidad alelica dentro de cada región fue comparativamente baja. Todos los loci fueron polimórficos
entre las dos poblaciones y solamente un alelo en un locus fue común entre los aislamientos en ambas regiones.
Todos los aislamientos tuvieron diferentes haplotipos de multilocus. De acuerdo con la propagación sexual del
patógeno, se concluye que los polimórfismos entre los aislamientos de Nigeria y México tienen diferentes
haplotipos y que la migración entre continente es rara ya que la reproducción sexual en este hongo es
predominante, quienes concuerdan también con los resultados obtenidos por Carlier et al., (1996) por medio de
marcadores RFLP.
Recientemente Carlier et al., (2000), descubrieron un nuevo hongo en el sureste y suroeste de Asia y
África (India, Sry Lanka, Tailandia, Malasia, Vietnam, Mauricios y Nigeria), que causa daños muy similares a M.
fijiensis. Ellos lo nombraron Mycosphaerella eumusae, se estudiaron a nivel del ITS diferentes hongos presentes
en las hojas de plátano (M. fijiensis, M. musicola, M. musae y Phaeoseptoria musae), los análisis filogenéticos
confirmaron que M. eumusae está más cercano a M. fijiensis, por lo que señalan como una enfermedad
potencialmente importante.
La poca información existente sobre la influencia del manejo del cultivo y su repercusión en la
diversidad genética de M. fijiensis abre la posibilidad de realizar estudios para poder dar respuesta a este tema de
investigación, partiendo de otros modelos ya existentes como es el caso de P. infestans (Fry et al., 1992;
Goodwin, 1997), Alternaria alternata (Adachi et al., 1996) y B. cinerea (Yourman et al., 2000), dan la
posibilidad de poder estudiar este tópico en el hongo causante de la sigatoka negra del plátano, ya que McDonald,
(1997), en su revisión indica que los hongos fitopatógenos presentan una fuerte selección dependiendo del
manejo del cultivo, principalmente la aplicación de fungicidas.
III MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Lugar de realización
El trabajo experimental se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular y Cultivo de Tejidos
Vegetales de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima ubicado en
Tecomán, Colima a 18° 54’ L.N. y a los 103°52’ L.W. y 33 msnm (SPP-INEGI, 1995).
3.2 Muestreo
Muestras de hojas infectadas por el hongo M. fijiensis en los estados 5 y 6 de desarrollo de acuerdo a la
escala de Fouré (1982) fueron colectadas de plantas con manejo con el tipo de muestreo de cinco de oros, con tres
tipos de manejo: rústico (R), semintensivo (SI) e intensivo (IN) (Cuadro 4), de diferentes lugares de la zona
platanera de la región del pacífico-centro (Fig. 4). Estas fueron colocadas en bolsa de papel para su transporte al
laboratorio.
Figura 4. Mapa de las localidades muestreadas para el aislamiento de Mycosphaerella fijiensis.
Cuadro 4. Características de los huertos de plátano cultivar enano gigante que fueron muestreados para el aislamiento de Mycosphaerella fijiensis.
Tipo de manejo Lugar
Intensivo (IN) Riego presurizado subfoliar.
Deshoje cada 2 semanas.
Deshije cada 2 semanas.
35 aplicaciones de químicos para el control de la sigatoka negra.
3 aplicaciones de herbicidas al año.
Una fertilización cada 2 meses.
Colomos, Colima
Cerro de Ortega, Colima
Semintensivo (SI)
Riego rodado cada 21 días.
Deshoje cada mes.
Deshije cada 4 meses.
15 aplicaciones de químicos para el control de la sigatoka negra. Control de
malezas manual y una aplicación de herbicida.
Dos aplicaciones de fertilizantes al año.
Armería, Colima
Coahuayana, Michoacán
Caleras, Colima
Rústico (R)
Riego rodado cada 21 días.
Deshoje cada 2 meses.
Deshije cada 4 meses.
No hay control químico de la sigatoka negra.
Control de malezas manual.
Dos aplicaciones de fertilizantes al año.
INIFAP-Tecomán
Puerta de Caleras, Colima
Asmoles, Colima
3.3 Aislamiento de M. fijiensis
Las muestras de hojas obtenidas de campo fueron cortadas en trozos de 15x15 cm, luego se enjuagaron
con agua corriente y colocadas individualmente dentro de bolsas de plástico junto con una toalla de papel
húmeda. Estas fueron incubadas durante 48 horas en cámara de crecimiento (Revco) a temperatura de 26 ± 1°C
con 12 horas luz, para uniformizar la maduración de los peritecios y su posterior descarga de ascosporas.
