UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ - UESC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL - PPGPV
MATHEUS DE CARVALHO SILVA
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE LARANJEIRA ‘VALENCIA’ SOB DIFERENTES
PORTA-ENXERTOS CÍTRICOS EM FUNÇÃO DA VARIAÇÃO DA UMIDADE DO
SOLO
ILHÉUS - BAHIA
2018
MATHEUS DE CARVALHO SILVA
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE LARANJEIRA ‘VALENCIA’ SOB DIFERENTES
PORTA-ENXERTOS CÍTRICOS EM FUNÇÃO DA VARIAÇÃO DA UMIDADE DO
SOLO
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, como parte
das exigências para a obtenção do
título de Doutor em Produção Vegetal.
Linha de pesquisa: Melhoramento de
Plantas e Biotecnologia
Orientador: Prof. Dr. Marcio Gilberto
Cardoso Costa
Co-orientador: Prof. Dr. Alex-Alan
Furtado de Almeida
ILHÉUS - BAHIA
2018
MATHEUS DE CARVALHO SILVA
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE LARANJEIRA ‘VALENCIA’ SOB DIFERENTES
PORTA-ENXERTOS CÍTRICOS EM FUNÇÃO DA VARIAÇÃO DA UMIDADE DO
SOLO
Tese apresentada à Universidade
Estadual de Santa Cruz, como parte
das exigências para a obtenção do
título de Doutor em Produção Vegetal.
Ilhéus-BA, 23 de fevereiro de 2018.
__________________________________________________ Prof. Dr. Marcio Gilberto C. Costa
UESC/DCB (Orientador)
___________________________________________________ Prof. Dr. Arlicélio Q. Paiva
UESC/DCAA
____________________________________________________ Prof. Dr. Marcelo S. Mielke
UESC/DCB
____________________________________________________ Profª. Drª. Ivanildes C. dos Santos
UESC/DCB
__________________________________________________ Prof. Dr. Rogério Ferreira Ribas
(UFRB)
DEDICATÓRIA
Dedico a Andressa Rodrigues de Oliveira Sousa pela sua amizade e apoio dado nos
trabalhos desenvolvidos durante o doutorado. Você tornou minha temporada em
Cruz das Almas muito mais agradável e produtiva.
AGRADECIMENTOS
Ao meu Senhor e Salvador Jesus Cristo, a quem dou toda honra e toda a glória.
Grato sou a Ti por todas as conquistas alcançadas.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcio Gilberto Cardoso Costa, pela orientação dada,
confiança e paciência nessa longa jornada durante o doutorado.
Ao pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura, Dr. Maurício Antonio Coelho
Filho, pela sua orientação e dedicação nos trabalhos desenvolvidos por mim nessa
instituição de pesquisa.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida, pelo apoio nos
momentos solicitados.
A Andressa Rodrigues de Oliveira Sousa e Elaine da Silva Cruz, pela amizade e
apoio dado nos trabalhos desenvolvidos. Essa vitória é nossa. Muito Obrigado!
A Universidade Estadual de Santa Cruz e ao Programa de Pós-Graduação em
Produção Vegetal pela infraestrutura e oportunidade oferecida.
A Embrapa Mandioca e Fruticultura por ceder sua estrutura e equipe, tornando-se
possível a realização dos experimentos de pesquisa.
A Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado da Bahia, pela concessão da bolsa de
estudo, permitindo me dedicar de forma exclusiva nos trabalhos de pesquisa
científica.
Ao pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura, Dr. Abelmon da Silva Gesteira,
pela orientação e amizade.
Ao grupo do Laboratório de Ecofisiologia Vegetal da Embrapa Mandioca e
Fruticultura, pelos momentos alegres vividos juntos. Sentirei falta de vocês!
A Jair, Reinaldo, Jorge e Tibério, pelo amizade e suporte dado nos experimentos.
Ao Sr. Santana, pelo seu conhecimento, paciência e disponibilidade em atender os
pedidos solicitados.
Ao aluno de iniciação ciêntífica, Wilson Amorin, pelo auxílio dado nos experimentos
realizados. Sua ajuda foi fundamental!
As alunas de iniciação científica, Liziane Marques e Alana Batista, por sempre dizer
sim quando solicitava ajuda.
A minha mãe Neuza de Carvalho Silva e meus irmãos Arquiminio Bomfim da Silva
Neto e Fabiana de Carvalho Silva, por apoiar e acreditar nas minhas escolhas.
A Geraldo Ferreira da Silva e Maria das Graças da Silva, ao ensinarem o valor do
conhecimento e a importância de estudar.
Aos meus amigos que me apoiaram de forma direta e indireta na conquista desse
título. São eles: Roseli Nogueira Cellos, Marcio de Paiva Carneiro, Patrícia Santos,
Marina Santos, Nelson Santos, Alessana Schlichting, Sidnéia Leite, Marcos
Fernandes, Odarcina Chaves, Ilná Carvalho
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................................... 9
ABSTRACT ............................................................................................................... 11
1 Introdução ............................................................................................................. 13
2 Objetivos ................................................................................................................ 16
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 16
2.1 Objetivos Específicos ....................................................................................... 16
3 Revisão Bibliográfica ........................................................................................... 17
3.1 Aspectos Gerais da Citricultura ........................................................................ 17
3.2 Deficiência Hídrica em Citros ........................................................................... 19
3.3 Respostas ao Déficit Hídrico ............................................................................ 21
3.3.1 Fisiológicas ................................................................................................ 21
3.3.2 Bioquímicas e Moleculares ........................................................................ 23
3.4 Melhoramento Genético ................................................................................... 25
4 Material e Métodos ............................................................................................... 27
4.1 Experimento I ................................................................................................... 27
4.2 Experimento II .................................................................................................. 28
4.2.1 Material vegetal e condições experimentais .............................................. 28
4.2.2 Relação entre Transpiração Relativa e Fração de Água Transpirável ....... 32
4.2.3 Potencial Hídrico Foliar (L) ...................................................................... 33
4.2.4 Potencial de Turgor (p) ............................................................................ 33
4.2.5 Teor Relativo de Água (RWC) na Folha .................................................... 34
4.2.6 Fluorescência da Clorofila a ...................................................................... 34
4.2.7 Trocas Gasosas Foliares ........................................................................... 35
4.2.8 Eficiência de Uso da Água ......................................................................... 35
4.2.9 Parâmetros da Curva Pressão-Volume (PV) em Folhas ............................ 35
4.2.10 Potencial Osmótico () .......................................................................... 36
4.2.11 Atividade da Dismutase do Superóxido (SOD) ........................................ 36
4.2.12 Atividade da Peroxidase do Guaiacol (GPX) .......................................... 37
4.2.13 Extração de RNA e Síntese de cDNA ..................................................... 37
4.2.14 Análise de PCR em Tempo Real (qRT-PCR) ......................................... 38
4.2.15 Análise Estatística .................................................................................... 39
5 Resultados ............................................................................................................ 40
Experimento I ......................................................................................................... 40
Experimento II ........................................................................................................ 47
6 Discussão ............................................................................................................. 62
Experimento I ......................................................................................................... 62
Experimento II ........................................................................................................ 66
7 Conclusão ............................................................................................................. 74
8 Referência Bibliográfica ...................................................................................... 75
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE LARANJEIRA ‘VALENCIA’ SOB DIFERENTES
PORTA-ENXERTOS CÍTRICOS EM FUNÇÃO DA VARIAÇÃO DA UMIDADE DO
SOLO
RESUMO
A seca é um dos fatores abióticos mais ameaçadores para o cultivo dos citros no
mundo. O uso de porta-enxertos pode contribuir para a tolerância da variedade copa
ao déficit hídrico, além de favorecer outros traços horticulturais, como maior
eficiência de produção e qualidade de frutos. O presente estudo objetivou avaliar,
em condições controladas, as respostas fisiológicas de quatro novos porta-enxertos
híbridos com reconhecido potencial de tolerância à seca e eficiência produtiva sob
condições de campo, visando identificar as respostas comuns e divergentes
associadas com a indução da tolerância à seca em citros. Os híbridos investigados
foram: ‘LCR x TR - 001’, ‘TSKC x CTSW - 041’, ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’ e ‘HTR -
069’. O primeiro experimento foi conduzido em fitotron, em que plantas pé-franco de
origem nucelar, com 140 dias de idade, foram submetidas aos tratamentos controle
(irrigado) e estresse hídrico (suspensão da irrigação), e diversas variáveis
fisiológicas foram analisadas ao longo de 48 dias após imposição dos tratamentos.
O segundo experimento foi conduzido em casa de vegetação, em que plantas dos
híbridos citados, com aproximadamente 1 ano de idade, enxertadas com a copa de
laranjeira ‘Valencia’ (Citrus sinensis L. Osb.), foram submetidas a cinco diferentes
regimes hídricos (controle, estresse leve, estresse moderado, estresse severo e
reidratação), definidos com base no potencial hídrico foliar antemanhã, e diversas
variáveis fisiológicos foram avaliados. Os resultados do primeiro experimento
mostraram que o déficit hídrico alterou a resposta dos híbridos avaliados para a
maioria das variáveis analisadas. A deficiência hídrica reduziu significativamente a
condutância estomática (gs) e aumentou significativamente a temperatura foliar, sem
diferenças significativas observadas entre os híbridos. A deficiência hídrica também
limitou significativamente o aumento da área foliar, número de folhas e altura da
planta, com exceção de ‘HTR - 069’, e massa seca foliar, com exceção de ‘TSKC x
CTSW - 041’ e ‘HTR - 069’, ao passo que favoreceu o aumento da massa seca de
raiz em ‘TSKC x CTSW - 041’. ‘TSKC x CTSW - 041’ e ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’
apresentaram maior comprimento total de raiz e comprimento de raízes finas (classe
de diâmetro entre 0-0,5 mm) em comparação com os demais híbridos, independente
do tratamento, sendo que a deficiência hídrica induziu uma redução significativa no
diâmetro médio de raiz no primeiro híbrido, mas um aumento significativo dessa
variável no segundo híbrido. Os resultados do segundo experimento indicaram que a
taxa líquida da fotossíntese, condutância estomática, transpiração e concentração
de carbono intercelular não diferenciaram entre as plantas mantidas em condições
de estresses leve e moderado, evidenciando uma boa eficiência no uso da água. Os
ajustamentos osmótico e elástico das paredes celulares induzidos pelos diferentes
híbridos permitiram que a pressão de turgor das células permanecesse inalterado,
garantindo a atividade fotossintética nos diferentes regimes de restrição hídrica.
Análises de expressão gênica e atividade das enzimas antioxidantes dismutase do
superóxido (SOD) e peroxidase do guaiacol (GPX) em folhas de laranjeira ‘Valencia’
enxertada nos híbridos ‘LCR x TR - 001’ e ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’ revelaram uma
indução significativa de expressão e atividade de GPX em plantas de ambos os
híbridos submetidos a condições de estresse moderado. Em conclusão, os quatros
porta-enxertos híbridos avaliados apresentaram respostas fisiológicas e de
crescimento tanto comuns como divergentes quando submetidos à condições
limitantes de água, sugerindo que diferentes atributos podem contribuir com o
mecanismo de tolerância à seca em citros.
Palavras-chave: estresse abiótico, seca, trocas gasosas, condutância estomática,
potencial de turgor, potencial osmótico, ajuste osmótico, ajuste elástico
PHYSIOLOGICAL RESPONSES OF 'VALENCIA' LARANJEIRA UNDER
DIFFERENT CITRUS FRUITS IN THE FUNCTION OF VARIATION OF SOIL
MOISTURE
ABSTRACT
Drought is one of the most threatening abiotic factors for citrus cultivation in
the world. The use of rootstocks can contribute to the tolerance of canopy variety to
water deficit, besides favoring other horticulture traits, such as greater production
efficiency and fruit quality. The present study aimed to evaluate under physiological
conditions the physiological responses of four new hybrid rootstocks with recognized
potential for drought tolerance and productive efficiency under field conditions,
aiming to identify the common and divergent responses associated with the induction
of drought tolerance in citrus. The investigated hybrids were: 'LCR x TR - 001', 'TSKC
x CTSW - 041', 'TSKC x (LCR x TR) - 059' and 'HTR - 069' The first experiment was
conducted in phytotron, in which 140-day-old plant-free plants of nucellar origin were
submitted to control (irrigated) and water stress (irrigation suspension) treatments,
and several physiological variables were analyzed throughout 48 days after
imposition of treatments. The second experiment was conducted in a greenhouse,
where plants of the mentioned hybrids, aged approximately 1 year, grafted with the
crown of Valencia orange (Citrus sinensis L. Osb.), Were submitted to five different
water regimes ( control, light stress, moderate stress, severe stress and rehydrated),
defined on the basis of the foliar water potential beforehand, and several
physiological variables were evaluated. The results of the first experiment showed
that the water deficit altered the response of the hybrids evaluated for most of the
analyzed variables. Water deficiency significantly reduced stomatal conductance (gs)
and significantly increased leaf temperature, with no significant differences observed
among hybrids. The water deficit also significantly limited leaf area increase, leaf
number and plant height, with the exception of 'HTR - 069', and leaf dry mass, with
the exception of 'TSKC x CTSW - 041' and 'HTR - 069' , while favoring the increase
of dry root mass in 'TSKC x CTSW - 041'. 'TSKC x CTSW - 041' and 'TSKC x (LCR x
TR) - 059' showed higher total root length and root length (diameter class 0-0.5 mm)
compared to the other hybrids, independently of the treatment, with water deficiency
inducing a significant reduction in root mean diameter in the first hybrid, but a
significant increase of that variable in the second hybrid. The results of the second
experiment indicated that the net rate of photosynthesis, stomatal conductance,
transpiration and intercellular carbon concentration did not differentiate between
plants maintained under mild and moderate stress conditions, evidencing a good
water use efficiency. The osmotic and elastic adjustments of the cell walls induced by
the different hybrids allowed the turgor pressure of the cells to remain unchanged,
guaranteeing the photosynthetic activity in the different water restriction regimes.
Analysis of gene expression and activity of the antioxidant enzymes antioxidant
superoxide (SOD) and guaiacol peroxidase (GPX) on 'Valencia' orange leaves
grafted on the 'LCR x TR - 001' and 'TSKC x (LCR x TR) - 059 'revealed a significant
induction of GPX expression and activity in plants of both hybrids subjected to
moderate stress conditions. In conclusion, the four evaluated hybrid rootstocks
presented both common and divergent physiological and growth responses when
submitted to water limiting conditions, suggesting that different attributes may
contribute to the mechanism of drought tolerance in citrus.
Keywords: abiotic stress, drought, gas exchange, stomatal conductance, turgor
potential, osmotic potential, osmotic adjustment, elastic adjustment
13
1 Introdução
A produção mundial estimada de laranja doce na safra 2013/14 foi 68.925
milhões toneladas (FAO, 2015), sendo uma cultura de grande expressão
socioeconômica dentro do cenário agrícola nos países produtores. Mas a citricultura
anda ameaçada pela falta de diversificação genética dos porta-enxertos nos
pomares citrícolas e pelos diversos fatores bióticos e abióticos que desestabilizam a
produtividade. Esses incluem a deficiência hídrica, o mais importante estresse
ambiental experienciado pela cultura dos citros, dado que o seu cultivo encontra-se
distribuído principalmente nas regiões semiáridas do mundo. A crescente escassez
de água para irrigação das culturas, assim como os efeitos causados pelas
mudanças climáticas globais, tais como elevadas temperaturas e mudança nos
padrões de precipitação, tornam imperativo o melhoramento genético para tolerância
à seca (WHITE et al. 2004).
As plantas podem adotar duas diferentes estratégias de tolerância para
contornar os efeitos potencialmente nocivos causados pela seca: evitar o estresse
ou tolerar o estresse (LAWLOR, 2013; VERSLUES et al., 2006). Os mecanismos de
prevenção para evitar o estresse incluem o fechamento estomático, aumento da
eficiência do uso da água (WUE), aprofundamento do sistema radicular e redução
do crescimento da parte aérea. Os mecanismos de tolerância à seca incluem a
desintoxicação pelas espécies reativas de oxigênio (ROS), acumulação de proteínas
protetoras, ajuste osmótico e ajuste elástico das paredes celulares (CLAEYS; INZE,
2013).
Estudos em diferentes genótipos de citros relataram que o déficit hídrico induz
uma queda nas taxas de condutância estomática, fotossíntese e transpiração
(SANTANA-VIEIRA et al., 2016; PEDROSO et al., 2014; SUASSUNA et al., 2014;
ROMERO et al., 2006). Quando a condutância é limitada para reduzir a perda de
água, o influxo de CO2 para o interior da folha também diminui, o que compromete a
14
taxa de fotossíntese líquida (SHIMAZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007). Esses
são considerados mecanismos de escape à seca (MEDINA et al., 2005). Os
atributos adaptativos das plantas cítricas descritos anteriormente são influenciados
pelo porta-enxerto, que afeta a distribuição do sistema radicular (CASTLE;
KREZDORN, 1975), eficiência de absorção de água e nutrientes (CASTLE;
KREZDORN 1977), anatomia dos elementos de vaso do xilema (VASCONCELLOS;
CASTLE, 1994; RODRÍGUEZ-GAMIR et al. 2010b), condutividade hidráulica da raiz
(SYVERTSEN; GRAHAM, 1985; MEDINA et al. 1998; RODRÍGUEZ-GAMIR et al.
2010b) e a capacidade de ajustes osmótico e elástico das paredes celulares
(RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010a; GONÇALVES et al., 2016). Estas propriedades
determinam a capacidade do porta-enxerto em suprir as necessidades de água e
nutrientes para a planta e a produção de hormônios indutores de adaptações
metabólicas que garantam a sua sobrevivência em solos mais secos.
Os níveis econômicos alcançados com o cultivo de citros foram obtidos
principalmente pela utilização de porta-enxertos tolerantes às condições bióticas e
abióticas. Entretanto, atualmente a citricultura apresenta elevada concentração no
uso de um número restrito de variedades porta-enxerto comerciais, limitando a
variabilidade genética e tornando a citricultura vulnerável ao surgimento de fatores
adversos, como ocorreu no passado.