La descarga de ascosporas se realizó mediante el método propuesto por Stover (1976). De cada muestra
de hoja incubada, se cortaron 4 trozos circulares de aproximadamente 1.0 cm de diámetro y se engraparon en
papel filtro Wathman No. 2 de 9 cm de diámetro. Luego, bajo condiciones asépticas en cámara de flujo laminar,
las muestras de tejido con el papel saturado en humedad fueron colocadas en las tapas de cajas de petri y sobre
ellas las bases de éstas, conteniendo 15 g/l de agar-agar esterilizado. De esta manera, la parte superior de las hojas
quedó frente al medio de cultivo, permaneciendo así durante 24 horas a 26 ± 1°C en cámara de crecimiento y con
un fotoperiodo de 16 horas luz (Revco). Después, con ayuda del microscopio estereoscópico, se localizaron en el
agar las ascosporas descargadas por el estallido de los peritecios, causado por la presión de turgencia inducida por
la saturación de humedad.
Las ascosporas fueron capturadas con aguja de disección estéril y colocadas en cajas petri conteniendo el
medio nutritivo de papa dextrosa agar (PDA) a 30 g/l, esterilizado a calor húmedo (121°C, 1.2 kg cm-2) por 15
min. Luego, las cajas fueron incubadas en cámara de crecimiento (Revco) a 27 ± 1°C en oscuridad, hasta la
aparición de las colonias del hongo (Stover, 1976) y posteriormente fueron almacenadas en glicerol al 15% a
21°C (Carlier et al., 2000).
3.4 Cultivo de M. fijiensis en medio líquido
Para la producción de micelio, se utilizó medio líquido caldo V8 (300 ml de jugo V8 (Herdez), 3 g de
CaCO3 por litro, pH 6.0). El medio se distribuyó en volúmenes de 50 ml en matraces erlenmeyer de 250 ml y fue
esterilizado a calor húmedo por 15 min (121°C, 1.2 kg cm-2). Posteriormente, en cada matraz fueron sembradas 4
colonias jóvenes y vigorosas del hongo de 15 días de edad, de aproximadamente 0.5 cm de diámetro, obtenidas
de cultivos monospóricos del medio PDA. Los cultivos se incubaron en un agitador orbital (Lab-Line) en
oscuridad a 150 rpm y 26 ± 1 °C durante 10 días según Carlier et al., (1996).
3.5 Extracción del DNA genómico de M. fijiensis
Para la extracción del DNA genómico de los aislados monospóricos de M. fijiensis se utilizó el método
descrito por Reader y Broda (1985). El micelio producido en medio líquido caldo V8 después de 10 días de
incubación fue colectado por centrifugación y posteriormente lavado en 5 ml del amortiguador TES (1 M Tris -
HCl, pH 8.5, 5 M NaCl y 0.5 M EDTA) y enjuagado con agua destilada desionizada estéril. El micelio libre de
exceso de TES y medio de cultivo fue colocado en tubos de ensaye de plástico estériles, los cuales se sellaron con
película plástica, posteriormente fueron liofilizados durante 96 h a -49 ± 1°C y 47 x 10-3 mbares de vacío en una
liofilizadora digital (Lyph-Lock, Labconco, Inc).
El micelio liofilizado fue molido dentro de un mortero frío en presencia de nitrógeno líquido hasta
obtener un polvo fino. Muestras de 40 mg del polvo se colocaron en tubos eppendorf estériles de 2.0 ml
conteniendo 1000 µl del amortiguador de extracción (200 mM Tris -HCl, pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA,
PVP 1% y SDS 1%), luego se incubaron a baño maría durante 30 min con agitaciones constantes, posteriormente
se les adicionó 1 vol de la solución fenol-cloroformo -alcohol isoamílico (25:24:1) y se mezclaron hasta formar un
homogenizado; enseguida se centrifugó a 12,000 rpm durante 20 min a 4°C. La fase acuosa obtenida fue
transferida a un tubo eppendorf y se le adicionaron 0.1 vol de acetato de sodio 3.0 M pH 5.2, se agitó suave y se
le adicionó 0.6 vol de isopropanol frío, se incubó en frío para la formación de las hebras del DNA y se centrifugó
a 12, 000 rpm durante 5 min. El sobrenadante se decantó y quedó la pastilla del DNA, esta se lavó con 500 µl de
etanol 70% durante dos veces, posteriormente fue secada al vacío durante 20 min en el equipo (HetoDry Gel,
Heto Lab Equipment), las pastilla se resuspendió en 400 µl de TE (Tris -EDTA).