A avaliação do potencial de uso de novos porta-enxertos desenvolvidos pelos
programas de melhoramento genético de citros visando a diversificação dos
pomares deverá incluir a análise da tolerância à seca, a fim de adaptar a cultura dos
citros ao clima atual e futuro. Ramos et al. (2015) avaliaram 21 porta-enxertos
combinados com a copa laranjeira ‘Valencia’ cultivados no campo sob condições de
sequeiro, no período de 2009-2011, sendo que os híbridos ‘LCR x TR - 001’, ‘TSKC
x CTSW - 041’, ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’ e ‘HTR - 069’ conferiram a maior
eficiência de produção de frutos em comparação com as demais variedades porta-
enxerto, incluindo as convencionais como limoeiro ‘Cravo’. O híbrido ‘059’ foi o
destaque, através de uma análise visual para tolerância à seca, entre esses quatro
híbridos. Quando Carvalho et al. (2016) avaliaram porta-enxertos alternativos ao
limoeiro ‘Cravo’ enxertado em laranjeira ‘Pera’, cultivados no campo sob condições
de sequeiro, teve o híbrido ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’ entre os destaques que
induziram eficiência produtiva numericamente superior à do limoeiro 'Cravo'.
15
Pesquisas que identifiquem mecanismos comuns e divergentes de tolerância
à seca, adotados por diferentes porta-enxertos pela indução de respostas
fisiológicas na variedade copa, quando em condições limitantes de água no solo, se
tornam necessários para melhor elucidar os diferentes fenótipos adotados e o uso
dessas informações nos programas de melhoramento genético como estratégias de
pré-seleção de materiais promissores.
16
2 Objetivos
2.1 Objetivo Geral
Caracterizar novos porta-enxertos híbridos com potencial de tolerância à
seca, mediante avaliações fisiológicas, bioquímicas e moleculares, quando
em condições de déficit hídrico.
2.1 Objetivos Específicos
i. Avaliar variáveis fisiológicas e de crescimento dos híbridos como pé-
franco em condições de déficit hídrico;
ii. Avaliar as respostas fisiológicas, bioquímicas e moleculares de
laranjeira ‘Valencia’ enxertada nos diferentes porta-enxertos híbridos
em condições de déficit hídrico.
17
3 Revisão Bibliográfica
3.1 Aspectos Gerais da Citricultura
Os citros compreendem um grande grupo de plantas do gênero Citrus e
outros gêneros afins (Fortunella e Poncirus) ou híbridos da família Rutaceae, ao qual
são originários da Ásia meridional, com registros mais antigos na China há milhares
de anos (NICOLOSI, 2007). Com liderança mundial de frutíferas, os citros são
cultivados em mais de 100 países que apresentam climas tropical, subtropical e
mediterrâneo (KHAN; KENDER, 2007) sendo consumidos por famílias de todas as
classes sociais (GOMES, 2007; OLIVEIRA et al., 2008), além de terem também
significado industrial como matéria-prima para produtos cosméticos e farmacêuticos.
O comércio entre as nações e as guerras favoreceram a difusão do cultivo sendo
estes levados para a Europa na época das Cruzadas e chegando ao Brasil trazidos
pelos portugueses, no século XVI (GOMES, 2007; NEVES et al., 2010; PASSOS et
al., 2013).
A citricultura no Brasil ganhou destaque, visto que mesmo fora do habitat
original, as plantas cítricas encontraram condições melhores para vegetar e produzir,
expandindo-se por todo o território, em maior ou menor escala (MOREIRA, 1980;
NEVES et al., 2010; PASSOS et al., 2013). O produtor nacional especializou-se na
produção de cultivares destinadas ao suco, diante da produção de suco concentrado
de laranja destinado ao mercado externo (SANTOS FILHO et al., 2005; NEVES et
al., 2010). O país detém 50% da produção mundial de suco de laranja e exporta
98% do que produz, sendo a Europa o principal destino dessas exportações
(NEVES et al., 2010).
O estado de São Paulo é o maior produtor nacional, liderando a produção das
três principais frutas cítricas produzidas no país (laranja, limão e tangerina)
(SANTOS FILHO et al., 2005). A Bahia é o segundo maior produtor de laranja do
18
país com produção anual em 2016 de 1,1 milhão de toneladas de acordo com dados
do PAM (2016) gerados principalmente pela região do litoral norte do estado.
Segundo levantamento do IBGE (2017) a produção de laranja no país em
outubro/2017 chegou a 17.266.133 toneladas com área cultivada de 638.523 ha.
Na produção mundial de citros, quase todas as frutas comerciais são
cultivados como árvores enxertadas por apresentar diversas vantagens como a
uniformidade das mudas, precocidade na produção, aumento na produtividade,
dentre outros por constituir um único indivíduo vegetal produtivo e longevo
(AMARAL, 1994; ANDRADE; MARTINS, 2003; POMPEU JUNIOR, 2005; KHAN;
KENDER, 2007; OLIVEIRA et al., 2008). O uso de um porta-enxerto adequado pode
propiciar frutos de melhor qualidade além de induzir diversas alterações na
variedade copa destacando dentre eles: absorção, síntese e utilização de nutrientes;
transpiração e composição química das folhas; resposta a produtos de abscisão de
folhas e de frutos; porte, precocidade de produção e longevidade das plantas;
maturação, peso e permanência de frutos na planta; coloração da casca e do suco;
teores de açúcares, ácidos e de outros componentes do suco; tolerância a pragas,
doenças e fatores abióticos, como frio, salinidade e seca; conservação pós-colheita;
produtividade; e qualidade das frutas (POMPEU JUNIOR, 1980; SCHAFER et al.,
2001).
Entretanto, a maior parte da produção brasileira de citros é sustentada por um
número reduzido de porta enxertos, sendo que o limoeiro ‘Cravo’ ainda é o genótipo
de uso em maior abrangência nacional, representando cerca de 50% da produção
dos viveiros no país (OLIVEIRA et al., 2008; FUNDECITRUS, 2013). Este apresenta
um amplo número de características fisiológicas e agronômicas importantes, como
tolerância à seca, facilidade na obtenção de sementes, tolerância à tristeza dos
citros (CTV), compatibilidade com todas as variedades copa, indução de produção
precoce e alta produtividade o que justifica a sua principal utilização (SOARES
FILHO et al., 2008). Todavia, a citricultura mostra-se vulnerável devido,
principalmente, à utilização de poucas combinações copa/porta-enxerto tornando
necessária a realização de um programa de diversificação em nível nacional
(CUNHA SOBRINHO et al., 1980; SCHINOR et al., 2006).
19
3.2 Deficiência Hídrica em Citros
Devido ao ciclo de vida sésseis, as plantas desenvolveram mecanismos para
responder e se aclimatar a estresses ambientais adversos durante o seu
crescimento e desenvolvimento (OSAKABE et al., 2014). Os estresses abióticos ou
bióticos, causam grandes impactos na agricultura a cada ano, restringindo o
rendimento e a produção das culturas (SINGH et al., 2017; ZANDALINAS et al.,
2017). Entre os vários fatores limitantes da produção vegetal, o déficit hídrico ocupa
posição de destaque, visto que além de afetar as relações hídricas nas plantas,
alterando-lhes o metabolismo, é o fenômeno que ocorre em grandes extensões de
áreas cultiváveis causando inúmeras perdas econômicas (NOGUEIRA et al., 2001;
OSAKABE et al., 2014; SMEKALOVA et al., 2014).
O déficit de água permanente ou temporário prejudica severamente o
crescimento e desenvolvimento da planta mais do que outro fator ambiental (ANJUM
et al., 2011). E desde os primórdios, o homem tem procurado uma alternativa mais
efetiva do aproveitamento da água para superar os efeitos do déficit hídrico às
plantas (SANTOS; CARLESSO, 1998). A irregularidade de chuvas no país agravada
pela ocorrência em condições de distribuição, tempo e intensidade limita a demanda
e uso da água existente (SCHAFER et al., 2001; ZARCH et al., 2015) e assim, a
produtividade da planta é amplamente afetada por episódios de seca em condições
de campo (TODAKA et al., 2015).
A seca é uma condição natural e inevitável sendo a consequência de uma
redução natural na quantidade de precipitação recebida durante um período
prolongado de tempo, variando em gravidade e duração e sendo associada a outros
fatores climáticos, tais como temperaturas elevadas, ventos fortes e de baixa
umidade relativa (WILHITE, 2000; TODAKA et al., 2015). Contudo, as áreas
afetadas aumentaram substancialmente desde meados do século 20 e como
resultado, plantas apresentam um crescente estresse hídrico, por déficit, em muitas
regiões do mundo que impõe sérios riscos as culturas (DAI, 2011; GRAY; BRADY,
2016). A escassez de água pode acontecer lentamente durante o desenvolvimento
da planta (dias a semanas ou meses) ou ser de curto prazo (horas a dias) e por ser
independente da planta, os efeitos da deficiência hídrica pode mudar drasticamente
20
de acordo com o genótipo e ambiente (CHAVES et al., 2003; GILBERT; MEDINA,
2016)
O cultivo dos citros no Brasil se dá predominantemente sem irrigação, e no
nordeste brasileiro a citricultura encontra-se assentada, principalmente, no
ecossistema de Tabuleiros Costeiros com produtividade baixa, devido ao déficit
hídrico que ocorre de modo mais acentuado, nos meses mais quentes do ano, de
novembro a fevereiro (CRUZ et al., 2003; CERQUEIRA et al., 2004; PEIXOTO et al.,
2006) e pela presença de horizontes coesos (PAIVA et al., 1998). Salienta-se que o
requerimento hídrico para uma boa produção de frutos em citros é cerca de 900 a
1.200 mm por ano e varia com a demanda evapotranspirométrica, solo, copa e com
o porta-enxerto utilizado (DONATO et al., 2007). Na Bahia, mesmo a faixa citrícola
apresentando volume de chuvas considerado quase ideal (em torno de 1.100 mm), a
produção é afetada pela má distribuição e intensidade irregular destas chuvas,
principalmente nos períodos críticos de floração e frutificação (CUNHA SOBRINHO;
PASSOS, 2004).
As plantas são impostas ao estresse por seca quer quando o abastecimento
de água às raízes se torna difícil ou quando a taxa de transpiração se torna muito
alta (ANJUM et al., 2011). Mudanças climáticas levam a uma maior demanda de
água atmosférica e, conseqüentemente, a uma taxa aumentada de
evapotranspiração das culturas e depleção de água do solo (LAVOIE-LAMOUREUX
et al., 2017). A limitação excessiva de água prejudica o crescimento vegetativo,
provocando abortamento de frutos jovens, redução no desenvolvimento e qualidade
interna e externa dos frutos, causando importantes perdas econômicas em pomares
(PÉREZ-PÉREZ et al., 2008; RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010; LAVOIE-
LAMOUREUX et al., 2017).
A produção de alimentos em todo o mundo é afetada por secas periódicas e a
agricultura mundial está enfrentando o desafio de aumentar a produtividade, a fim de
acompanhar a crescente demanda de alimentos da população em crescimento
(SHABALA, 2017; SINGH et al., 2017). Neste contexto, têm-se enfrentado muitos
desafios, como produzir mais alimentos para a população crescente, e a
produtividade das culturas não está aumentando em paralelo com a demanda de
alimentos (PARIHAR et al., 2014). Então, para garantir que o abastecimento
acompanhe o crescimento populacional, é necessária uma compreensão completa
21
dos processos envolvidos no crescimento e no desenvolvimento das culturas para o
manejo das práticas agronômicas (ANJUM et al., 2011).
3.3 Respostas ao Déficit Hídrico
Os estresses ambientais desencadeiam uma grande variedade de respostas
nas plantas, e estas evoluíram seus mecanismos para monitorar com precisão o
ambiente e reprogramar seu metabolismo por uma rede de sinalização robusta para
ajustar o seu crescimento e desenvolvimento de acordo com uma ampla gama de
sinalizações fisiológicas, bioquímicas e moleculares para percepção, reação e
adaptação, permitindo sobrevivência e reprodução (ANJUM et al., 2011; CLAEYS;
INZÉ, 2013; OSAKABE et al., 2014; SMEKALOVA et al., 2014). A deficiência hídrica
provoca alterações comportamentais que podem ser reversíveis ou irreversíveis, e
condicionam a planta estratégias para aclimatação ou adaptação, influenciadas por
fatores como severidade e duração do estresse, estádio e idade da planta bem
como pela competição com plantas vizinhas (SANTOS; CARLESSO, 1998; ZHAO et
al., 2014; GILBERT; MEDINA, 2016).
3.3.1 Fisiológicas
Para produzir de forma economicamente viável, torna-se necessário
satisfazer a fisiologia do vegetal, fornecendo à planta, no momento preciso, a
quantidade de água suficiente para que ela se desenvolva normalmente e alcance o
máximo de seu rendimento (OLIVEIRA; COELHO, 1980). Então, a produtividade da
planta depende da quantidade de água disponível e da eficiência do seu uso pelo
organismo (TAIZ; ZEIGER, 2004).
As plantas cítricas apresentam uma dinâmica de crescimento que está
diretamente relacionada às alterações ambientais (CASTRO NETO, 2013), sendo
que diversas respostas são observadas em restrição hídrica, como: a redução na
taxa de divisão e expansão celular, reduzindo o tamanho da folha e área de
transpiração; fechamento estomático; ajustamento osmótico e manutenção do
turgor; o alongamento do caule e crescimento de raiz; a redução das relações de
nutrientes e eficiência do uso da água, inibição de crescimento bem como da
produtividade das culturas (CHAVES et al., 2003; FAROOQ et al., 2012).
22
As plantas podem adotar duas diferentes estratégias para contornar os efeitos
potencialmente nocivos causados pela seca: prevenção ou tolerância ao estresse
(VERSUES et al., 2006; LAWLOR, 2013). A prevenção do estresse tem como
objetivo o equilíbrio da absorção e perda de água (CLAEYS; INZÉ, 2013) e ocorre
pela eficiência para absorver a água pelo sistema radicular, seja pelo
aprofundamento da raiz ou pela maior densidade (BLUM, 2005). Por conseguinte, os
mecanismos de tolerância visam proteger a célula de lesões graves quando os
mecanismos de prevenção ainda não são suficientes, dentre os quais inclui:
fechamento de estômatos para evitar perdas de água por transpiração,
desintoxicação de espécies reativas de oxigênio (ROS), acúmulo de proteínas
protetoras e solutos, redução de crescimento, dentre outros.
Uma das principais sinalizações é o fechamento estomático que pode
ocasionar alterações na transpiração e fotossíntese, gerando custos para a
temperatura da folha, que é um fator importante no controle do estado da água das
folhas sob o estresse por seca e no crescimento da planta (ANJUM et al., 2011;
MARTIN-STPAUL et al., 2017). O fechamento estomático reduz a evaporação foliar
e é uma das primeiras linhas de defesa contra a dessecação, uma vez que é um
processo mais rápido e flexível, principalmente a curto prazo (CHAVES, 1991). A
condutância estomática é um mecanismo bastante eficiente no controle da perda de
água na planta em condições de déficit hídrico tornando-se um potencial indicador
da tolerância à seca (PEDROSO et al., 2014; ULLAH et al., 2017).
A inibição de crescimento da parte aérea, tanto diretamente através de uma
resposta ativa e indiretamente pelo fechamento dos estômatos, também é um dos
efeitos do estresse por seca, havendo limitação da expansão foliar e com o aumento
da intensidade do estresse podendo acarretar em abscisão foliar, a fim de contribuir
para economia de água, permitindo a realocação de nutrientes armazenados em
folhas mais velhas para o caule e as folhas mais jovens (KHANNA-CHOPRA et al.,
1999; CHAVES et al., 2003; CLAEYS; INZÉ, 2013). A área foliar e a condutância
estomática são os principais fatores que afetam as taxas transpiratórias e, com isso,
a sua diminuição permite que o potencial hídrico aumente ou se mantenha dentro
dos limites que possibilitem o desenvolvimento vegetal (VERSLUES et al., 2006).
Quando o potencial hídrico foliar cai abaixo de um determinado limiar há o
fechamento estomático em resposta a limitação hídrica (FANG; XIONG, 2015).
23
O potencial de água da folha é considerado um parâmetro confiável para
quantificar a resposta ao estresse hídrico da planta (SIDDIQUE et al., 2000) por
determinar a quantidade de água celular disponível no tecido para a realização de
trabalho químico. No período antemanhã, diante da redução das perdas de água por
evapotranspiração, este pode ser usado como uma medida indireta favorável para
indicar o comportamento do potencial hídrico do solo (KRAMER; BOYER, 1995;
TAIZ; ZEIGER, 2004). Por este parâmetro é possível monitorar a intensidade do
estresse e correlacionar com o teor relativo de água foliar indica o estado hídrico da
planta, no qual com a menor demanda de água, há uma redução destes parâmetros
e consequentemente da taxa fotossintética (MEDINA et al., 1999; SIDDIQUE et al.,
2000).
As variações no potencial da água da planta também podem ser atribuídas a
uma mudança na potencial osmótico (SIDDIQUE et al., 2000). Em resposta ao
estresse por déficit hídrico, os sistemas iônicos e o transporte de água através das
membranas funcionam para controlar as mudanças de pressão de turgescência em
células guarda e estimular fechamento estomático (OSAKABE et al., 2014). Esta
acumulação de uma mistura complexa de ácidos orgânicos, açúcares e aminoácidos
é denominada de ajustamento osmótico (NOGUEIRA et al., 2001) e é um dos mais
frequentes mecanismos de tolerância à seca em plantas (MEDINA et al., 2005). O
ajuste osmótico permite que as plantas mantenham o turgor da folha necessário
para a abertura estomática, sustentando a fotossíntese e o crescimento
(RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010).
3.3.2 Bioquímicas e Moleculares
Durante a deficiência hídrica, podem ocorrer também alterações bioquímicas
e moleculares por uma complexa rede de interação de sinais, hormônios e proteínas
que permitem à sinalização de estresse e a ativação de mecanismos que
possibilitem adaptação e sobrevivência sob condições ambientais adversas (PELEG;
BLUMWALD, 2011; RODZIEWICZ et al., 2014; SMEKALOVA et al., 2014; ARBONA
et al., 2017).
As espécies reativas de oxigênio (ROS) são produzidas naturalmente através
do metabolismo celular de organelas como as mitocôndrias, cloroplastos e
peroxissomos pelo vazamento inevitável de elétrons em O2 ou como subproduto de
24
várias vias metabólicas localizadas em diferentes compartimentos celulares, sendo
produzidos o oxigênio singleto (1O2), o radical superóxido (•O2 −) e hidroxil (•OH) e o
peróxido de hidrogênio (H2O2) (KARUPPANAPANDIAN et al., 2011; SHARMA et al.,
2012). Entretanto, com a limitação hídrica podem ocorrer danos no aparato
fotossintético aumentando o estresse oxidativo, provocado pela intensificação da
formação de ROS, que atingem moléculas vitais como lipídios, proteínas e ácidos
nucléicos, gerando distúrbios estruturais, metabólicos e fisiológicos nas células
vegetais, podendo levá-las à morte (BRAY et al., 2000; HALLWELL; GUTTERIDGE,
2006; SHARMA et al., 2012).