Al DNA extraído se le adicionó 4 µl RNasa, la mezcla se incubó durante 30 min a 37° C, posteriormente
fue adicionada una cantidad de 500 µl de fenol-cloroformo y se mezcló durante 1 min, se centrifugó durante 5
min, se tomó la fase acuosa y fue extraído dos veces con la solución de fenol (como ya se indicó anteriormente),
después fue precipitado con 500 µl de isopropanol frío, se mezcló por inversión y se centrifugó durante 5 min. El
sobrenadante fue desechado y la pastilla se lavó dos veces con 500 µl de etanol al 70% enseguida la pastilla fue
secada al vacio como anteriormente se indicó y por último la pastilla se resuspendió en 40-80 µl de agua
desionizada estéril dependiendo su tamaño, se cuantificó la cantidad de DNA de todas las muestras en un gel de
agarosa al 0.8% comparada con un DNA estándar, por último se mantuvieron las muestras a 4°C para su
conservación.
3.6 Marcadores RAPDs en M. fijiensis
Para determinar la diversidad genética de los aislamientos de M. fijiensis, el DNA extraído (50 ng/ìl) fue
analizado por la técnica de los RAPD con la ayuda del termociclador (Robo cycler gradient 40, Stratagene). La
mezcla de reacción se realizó según Williams et al., (1990); cada una de las muestras tuvo un volumen final de 25
µl conteniendo: 50 ng de DNA templado, 1.5 mM MgCl2, 1.0 mM dNTPs (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 200
ìM de cada uno de los iniciadores (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) y por último dos gotas de aceite mineral para evitar la evaporación de la mezcla de reacción
(Sigma BioScience, St. Louis, MO).
Las condiciones de la PCR consistieron de una desnaturalización inicial de 94°C por 3 min, 40 ciclos a
94°C por 1 min, 35°C por 1 min y 72°C por 3 min, seguida de una extensión final de 72°C por 5 min (Kema et
al., 1996). Esta reacción fue realizada con cada uno de los iniciadores (Cuadro 5) y para cada una de las muestras
de DNA de los aislados del hongo.
Cuadro 5. Iniciadores utilizados en la determinación de los RAPD de los aislados de Mycosphaerella fijiensis, obtenidos de predios de plátano con tres manejos
distintos. Nombre del iniciador Secuencia (5´ - 3´) % GC
A-01 CAG GCC CTT C 70
H-06 ACG CAT CGC A 60 H-12 ACG CGC ATG T 60 M-04 GGC GGT TGT C 70 M-07 CCG TGA CTC A 60 P-13 GGA GTG CCT C 70
3.7 Marcadores SSR (Microsatélites) en M. fijiensis
Para determinar la diversidad alelica en los aislamientos de M. fijiensis, el DNA extraído fue analizado
con la técnica de los SSR con la ayuda del termociclador antes mencionado. La mezcla de reacción se realizó de
acuerdo a Neu et al., (1999), esta fue de un volumen final de 25 µl conteniendo 2 ng de DNA templado, 2 mM
MgCl2, 0.2 mM dNTPs (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 12.5 pmol de cada par de iniciadores (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) (Cuadro 6), 0.625 U de Taq DNA polimerasa (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y por último
dos gotas de aceite mineral para evitar la evaporación de la mezcla de reacción (Sigma BioScience, St. Louis,
MO).
Las condiciones de la PCR consistieron de una desnaturalización inicial de 94°C por 2 min, 30 ciclos a
94°C por 30 s, 55°C por 45 s y 72°C por 45 s, seguida de una extensión final de 72°C por 7 min. Esta reacción
fue realizada para cada uno de los iniciadores (Cuadro 6) y para cada una de las muestras de DNA de todos los
aislamientos del hongo.
Cuadro 6. Iniciadores utilizados en la determinación de los SSR de los aislados de Mycosphaerella fijiensis, obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.