Ainda não está totalmente elucidado o papel da produção e controle das
concentrações de ROS durante o estresse hídrico em plantas, todavia observam-se
alterações na produção de ROS em condições de estresse (NUNES JUNIOR et al.,
2017). Neste sentido, as ROS parecem ter um duplo efeito sob condições de
estresse abiótico que dependem de sua quantidade celular global, logo se
mantiveram níveis relativamente baixos, provavelmente funcionarão como
componentes de uma via de sinalização de estresse, provocando respostas de
defesa/aclimatação do estresse, enquanto em concentrações elevadas, as ROS
causam dano às biomoléculas (SHARMA et al., 2012; REN et al., 2016).
O que determinará se a presença de ROS indica sinalização ou molécula
prejudicial é o equilíbrio entre a produção e eliminação destas moléculas evitando o
estresse oxidativo (SHARMA et al., 2012). A eliminação das ROS é realizada por
compostos antioxidantes como a glutationa reduzida (GSH), ascorbato (AsA),
tocoferol, vitaminas e pigmentos carotenóides, os quais agem em conjunto com as
enzimas antioxidantes superoxidase dismutase (SOD), glutationa redutase (GR),
catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX) (GRATÃO et al., 2005). Em plantas
sob estresse hídrico, observa-se um aumento na atividade dessas enzimas
relacionado ao aumento na tolerância à seca (XIONG et al., 2002).
Uma das principais enzimas do sistema de defesa antioxidante é a SOD, que
constitui o primeiro nível de defesa contra os radicais superóxido (ZANDALINAS et
al., 2017). A enzima SOD atua na conversão do radical superóxido (•O2 −) a
peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio (O2). O H2O2 por sua vez, devido à sua
toxicidade, é dismutado em H2O e O2 pelas enzimas CAT, APX e GPX, a fim de
diminuir os efeitos citotóxicos no vegetal (SHEHAB et al., 2010). A GPX está
associada com muitos processos biossintéticos, incluindo lignificação da parede de
25
celular, degradação do ácido indolacético (AIA), biossíntese do etileno, e defesa
contra estresses bióticos e abióticos nas plantas (GILL; TUTEJA, 2010; SHARMA et
al., 2012). Esses estresses abióticos, como a seca, induzem a expressão de um
grande número de genes (TODAKA et al., 2015) e a existência de respostas
específicas de variedade sugere uma considerável plasticidade genética no controle
da resposta ao crescimento na limitação de água (CLAEYS; INZÉ, 2013).
3.4 Melhoramento Genético
A seleção de porta-enxertos tolerantes é uma estratégia eficiente para mitigar
os efeitos do déficit hídrico em muitas culturas (ALBACETE et al., 2015; BERDEJA
et al., 2015; TWORKOSKI et al., 2016; LÓPEZ-MARÍN et al., 2017), sendo a melhor
opção para a produção de culturas, a melhoria do rendimento e a estabilidade da
planta diante das condições de estresse (SIDDIQUE et al., 2000). O
desenvolvimento de plantas com maior capacidade de sobrevivência e crescimento
pelo emprego adequado de caracteres fisiológicos e/ou bioquímicos durante o
estresse é fundamental na seleção de materiais para tolerância as condições de
seca em programas de melhoramento (NOGUEIRA et al., 2011; OSAKABE et al.,
2014).
Na citricultura, a busca é pela seleção de porta-enxertos mais ao convívio das
mudanças climáticas, principalmente com potencial para tolerância à seca (NEVES
et al., 2013; PEDROSO et al., 2014; GONÇALVES et al., 2016; SANTANA-VIEIRA et
al., 2016; DUTRA-SOUZA et al., 2017; SANTOS et al., 2017). Os efeitos do estresse
da seca podem ser gerenciados pela seleção dos genótipos vegetais mais
adequados, sendo estes fundamentais para manutenção e melhoria da cadeia
produtiva citrícola juntamente com o ajuste das práticas agronômicas (densidade da
planta; manejo do solo) a fim de permitir uma produtividade aceitável sob menor
disponibilidade de água (FAROOQ et al., 2009; TARDIEU, 2012).
A seleção de genótipos que apresentem mutações ou recombinações nos
genes envolvidos na tolerância a estresses abióticos é de grande valor, pois se
estas diferenças forem expressas em melhoria, possivelmente esses genes podem
ser transferidos para cultivares comerciais, possibilitando a obtenção de genótipos
mais produtivos (MAGALHÃES JUNIOR, 2010). Sendo assim, germoplasma
contendo genótipos que possuam diversidade de respostas à deficiência hídrica, é
26
de interesse em programas de melhoramento genético, sendo importante o
conhecimento dos mecanismos relacionados a tais respostas diferenciais (PEIXOTO
et al., 2006). Todavia, todos porta-enxertos usados atualmente, no mundo, possuem
limitações o que permitiu ao longo de muitos anos seleções por porta-enxertos
adaptados as suas condições. Por esse motivo, os principais países produtores de
citros conduzem programas de melhoramento contínuos para obtenção de porta-
enxertos (CRISTOFANI et al., 2005)
O melhoramento genético dos citros por métodos tradicionais como via
hibridação apresentam vários obstáculos, dentre os quais se sobressaem: (1)
poliembrionia, que dificulta a identificação de híbridos; (2) elevada heterozigosidade,
que leva à formação de híbridos com características diversas; e (3) longo período
pré-reprodutivo, dado que a frutificação dos híbridos obtidos não raramente tem
início somente aos sete ou mais anos de idade (SOARES FILHO et al., 2013). Entre
esses fatores, a apomixia e/ ou poliembrionia talvez seja o que mais dificulta a
obtenção de grande número de indivíduos zigóticos na progênie, uma vez que o
desenvolvimento de populações segregantes é condição para o estabelecimento de
um programa de melhoramento bem sucedido havendo, portanto, necessidade de
recuperar e selecionar o embrião zigótico (CRISTOFANI et al., 2005)
Dentre os híbridos desenvolvidos pela Embrapa Mandioca e Fruticultura, o
‘LCR x TR - 001’, ‘TSKC x CTSW – 041’, ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’ e ‘HTR-069’
foram avaliados como porta-enxertos para laranjeira ‘Valência’ e induziram redução
no tamanho da copa e maior eficiência na produção de frutos com boa qualidade em
comparação a porta-enxertos tradicionais, como o limoeiro ‘Cravo’ e a tangerineira
‘Sunki’. Além disso, apresentaram alta tolerância à seca, com resultados superiores
ao limoeiro ‘Cravo’ e precocidade na produção, com pouca suscetibilidade à gomose
e tolerância ao CTV (RODRIGUES et al., 2014; RAMOS et al., 2015; RODRIGUES
et al., 2015). Destacam-se os híbridos 'TSKC × (LCR × TR) - 059' e 'LCR × TR - 001'
com maior eficiência de produção e maior tolerância à seca quando comparados aos
outros híbridos, com melhor uso de água disponível (RAMOS et al., 2015). Neste
contexto, a seleção de novas variedades cítricas no cenário atual, torna-se
preponderante para a ampliação da base genética atual focada na maior
produtividade e sobrevivência em condições de estresse.
27
4 Material e Métodos
4.1 Experimento I
O Experimento foi realizado em ambiente protegido e controlado (FITOTEC –
modelo: LT 13,76 UTFP), com temperatura e umidade de 26°C e 70% Umidade
Relativa do Ar (UR), respectivamente, para o período diurno, e 21°C e 80% UR para
o período noturno, com fotoperíodo de 12h. O FITOTEC está localizado no
Laboratório de Ecofisiologia da Embrapa Mandioca e Fruticultura, município de Cruz
das Almas, BA (Latitude: 12º 40’ 39’’ S; Longitude; 39º 06’ 23’’ W; Altitude: 225m).
Sementes dos híbridos ‘LCR x TR - 001’, resultante do cruzamento entre
Limoeiro ‘Cravo’ (Citrus limonia L. Osbeck) x Trifoliata (Poncirus trifoliata L. Raf.) ;
‘TSKC x CTSW - 041’, resultante do cruzamento entre Tangerineira ‘Sunki’ {[C. sunki
(Hayata) hort. ex Tanaka] seleção comum} x citrumelo ‘Swingle’ (C. paradisi Macfad.
x P. trifoliata); ‘TSKC x (LCR x TR) - 059’, resultante do cruzamento entre
Tangerineira ‘Sunki’ {[C. sunki (Hayata) hort. ex Tanaka] seleção comum} x citrumelo
‘Swingle’ (C. paradisi Macfad. x P. trifoliata); e ‘HTR - 069’, resultante do cruzamento
entre Híbrido trifoliado obtido por cruzamentos não identificados utilizando "lima
Rangpur", mandarina "Cleopatra" (C. reshni Hort. Ex Tan.) e laranja doce, foram
semeadas em tubetes de 290 cm3 contendo substrato Plantmax e cultivados por 120
dias em telado antiafídeo. As plântulas de origem nucelar foram transplantas para
tubos de PVC com 0,3 m de comprimento e 0,075 m de diâmetro contendo areia
lavada e acomodadas no FITOTEC. A umidade do substrato foi mantida na máxima
retenção de água (0,15 cm3 cm-3) para todas as parcelas experimentais, durante o
período de aclimatação de 20 dias. Solução nutritiva (Forth Nutri) foi utilizada para a
irrigação, e o volume de água utilizado para reestabelecer a umidade do substrato
na capacidade de campo era com base no volume de água transpirada do substrato,
determinado pela diferença entre a massa do vaso no dia e a massa do vaso com
28
umidade de 0,15 cm3 cm-3. Decorrido o período de incubação, houve a suspensão
da irrigação das parcelas experimentais destinadas ao tratamento déficit hídrico e o
momento de avaliação e coleta de material vegetal foi definido quando uns dos
híbridos apresentasse folhas enroladas, como um processo de ajustamento
fisiológico ao déficit hídrico.