Nombre del iniciador Secuencia (5´ - 3´) MfSSR175 AACCTCACATAGGCTGCCAC TATACCTTTCGTTTCGGCAAAGC MfSSR005 TCCAAATTCCATCGTCA CGATGATTTGGGTGGTCA AGCTA
3.8 Visualización de los productos
Los productos amplificados de los RAPD (25 µl), y el marcador de peso molecular 1 kb (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) fueron separados por medio de electroforesis en geles de agarosa (UltraPure Agarose, Gibco
BRL, Gaithersburg, MD) al 1.4%, y los de SSR (microsatélites) en agarosa al 2% ambos preparados con
amortiguador TAE (Tris 1M, ácido acético, EDTA 0.5 M, pH 8.0) y corridos a 90V por 120 min. Los geles
fueron teñidos por 15 min en una solución de bromuro de etidio (5 µg ml –1) de amortiguador TAE (Tris 1M,
ácido acético, EDTA 0.5 M, pH 8.0) y un lavado en agua por 15 min según Sambrok et al., (1989). Las bandas de
DNA enel gel fueron visualizadas por medio de un transiluminador de UV y fotografiado con la ayuda del
sistema de análisis de imágenes Eagle Eye I (Strategene).
3.9 Análisis de los datos
Este análisis inicia con la observación directa de los polimorfismos que se obtuvieron en el gel de
agarosa fotografiado como un patrón de bandas específico para cada individuo, en el cual, dichas bandas han sido
numeradas en relación con su migración a través del gel a partir de la de mayor a menor peso molecular. Se
asume que tales bandas o fragmentos amplificados en diferentes individuos son idénticos si tienen el mismo peso
molecular.
La presencia y/o ausencia de cada banda particular asumirá un valor numérico: 1 como presencia y 0
como ausencia. Las distancias genéticas fueron estimadas usando el método de Skroch et al., (1992) que es un
coeficiente de apareamiento simple, igual a la proporción de diferencias con respecto al número total de bandas
comparadas.
Con estas distancias se genera una matriz (conteniendo las distancias entre todos los posibles pares de
individuos), la cual es usada para generar el dendograma por el método de promedio aritmético de grupos de
pares no ponderados (UPGMA) (Avise, 1994) usando el paquete software del programa S-Plus 2000 professional
(S-Plus, 2000).
La distancia genética (D) entre dos muestras, A y B, se calculó por el método de Skroch et al., (1992)
siguiendo la fórmula DAB = [∑i |Ai – Bi|]/ N, donde A i y Bi son análisis asignados (1 ó 0) para la banda ith de A y
B, respectivamente, y N = al número total de bandas presentes dentro de toda las muestras.
IV RESULTADOS
4.1 Caracterización morfológica de M. fijiensis
Las cajas de petri que contenían medio agar-agar con las muestras de tejido foliar dañado, mostraron la
presencia de ascosporas en cantidades muy variables por caja después de 24 h incubadas a 26 ± 2°C en oscuridad.
Según las observaciones realizadas con la ayuda del microscopio estereoscópico bajo condiciones asépticas, las
ascosporas generalmente fueron, hialinas, globosas, con un septo y una pequeña constricción en el septo. Además
de una de las células siempre fue ligeramente más abultada que la otra, el tamaño de varió de 10.8 a 15.5 de largo
y de 2.6 a 4.8 µm de ancho con un promedio de 13.1 x 3.8 µm.
Las ascosporas cultivadas en medio PDA influyó sobre la aparición visual del número
de colonias, apareciendo como pequeños puntos de color verde claro, cuyo crecimiento fue
muy lento, obteniendo un total de 20 aislamientos monospóricos de M. fijiensis, 7 de ellos
fueron de cultivos con manejo intensivo, 8 de semintensivo y 5 de rústico (Cuadro 8). Su color
fue diferente en la parte superior, en principio fueron de color gris oscuro, luego cambiaron a
color blanco claro y finalmente se observó un color rosado o blanco, por la parte inferior,
generalmente siempre fue negro o en algunos aislamientos fueron blancos. La forma de las
colonias fue globosa, circular y la apariencia de la morfológica de 3 aislados que fueron
seleccionados fue diferente en relación al tipo de manejo del cultivo (Cuadro 7).