As variáveis analisadas foram: Umidade do Substrato pelo método
gravimétrico; Condutância Estomática (gs) com uso do porômetro (Decagon Device,
Inc., Washington, USA); Temperatura Foliar (°C) com o uso de termômetro
infravermelho; Área Foliar (cm2) segundo metodologia proposta por Dultra et al.
(2017) ; Número de Folhas; Altura de Planta (cm); Diâmetro de Caule (mm); Massa
Seca de Folha - MSF (g); Massa Seca da Parte Aérea – MSPA (g); Massa Seca de
Raiz – MSR (g). O Crescimento Foliar (cm2) foi determinado pela diferença entre a
área foliar final e a área foliar no início da imposição do déficit hídico. O
Comprimento Total de Raiz (cm), Diâmetro Médio de Raiz (mm) e Comprimento de
Raiz em Diferentes Classes de Diâmetro (cm) foram obtidos por processo de
digitalização das imagens, realizado por meio de escâner com o uso do software
WinRizho, versão 2013d.
O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial foi
4x2, sendo quatro híbridos e dois manejos hídricos (controle e déficit hídrico), com
três repetições.
Os resultados dos parâmetros avaliados foram submetidos à análise de
variância e teste de Tukey com significância do teste F de até 5% de probabilidade
(p ≤ 0,05). Todas as análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do
aplicativo SISVAR (FERREIRA, 2011).
4.2 Experimento II
4.2.1 Material vegetal e condições experimentais
O experimento foi conduzido em telado antiafídeo, no período de dezembro
de 2015 a outubro de 2016, na Embrapa Mandioca e Fruticultura, situada no
município de Cruz das Almas, Bahia, Brasil (Latitude: 12º40’39’’S, Longitude; 39º06’
23’’W, Altitude; 225m). Dados de temperatura e umidade relativa do ar (UR) foram
29
obtidos do Instituto Nacional de Meteorologia (INMET), localizado na Embrapa
Mandioca e Fruticultura, com temperatura média de 24,9 C e UR média de 79,8 %,
durante o período experimental.
Foram avaliados quatro porta-enxertos híbridos de citros selecionados pelo
Programa de Melhoramento Genético da Embrapa Mandioca e Fruticultura com
potencial para tolerância a seca (RODRIGUES et al., 2015; RAMOS et al., 2015),
enxertados com a copa Laranjeira ‘Valencia’ (Citrus sinensis L. Osb.). As mudas de
aproximadamente um ano de idade foram transplantadas para vasos plásticos de
100 dm3, perfurados e previamente divididos em quatro compartimentos por tela
antiafídeo e preenchidos com 89,94 dm3 de solo a uma densidade de 1,5 kg dm-3.
Cada compartimento representou uma parcela experimental com 22,50 dm3 de solo
e, portanto, cada vaso foi composto por quatro parcelas experimentais com quatro
plantas de citros, sendo uma de cada híbrido avaliado (Figura 1). Os vasos foram
cobertos com papel filme de PVC e papel alumínio para que a perda de água do solo
se desse somente por transpiração da planta.
30
Figura 1. Vasos plásticos de 100 dm3 divididos em quatro compartimentos por tela
antiafídeo.
O solo utilizado foi coletado a uma profundidade de 0-50 cm em uma área
experimental da Embrapa Mandioca e Fruticultura e classificado como Lalossolo
Amarelo distrocoeso (SANTOS et al., 2013). Com base na análise química do solo
(Tabela 1), realizou-se a calagem visando elevar a saturação por bases para 70%
com o uso de calcário dolomítico, e foi aplicado 100 mg dm-3 de P2O5 e 50 mg dm-3
de K2O, ambos em dose única. A adubação nitrogenada foi parcelada em três
aplicações de 50 mg dm-3 aos 20, 40 e 60 dias após o transplantio, e a torta de
mamona (80g vaso-1) foi utilizada como fonte de micronutrientes.
Tabela 1. Análise química e granulométrica de amostra de um Latossolo Amarelo ditrocoeso coletado na área experimental II da Embrapa Mandioca e Fruticultura na camada de 0-50 cm
pH Na Ca Mg Al H+Al SB CTC V P K M.O Areia Silte Argila
H2O ------------------------ cmolc dm-3
------------------------ % -- mg dm-3
-- -------------- g Kg-1
---------------
5,2 0,03 0,76 0,53 0,3 3,19 1,45 4,64 31 2,0 0,13 8,0 647 79 274
Decorrido trinta dias de incubação do calcário, as mudas de citros foram
transplantadas dos sacos plásticos com 3 litros do substrato casca de pinus para os
vasos com solo. Realizou-se a poda e a desfolha quinze dias após o transplantio,
padronizando as mudas com trinta centímetros de altura.
Os tratamentos constituíram da combinação de quatro porta-enxertos e quatro
ou cinco regimes hídricos em esquema fatorial 4x4 ou 4x5, a depender da variável
analisada. Os porta-enxertos (001, 041, 059 e 069) e os regimes hídricos (Controle -
CO, Estresse Leve - MI, Estresse Moderado - MO e Reidratado - RE; ou Controle -
CO, Estresse Leve - MI, Estresse Moderado - MO, Estresse Severo - SE e
Reidratado - RE) foram combinados em delineamento inteiramente casualizado com
5 repetições, totalizando 80 parcelas que foram representadas por 20 vasos. Cada
parcela experimental equivaleu a ¼ de um vaso.
O tratamento SE é resultado das variáveis analisadas das plantas
pertencentes ao tratamento reidratado quando elas estavam em condições de déficit
hídrico com L -3,5 MPa, antes da reidratação.
31
Os regimes hídricos foram definidos com base no potencial hídrico foliar. Para
o tratamento CO, a umidade do solo ficou sempre situada próximo a capacidade de
campo e o L foi mantido entre -0,1 e -0,5 MPa; para o tratamento MI, houve a
suspensão da irrigação e o estresse foi caracterizado quando as folhas atingiram
valores de L entre -1,0 e -1,5 MPa; para o tratamento MO, houve a suspensão da
irrigação e o estresse foi caracterizado quando as folhas atingiram valores de L
entre -2,5 e -3,5 MPa; para o SE, foi definido valores de L menores que -3,5 MPa; e
para o tratamento RE, depois que as plantas atingiram L abaixo de -3,5 MPa a
umidade do solo foi elevada para a capacidade de campo e 24 h depois as análises
foram realizadas.
As avaliações fisiológicas in situ e coleta de material vegetal foram realizadas
quando as quatro plantas de cada vaso estavam dentro da faixa de potencial hídrico
foliar que caracterizou cada tratamento. Dois dias antes de suspender a irrigação
para dar início aos estresses, a área foliar foi uniformizada em cada vaso. Dessa
forma, as quatro plantas dos diferentes porta-enxertos foram submetidas ao déficit
hídrico com a mesma área foliar.
O volume de água utilizado para a irrigação foi determinado pela equação de
van Genuchten, conforme a curva de retenção de água do solo, que descreve a
variação da umidade do solo em função da tensão (Figura 2). A capacidade de
campo de -10 kPa foi utilizada conforme indicação de Bernardo (2006). A umidade
do solo foi determinada a partir de medições de umidade volumétrica, em cada
parcela experimental, obtidas com uso de TDR (Reflectometry Domain Time), com
valores corrigidos com base na curva de calibração das sondas em amostras
indeformadas das unidades experimentais (Figura 3). O valor médio da umidade dos
quatro compartimentos do vaso foi utilizado para calcular o volume de água a ser
utilizado na irrigação, com leituras realizadas em dias intercalados para auxiliar no
manejo da irrigação e caracterização do secamento do solo.
32
Figura 2. Curva de retenção de água no solo prevista pelo modelo de van Genuchten para os pontos de 0, 10, 33, 100, 300 e 1500 KPa.
Figura 3. Relação entre constante dietétrica do solo (Ka) e umidade volumétrica (cm3 cm-3).
4.2.2 Relação entre Transpiração Relativa e Fração de Água Transpirável
A transpiração relativa foi calculada pela equação 1 (SINCLAIR; LUDLOW,
1986) com base nos dados de transpiração das plantas.
(1)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
θ (
cm3
cm-3
)
Potencial Matricial (KPa)
Equação de van Genuchten (1980)
θ = 0,00005ka3 - 0,0022ka2 + 0,0474ka - 0,1693 R² = 0,9983
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
5 7 9 11 13 15 17 19 21
Ѳ (
cm³
cm- ³
)
Constante Dielétrica (ka)
33
Em que:
TR = Transpiração relativa
TTd = Transpiração dos tratamentos que sofrem déficit hídrico, em cm3 cm-3
TTo = Transpiração do tratamento sem déficit hídrico, em cm3 cm-3
A fração de água transpirável do solo, em condições de deficiência hídrica, foi
calculada de acordo com a metodologia adota por Sinclair e Ludlow (1986), segundo
a equação 2:
(2)
Em que:
FAT = Fração de Água Transpirável
θ inicial = umidade volumétrica no momento que a irrigação foi interrompida
θ do dia = umidade volumétrica no dia que as leituras eram realizadas
θ final = umidade volumétrica no final do período que caracterizou cada tratamento.