Cuadro 7. Apariencia en medio PDA de la morfología de 3 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis. INIFAP-Tecomán (INI-2), poblados de Puerta de Caleras (PC-3) y Cerro de Ortega (IB-2).
Clave Apariencia
INI-2 Las colonias tuvieron micelio aéreo blanco, con apariencia algodonosa,
redonda y mayor crecimiento; al reverso de la caja muestra color blanco con un pequeño punto negro en el centro de la colonia.
PC-3 Las colonias tuvieron micelio aéreo blanco, con apariencia algodonosa y crecimiento lento; al reverso de la caja muestra un color negro con los bordes blancos.
IB-2 Las colonias tuvieron micelio compacto, gris rosado, sin apariencia algodonosa. La colonia fue de forma irregular (no circular); al reverso de la caja muestra un color negro con los bordes blancos.
Cuadro 8. Aislamientos monospóricos obtenidos de Mycosphaerella fijiensis de la región productora del estado
de Colima.
Clave Origen Tipo de manejo
CO-1 Colomos, Colima
COA-1 Coahuayana, Michoacán
IB-2 Cerro de Ortega, Colima
IB-4 Cerro de Ortega, Colima Intensivo (I)
OCH-1 Cerro de Ortega, Colima
GLE-2 Coahuayana, Michoacán
GLE-4 Coahuayana, Michoacán
FIE-2 Armería, Colima
FIE-3 Armería, Colima
AS-1 Asmoles, Colima
PC-1 Puerta de Caleras, Colima
PC-2 Puerta de Caleras, Colima Semintensivo (SI)
PC-3 Puerta de Caleras, Colima
ORT-3 Armería, Colima
ORT-4 Armería, Colima
CA-1 Caleras, Colima
CA-2 Caleras, Colima
INI-2 INIFAP-Tecomán, Colima Rústico (R)
INI-3 INIFAP-Tecomán, Colima
INI-6 INIFAP-Tecomán, Colima
reverso reverso
IB-2 Figura 5. Características morfológicas de los aislamientos de Mycosphaerella fijiensis de tres predios con manejo
diferente de la región del Estado de Colima. INIFAP-Tecomán (INI-2); Puerta de Caleras (PC-3) y Cerro de Ortega (IB-2).
4.2 Análisis de los marcadores RAPDs en M. fijiensis
El número de bandas de DNA amplificadas y polimórficas por la PCR con cada uno de los iniciadores
en los aislamientos de M. fijiensis utilizados, varió de 6 a 12 por aislamiento. Los iniciadores con un 60 % de GC
amplificaron un mayor número de bandas analizadas dando un total de 58 bandas, mientras que los que contienen
un 70% tuvieron de 4 a 10 bandas polimorficas de un total de 51 (Cuadro 9).
Cuadro 9. Número de bandas de DNA amplificadas y polimórficas obtenidas con los
aislamientos de Mycosphaerella fijiensis de huertos de plátano con tres
manejos distintos.
Nombre del Secuencia % de Bandas Bandas iniciador (5´ - 3´) GC amplificadas polimórficas
A-01 CAG GCC CTT C 70 6 4 H-06 ACG CAT CGC A 60 10 10 H-12 ACG CGC ATG T 60 12 10
reverso
INI-2 PC-3
IB-2
M-04 GGC GGT TGT C 70 8 7 M-07 CCG TGA CTC A 60 12 11 P-13 GGA GTG CCT C 70 11 10 Total 58 51
M R I SI SI R R R R SI
Figura 6. Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador A-01 (5´
CAGGCCCTTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb (Gibco BRL), carril 1 : CA-2, carril 2: IB-2, carril 3: FIE-2, carril 4: AS-1, carril 5: CA-1, carril 6 : INI-2, carril 7: INI-3, carril 8 : INI-6 y carril 9: ORT-3.
Con el iniciador A-01 (5´ CAGGCCCTTC 3´) fue amplificado un total de 2 a 6 bandas de DNA por
aislamiento (Fig. 6), con un peso entre 3,054 a 990 pb. En el aislamiento FIE-2 se amplificaron solamente 2
bandas, mientras que en los aislamientos CA-1, INI-2 y INI-3 se amplificaron 6 bandas de DNA, siendo estos de
huertos de manejo rústico. Del total de las bandas amplificadas sólo 4 fueron polimórficas, esto indica que es
muy poca la información que se obtiene con este iniciador para análisis de diversidad genética del hongo. Por lo
cual, se sugiere no debe contemplarse en estudios posteriores sobre la determinación de la diversidad genética de
M. fijiensis en relación al tipo de manejo del cultivo.
M R R I SI SI I R
12,026
3,054
2,036
1,018
Figura 7. Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador H-12 (5´
ACGCGCATGT 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb (Gibco, BRL), carril 1 : CA-1, carril 2: CA-2, carril 3: IB-2, carril 4: FIE-3, carril 5: PC-1, carril 6: IB-4 y carril 7: INI-2.
En la Fig. 7, se muestra el parámetro de bandas de DNA amplificadas con el iniciador
H-12 (5´ ACGCGCATGT 3´). Con este iniciador fue posible obtener una buena cantidad de
bandas amplificadas y polimórficas 12 y 10, respectivamente. Con es iniciador se amplificaron
tres bandas que estuvieron presentes en todas las muestras con un peso de 2036, 1254 y 1018
pb. En IB-2, se presentaron dos bandas de 800 y 900 pb, las cuales solamente fueron
amplificadas en este aislamiento, pero la mayoría de las bandas de DNA amplificas también
estuvieron en la muestra CA-2, sin embargo, en FIE-3 muestra un perfil de bandas muy
similar a CA-2, procedentes de huertos de manejo semintensivo y rústico, respectivamente;
pero IB-4 e INI-2 tuvieron un perfil de bandas muy similares, siendo estos de manejo
intensivo y rústicos.
M R R I SI SI R I
3,054
2,036
1,018
12,026
Figura 8. Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador M-07 (5´
CCGTGACTCA 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb, carril 1: CA-2, carril 2 : INI-2, carril 3: IB-2, carril 4: PC-1, carril 5: ORT-4, carril 6 : INI-3 y carril 7: OCH-1.
Con el iniciador M-07 (5´ CCGTGACTCA 3´) se amplificó una banda de DNA de 1018 pb (Fig. 8) que
estuvo presente en todos los aislamientos analizados, talvez puede ser una característica genética muy en
particular de este hongo, bajo estas condiciones ambientales. Con este iniciador se observó una cantidad de 12
bandas amplificadas de las cuales 10 fueron polimórficas, siendo uno de los iniciadores que pudo amplificar una
mayor cantidad de bandas. En IB-2, se amplificó una banda de 1100 pb que en los demás aislamientos estuvo
ausente, indicando alguna característica en particular de este aislamiento, el cual es procedente de un huerto de
manejo intensivo. El aislamiento CA-2 de un huerto de manejo rústico se amplificaron 6 bandas, una de 1980 pb
que estuvo también presente en INI-3 el cual es también procedente de un huerto rústico, esta banda no se
presentó en ninguno de los otras muestras analizadas con este iniciador. En IB-2, ORT -4 y OCH-1 amplificaron
bandas de DNA que estuvieron en estas muestras, precedentes de huertos de manejo intensivo y semintensivo. En
PC-1 solamente se amplificaron 4 bandas, de las cuales tres estuvieron también en aislamientos de manejo
semintensivo e intensivo.
M R R I SI SI I M
1,018
2,036
3,054
12,026
Figura 9. Marcadores RAPD de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador P-13 (5´
GGAGTGCCTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb, carril 1: INI-3, carril 2: INI-6, carril 3: GLE-2, carril 4: PC-2, carril 5: ORT-3 y carril 6: GLE-4.
Con el iniciador P-13 (5´ GGAGTGCCTC 3´) se amplificó una gran cantidad de
bandas de DNA por aislamiento (Fig. 9). En 1a muestra INI-6 no se amplificó una banda de
2,036 pb la cual estuvo presente en todas las demás colectas analizadas con este iniciador, así
como también en GLE-4 procedente de un huerto con manejo intensivo se produjo una banda
de 1,000 pb la cual estuvo ausente en los demás aislamientos, pero en este se amplificó un
perfil de bandeo muy similar a GLE-3 originarios del mismo huerto. En INI-3 procedente de
manejo rústico se amplificaron bandas de DNA similares a las observadas en ORT-3 y PC-2
los cuales son de manejo semintensivo.