4.2.3 Potencial Hídrico Foliar (L)
A segunda ou terceira folha totalmente expandida e madura a partir do ápice
da planta foi utilizada para determinar o potencial hídrico foliar (L) no período entre
2 - 4 horas da manhã (potencial hídrico antemanhã) utilizando uma câmara de
pressão Scholander (M670, PMS Instrument Co., Albany, OR, EUA), segundo a
metodologia descrita por Scholander et al. (1965). Houve o monitoramento durante o
período experimental do L para que as avaliações fisiológicas e coletas de material
vegetal situasse dentro da faixa de potencial determinado para cada tratamento.
4.2.4 Potencial de Turgor (p)
O potencial de turgor (p) das folhas foi determinado com o uso do
equipamento Wiltmeter® desenvolvido pela Embrapa Instrumentação e estimado a
partir da equação 3, proposta por Calbo e Nery (1995) e Calbo et al. (2010).
34
p = Py – fw (3)
Em que:
p = Potencial de turgor (MPa)
Py = Pressão no momento da leitura registrada pelo manômetro do aparelho
fw = Fator de wiltmeter
4.2.5 Teor Relativo de Água (RWC) na Folha
Ao atingir a faixa de potencial hídrico foliar caracterizada para cada
tratamento, as folhas foram coletadas para determinar o teor relativo de água de
acordo com Barrs e Weatherley (1962). Com um cilindro de metal de 2 cm de
diâmetro, retirou-se dez discos foliares em cada pool amostral e, imediatamente, os
discos foliares foram pesados para determinar o massa fresco (MF). Em seguida, os
discos foram imersos em água destilada e armazenados em ambiente escuro a 4 ºC
por 24h e pesados após esse período para determinar o massa túrgido (MT).
Posteriormente os discos foliares foram secos em estufa de circulação forçada de ar
a 70 ºC até peso constante e obteve-se o massa seca (MS).
RWC foi calculado como (Equação 4):
(4)
4.2.6 Fluorescência da Clorofila a
As medições da emissão de fluorescência da clorofila a foram efetuadas em
folhas maduras entre 8 e 10 h. As folhas selecionadas foram submetidas a um
período de adaptação ao escuro por 20 minutos, suficiente para a oxidação
completa dos centros de reação. Foi usado o medidor portátil de luz modulada (opti-
Sciences, modelo OS5p, Hudson, USA). Os sinais de fluorescência foram
registrados no sistema de aquisição de dados do aparelho, que calcula
automaticamente as fluorescências mínima (Fo), máxima (Fm) e o rendimento
quântico potencial máximo do fotossistema II (Fv/Fm).
35
4.2.7 Trocas Gasosas Foliares
As taxas de fotossíntese líquida por unidade de área foliar (A), a condutância
estomática ao vapor de água (gs), a taxa transpiratória foliar (E) e a concentração de
carbono intercelular (Ci) foram estimadas a partir dos valores da variação de CO2 e
da umidade do ar no interior da câmara, determinados pelo analisador portátil
LCpro-SD IRGA (ADC biotech-scientific Limited, UK). As medições foram realizadas
entre 8 - 10 h, sempre na mesma folha, localizada no terço médio de cada planta.
4.2.8 Eficiência de Uso da Água
Três formas de expressar a eficiência de uso da água foram utilizadas nas
análises e interpretação dos dados experimentais. Eficiência instantânea de uso da
água (A/E), calculada pela razão entre a taxa fotossintética líquida (A) e a taxa de
transpiração (E); eficiência intrínseca de uso da água (A/gs), calculada pela razão
entre a taxa fotossintética líquida (A) e a condutância estomática (gs); e a razão
entre as concentrações intercelular e atmosférica de CO2 (Ci/Ca).
4.2.9 Parâmetros da Curva Pressão-Volume (PV) em Folhas
Três folhas de cada planta (réplica técnica), de quatro parcelas experimental
(réplica biológica) para cada tratamento (controle, estresse moderado e reidratado),
foram coletadas e vedadas em sacos plásticos e armazenadas em caixa de isopor
em condição refrigerada e levadas imediatamente para o laboratório de Ecofisiologia
Vegetal da Embrapa Mandioca e Fruticultura. O pecíolo foi cortado a 0,5 cm da
inserção com o ramo e imediatamente imerso em água destilada por um período de
24 horas em ambiente escuro a 4 ºC para total reidratação das folhas. Após
reidratação, procedeu-se a pesagem da folha, com precisão de 0,0001 g para
obtenção de peso túrgido e em seguida determinou-se o L, utilizando uma câmara
de pressão tipo Scholander (M670, PMS Instrument Co., Albany, OR, EUA),
segundo a metodologia descrita por Scholander et al. (1965). A massa fresca das
folhas e as medidas do L foram obtidas em intervalos de 1 hora e o procedimento
36
foi finalizado quando as folhas atingiram o L ≤ -3,50 MPa. Nos intervalos entre as
pesagens e medidas de L, as folhas foram deixadas sobre a bancada para
desidratação pelo processo de transpiração livre sob temperatura ambiente.
Subsequentemente, a massa seca foi determinada após a folhas serem secas em
estufa de circulação forçada de ar a 75°C até peso constante. Com os dados
obtidos, as relações pressão-volume foram obtidas conforme detalhado por DaMatta
et al. (1993). Os cálculos dos parâmetros teor relativo de água no ponto de perda de
turgor (RWCTLP), potencial osmótico em plena turgescência (0), potencial osmótico
no ponto de perda da turgescência (TLP) e módulo de elasticidade (ε) foram
calculados utilizando planilhas de análises conforme descritos por Koide et al. (2000)
e Sack et al. (2003).
4.2.10 Potencial Osmótico ()
Folhas de citros dos respectivos tratamentos foram prensadas e recolhidos 10
µL da solução para análise de potencial osmótico por meio de osmômetro de
pressão de vapor modelo VAPRO 5520 (Wescor, Ins., Logan, UT, EUA). Os valores
de potencial osmótico foram obtidos a partir da osmolalidade (mmol L-1) da seiva do
tecido foliar, mediante o uso da equação de Van’t Hoff (REICHARDT; TIMM, 2004)
(Equação 5), cujos resultados foram expressos em MPa.
= - R . T . C (5)
Em que:
= Potencial osmótico da solução (MPa)
R = Constante universal dos gases (0,00831 kg MPa mol-1 K-1)
T = Temperatura absoluta da solução (ºK)
C = Concentração de solutos na solução (mmol L-1)
4.2.11 Atividade da Dismutase do Superóxido (SOD)
Uma unidade de atividade enzimática (UA) de SOD foi determinada medindo-
se a capacidade da enzima em obter 50% de inibição da redução fotoquímica de
nitroazul de tetrazólio (NBT), que leva à formação de um precipitado de cor azul
37
denominado formazana. O método utilizado para avaliação da atividade enzimática
foi descrito por Gianopolitis e Ries (1977), com modificações. Ao extrato bruto, foi
adicionado o tampão de extração contendo: tampão fosfato de potássio (50 mM / pH
6,0), EDTA (1mM) e metionina (13 mM). A atividade enzimática foi iniciada com a
adição de riboflavina (1mM). A leitura inicial ocorreu após a placa ter ficado no
escuro por 5 min, sendo a segunda leitura realizada após a placa ter sido submetida
a luz fluorescente de 15W, expostas por mais 5 min. Após iluminação, a reação foi
finalizada e as amostras lidas em espectrofotômetro de microplacas Espectramax
Paradigm (Molecular Devices) a 560 ƞm. Foram considerados como brancos os
poços que não continham extrato vegetal bruto.
4.2.12 Atividade da Peroxidase do Guaiacol (GPX)
Preparou-se para o ensaio enzimático microplacas de 96 poços contendo 140
µL de tampão de reação GPX 2x [40 mmol L-1 de guaiacol, H2O2 a 0,06% e fosfato
de sódio (20 mmol L-1, pH 6.0)],135 µL de tampão fosfato (50 mmol L-1, pH 6,0) e 5
µL de extrato enzimático, que foi previamente diluído. A leitura das amostras foi
realizada em espectrofotômetro de microplacas Espectramax Paradigm (Molecular
Devices), em comprimento de onda de 470 ƞm. A atividade de peroxidases foi
expressa com o aumento do consumo de guaiacol em µmol s-1 g-1 de biomassa
seca. A conversão dos dados obtidos em valores de absorbância a 470 nm min-1 g-1
de matéria seca para consumo de guaiacol em mmol h-1 g-1 de matéria seca foi feita
com o uso da equação y = 0.1284x + 0.0189 (R2=0.99) originada a partir de uma
curva padrão para GPX (Rehem et al., 2011).
4.2.13 Extração de RNA e Síntese de cDNA
O pool de RNA total de folhas das plantas submetidas ao tratamento controle
e estresse leve foi isolado utilizando o RNeasy Micro Kit (Qiagen). A qualidade e a
integridade do RNA extraído foram avaliadas por análise em gel de agarose 1% e
quantificado utilizando NANOdrop. As amostras foram tratadas com DNAse I, RNAse
free (Fermentas Life Science), após o processo de extração, seguindo as instruções
do fabricante (1µl de DNAse). A reação de transcrição reversa foi realizada usando o
38
kit RevertAid H Minus (Fermentas – First Strand cDNA Synthesis Kit), seguindo as
instruções do fabricante.