M R R I SI SI R I
Figura 10. Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador M-O4 (5´
GGCGGTTGTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb (Gibco, BRL), carril 1: CA-1, carril 2: INI-2, carril 3: OCH-1, carril 4: FIE-2, carril 5 : AS-1, carril 6 : INI-3 y carril 7: GLE-2.
En la Fig. 10 se observa el número de bandas amplificadas de DNA con el iniciador M-04 (5´ GGCGGTTGTC 3´) en aislamientos de M. fijiensis, con este iniciador se amplificaron de 4 a 6 bandas de DNA por cada muestra, de las cuales todas fueron polimorficas. Una banda de 2000 pb estuvo presente en todas las colectas, en CA-1 e INI-3, se presentó más intensa, ambos aislamientos de huertos de manejo rústico. En INI-2, OCH-1 y FIE-2 se presentaron dos bandas, las cuales solamente estuvieron presentes en estos aislamientos. En AS-1 todas las bandas amplificadas estuvieron también presentes en GLE-2, los cuales son de manejo semintensivo e intensivo respectivamente.
M R R I SI SI I
Figura 11. Marcadores RAPD de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generador por el iniciador H-06 (5´
ACGCATCGCA 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb (Gibco, BRL), carril 1 : CA-1, carril 2 : INI-2, carril 3: IB-2, carril 4: PC-1, carril 5: ORT-4 y carril 6 GLE-2.
Con el iniciador H-06 (5´ ACGCATCGCA 3´) amplificó 10 bandas de las cuales todas
fueron polimórficas en los aislamientos analizados. La colecta CA-1 de manejo rústico
presentó una banda de 1480 pb, la cual estuvo ausente en todos los demás, también se observó
en este aislamiento, al igual que en INI-2 de manejo rústico e IB-2 manejo intensivo que se
amplificó una banda de 1980 pb y ausente en todos los demás. ORT-4 y GLE-2 de manejo
semintensivo e intensivo respectivamente, tuvieron un perfil de bandeo similar, así como
también en IB-2 y PC-1 intensivo y semintensivo respectivamente, pero PC-1 no presentó una
banda que estuvo en CA-1, INI-2 y IB-2.
Distancias genéticas 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4
1
Figura 12. Dendrograma derivado de UPGMA del análisis de seis iniciadores RAPD en aislamientos de
Mycosphaerella fijiensis de 6 campos con diferente manejo técnico (CA-2 e IN-3: Rústico; IB-4 y CO-1: Intensivo; ORT-4 y FIE-3: Semintensivo). Los números en los nodos representan un bootstrap para 1000 réplicas.
El dendrograma obtenido del análisis de DNA de 2 aislamientos de M. fijiensis por
cada tipo de manejo, utilizando 6 iniciadores, muestra 2 grupos bien definidos (Fig. 12): el A
integrado por CA-2 e IN-3 de manejo rústico y el B por IB-4, CO-1 intensivo, ORT-4 y FIE-3
semintensivo, el A tuvo una distancia genética de 0.43, mientras que B presento 0.27. Los
grupos fueron representativos también por el origen del aislamiento. IB-4 fue el que tuvo la
mayor distancia genética (H: 0.38) entre todos los demás aislamientos analizados, siguiéndoles
CO-1 de H: 0.34, ambos procedentes de manejo intensivo, pero los aislamientos ORT-4 y FIE-
3 procedentes de huertos con un manejo semintensivo, formaron un grupo que tuvo una H:
0.18. Algo similar también ocurrió con el grupo A formado por los aislamientos CA-2 y IN-3
de manejo rústico que tuvieron la menor distancia genética de H: 27.
4.3 Análisis de los microsatélites en M. fijiensis
CA-2
IN-3 (R)
IB-4 (IN)
CO-1 (IN)
ORT-4 (SI)
FIE-3 (SI)
A
B
88
49
51
96
12,026 3,054
2,036
1,018
El número de microsatélites obtenidos con el uso del par de iniciadores para el locus MfSSR175 vario de
1 a 3 alelos (Cuadro 10). En los aislamientos CA-1 e INI-2 amplificaron un alelo, mientras que INI-6 se
presentaron 3 alelos, estos son de manejo rústico. En AS-1, FIE-2, FIE-3, PC-1 y PC-2 se obtuvo solamente un
alelo, en comparación a PC-3 que amplifico 2 alelos, sin embargo, en ORT-3 y ORT-4 se obtuvieron 3 alelos en
cada uno de los aislamientos, siendo de manejo semintensivo. En los aislamientos de manejo intensivo IB-2, IB-
4, GLE-4 y CO-1 se obtuvo un alelo, en cambio en GLE-2 se obtuvo 2 alelos, pero en OCH-1 y COA-1 se
obtuvieron 3 alelos (Fig. 13).
Cuadro 10. Número de alelos en los aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.
Locus Secuencia del iniciador 5 - 3´ No. de alelos
MfSSR005 TCCAAATTCCATCGTCA 3 CGATGATTTGGGTGGTCA AGCTA
MfSSR175 AACCTCACATAGGCTGCCAC 1 TATACCTTTCGTTTCGGCAAAGC
M I I I I SI SI SI SI I I SI SI SI R R R I SI
Figura 13. Análisis de microsatélites para el locus MfSSR175 de 18 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M =marcador de peso molecular 1 kb (Gibco BRL), carril 1: IB-2, carril 2: IB-4, carril 3 : GLE-2, carril 4: GLE-4, carril 5: AS-1, carril 6: ORT-3, carril 7: FIE-2, carril 8: FIE-3, carril 9: OCH-1, carril 10: COA-1, carril 11: PC-1, carril 12: PC-2, carril 13: PC-3, carril 14: CA-1, carril 15: INI-3, carril 16: INI-6, carril 17: CO-1 y carril 18: ORT-4
12,026
2,036
1
3,054
1,018
M I I I I SI SI SI SI I I SI SI SI R R R I SI
Figura 14. Análisis de microsatélites para el locus MfSSR005 de 18 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M =marcador de peso molecular 1 kb (Gibco BRL), carril 1: IB-2, carril 2: IB-4, carril 3 : GLE-2, carril 4: GLE-4, carril 5: AS-1, carril 6: ORT-3, carril 7: FIE-2, carril 8: FIE-3, carril 9: OCH-1, carril 10: COA-1, carril 11: PC-1, carril 12: PC-2, carril 13: PC-3, carril 14: CA-1, carril 15: INI-3, carril 16: INI-6, carril 17: CO-1 y carril 18: ORT-4.
Para el locus MfSSR005, únicamente fue amplificado un alelo en los 18 aislamientos de M. fijiensis
analizados, de los cuales fueron obtenidos de cultivos con manejo rústico, semintensivo e intensivo (Fig. 14).
Esto demuestra uniformidad genética entre los aislamientos procedentes de cultivos con diferente manejo.
Distancias genéticas
0.0 0.2 0.4 0.6
1
Figura 15. Dendrograma derivado de UPGMA de los análisis de SSR de 16 aislados de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. Los números en los nodos representan un bootstrap para 1000 réplicas.
El dendrograma obtenido del análisis de los locus MfSSR005 y MfSSR175 de 18 aislamientos de M.
fijiensis de diferentes manejo del cultivo, muestra dos grupos bien definidos (Fig. 15): el A integrado por IB-2,
IB-4, CO-1, OCH-1, COA-1, GLE-2, de manejo intensivo, también estuvieron presentes ORT -3, ORT-4, PC-1,
PC-2 y AS-1, de manejo semintensivo. El grupo B se presentaron los de manejo semintensivo FIE-2, FIE-3 y PC-
1, uno de manejo rústico INI-3, pero GLE-4 formo un subgrupo. El grupo B presento una distancia genética de
H:0.38.
IB-2
IB-4 CO-1
ORT -3
OCH-1
COA-1 PC-1
AS-1
ORT -4
PC-2 GLE-2
GLE-4
FIE-2
CA-1
INI-6 INI-3
FIE-3 PC-1
87
54
51
A
B
VII CONCLUSIÓN
Las características morfologías de las colonias de M. fijiensis fueron su lento
crecimiento y la coloración de gris oscuro a rosado, dependiendo del aislamiento, así
como su forma globosa y circular.
Los marcadores RAPD permitieron determinar los niveles de diversidad
genética dentro de los 29 aislamientos analizados, agrupándolos de acuerdo a su origen
geográfico y nivel de manejo del cultivo de plátano.
El uso de los SSR permitió establecer que los aislamientos analizados
presentaron de 1 a 3 alelos dependiendo el locus estudiado y agruparlos según su
origen geográfico y nivel de manejo del cultivo de plátano.
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