4.2.14 Análise de PCR em Tempo Real (qRT-PCR)
Para as análises de expressão gênica via qRT-PCR foram utilizados
oligonucleotídeos especificamente desenhados para a amplificação dos genes que
codificam enzimas envolvidas na resposta ao estresse oxidativo, baseado em suas
sequências disponíveis no banco de informação genômica de Citrus sinensis, no
Phytozome (http://www.phytozome.org/), conforme descritos na Tabela 2.
As reações foram realizadas em termociclador da Stratagene Mx 3005P
(Agilent Technologies), contendo o software MxPro-Mx 3005P, usando o kit
Maxima™ SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Scientific). O gene utilizado
como controle endógeno (gene de referência) foi o da gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase C2 (GAPC2) (Mafra et al., 2012). As reações foram feitas em três
réplicas, o volume utilizado na reação foi de 22 µL, contendo 100 ng de cDNA, 1 µL
de cada primer especifico (R+F) 10 µmol.L-1 e 11 µL de Maxima® SYBR
Green/ROX qRT-PCR Master Mix (2X) (Fermentas). Para testar a especificidade dos
oligonucleotídeos, os produtos foram analisados por curva de dissociação. A
ciclagem de amplificação foi realizada nas seguintes etapas: 50°C por 2 minutos,
95°C por 10 minutos, 95°C por 15 segundos e 60 °C por 1 minuto. Essas etapas
foram repetidas por 40 ciclos. Após a ciclagem de amplificação dos genes, foi
realizada a dissociação dos produtos para confirmar a formação de produtos únicos
e específicos, neste caso as etapas realizadas apresentaram as seguintes
características: 95 °C por 15 segun dos, 60 °C por 1 minuto e 95 °C por 1 segundo.
Para quantificação da expressão utilizou-se o método 2-∆∆Ct (Livak; Schmittgen,
2001), considerando a média dos valores de Ct das três réplicas realizadas.
Tabela 2. Oligonucleotídeos empregados nas análises de qRT-PCR
Gene Loco Oligonucleotídeo
SOD orange1.1g032551m Forward: 5’-TAGGCTTGGGTAAATCCGTAGGA-3’
Reverse: 5’-CTAATCGCCGGCTCCAAAG-3’
GPX orange1.1g027311m Forward: 5’- GCTTGGAGATTCTGGCCTTTC-3’
Reverse: 5’- TCAGCCTTAAAGCGAGTGCAT-3’
39
4.2.15 Análise Estatística
Os resultados dos parâmetros avaliados foram submetidos à análise de
variância e teste de Tukey com significância do teste F de até 5% de probabilidade
(p ≤ 0,05). Todas as análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do
aplicativo SISVAR (FERREIRA, 2011).
40
5 Resultados
Experimento I
O estresse causado pelo déficit hídrico alterou o padrão de comportamento
dos híbridos avaliados ao comparar os resultados encontrados para os dois regimes
hídricos impostos, para a maioria das variáveis analisadas (Tabela 3).
Tabela 3. Síntese da análise de variância para as variáveis avaliadas em função dos regimes hídricos e dos híbridos estudados.
Variáveis
Fator de Variação / Quadrado Médio
Regime Hídrico (RH)
Genótipo (G)
RH*G Erro Média Geral
CV (%)
Umidade do Substrato
743.15 *** 2.11 ** 2.25 ** 0,23 7,54 6,33
Cond. Estomática 6448.48 *** 511.07 ** 500.57 ** 43,26 33,08 19,89
Temperatura Foliar 121.50 *** 3.44 *** 5.61 *** 0,08 40,50 0,71
Área Foliar 1442.59 *** 5270.71 *** 222.86 ** 22,90 66,21 7,23
Número de Folhas 84.38 *** 60.15 *** 6.26 * 1,46 13,29 9,09
Altura de Planta 38.51 *** 84.99 *** 6.82 ** 0,46 11,68 5,82
Diâmetro de Caule 0.27 ** 0.51 *** 0.05 ns 0,02 2,63 5,14
Massa Seca de Folha
0.03 ** 0.08 *** 0.003 * 0,001 0,32 9,52
Massa Seca P. Aérea
0.05 ** 0.21 *** 0.006 ns 0,004 0,54 10,94
Massa Seca de Raiz
0.02 * 0.02 * 0.01 * 0,002 0,30 15,42
MSPA/MSR 1.98 ** 1.55 *** 0.17 ns 0,09 1,84 15,99
Comp. Total de Raiz
63.46 ns 31501.9 *** 2205.85 ns 860,54 267,98 10,95
Diâm. Médio de Raiz
0.0005 ns 0.03 *** 0.003 ** 0,0003 0,67 2,70
41
D. Médio de Raiz 9.59 ns 39457.3 *** 1581.29 ** 140,01 132,99 8,90
(0,0 < d < 0,5 mm)
D. Médio de Raiz 1.85 ns 9209.25 ** 247.76 ns 623,8 112,98 22,11
(0,5 < d < 1,0 mm)
D. Médio de Raiz 6.88 ns 28.63 ns 22.47 ns 9,61 8,82 35,14
(1,0 < d < 1,5 mm)
D. Médio de Raiz 1.43 ns 78.76 ** 2.09 ns 5,89 13,19 18,39
(d > 1,5 mm)
*, ** e *** significativo a 5, 1 e 0,1% de probabilidade pelo teste F, respectivamente, e ns não significativo
O híbrido pé-franco 041 foi o que primeiro apresentou sintomas visuais
(murcha das folhas) que estava sob condições de estresse por déficit hídrico,
ocorrendo 48 dias após a suspensão da irrigação. A umidade do substrato registrado
para esse híbrido foi de 0,84%, enquanto para os demais híbridos, situou-se entre
1,36 a 3,41%. Mesmo não havendo murcha das folhas nos demais híbridos, a
umidade do substrato ficou abaixo de 4%, que é caracterizada como uma umidade
crítica quando o substrato é areia. A restrição de água no solo também influenciou,
de forma significativa, a gs e a temperatura foliar, mas sem distinção entre os
híbridos quando em condições de déficit hídrico para essas duas variáveis (Figura
04). Em condições de controle, o híbrido 041 é o que apresenta a maior gs e o
oposto é registrado para o híbrido 069, que não apresenta diferença significativa
entre o tratamento controle e déficit hídrico. Essa diferença na gs explica a menor e
maior umidade do substrato nas parcelas experimentais do tratamento déficit hídrico
para os respectivos híbridos citados.
42
Figura 4. Umidade do substrato, condutância estomática (gs) e temperatura foliar dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em condição pé-franco e em diferentes regimes hídricos. Letras maiúsculas indicam diferença estatística entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo. Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos dentro de cada regime hídrico. NS e ns – não significativo pelo teste de Tukey (p≤0,05). As barras indicam o erro padrão.
43
A restrição de água no solo limitou o crescimento das plantas,
comprometendo o aumento da área foliar, do número de folhas, da altura da planta,
do diâmetro do caule e da massa seca de folha (MSF) e parte aérea (MSPA). Para
todas essas variáveis de crescimento, o híbrido 059 foi o que apresentou os maiores
valores tanto em condições de controle como de déficit hídrico, com exceção para
massa seca de raiz (MSR), tendo o híbrido 041 um aumento significativo de raízes
quando submetido a condições deficitária de água no solo quando comparado ao
tratamento controle, e para os demais híbridos a MSR permaneceu inalterada,
estatisticamente, entre os dois tratamentos (Figura 5).
44
Figura 5. Área foliar, número de folhas, altura de plantas, diâmetro do caule, massa seca de folha (MSF), massa seca da parte aérea (MSPA), massa seca de raiz (MSR) e a razão entre MSPA/MSR dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em condição pé-franco e diferentes regimes hídricos. Letras maiúsculas indicam diferença estatística entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo. Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos dentro de cada regime hídrico. NS e ns – não significativo pelo teste de Tukey (p≤0,05). As barras indicam o erro padrão.
45
De maneira geral, o estresse por deficiência hídrica promoveu reduções no
crescimento foliar de todos os genótipos em condição pé-franco, destacando-se os
híbridos 041 com maior e 069 com menor diferença entre os regimes hídricos:
controle e estresse (Figura 6).
Figura 6. Aumento da área foliar dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em condição pé-franco e diferentes regimes hídricos, ao longo de 48 dias.
O crescimento e a distribuição do sistema radicular é uma possível
estratégia da planta diante da limitação hídrica e afeta suas respostas frente ao
estresse. Neste estudo, não houve diferença significativa entre o comprimento total
das raízes em condições de controle ou seca, entretanto os híbridos 041 e 059
apresentaram em ambas as condições maior comprimento total do sistema radicular
dentre os genótipos analisados e também apresentaram alterações no diâmetro
médio de raízes diante da restrição hídrica, todavia com comportamentos opostos
(Figura 7).
46
Figura 7. Comprimento total de raiz e diâmetro médio de raiz dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em condição pé-franco e diferentes regimes hídricos. Letras maiúsculas indicam diferença estatística entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo. Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos dentro de cada regime hídrico. NS – não significativo pelo teste de Tukey (p≤0,05). As barras indicam o erro padrão
Pela dinâmica de crescimento do sistema radicular, observa-se influência da
limitação hídrica no comprimento da classe 0,0 < d < 0,5 mm para os híbridos 041 e
059 apresentando correlação positiva com diâmetro médio de raízes (Figura 7 e 8A).
Figura 8. Comprimento de raiz em diferentes classes de diâmetros: 0.0 < d < 0.5 mm (A); 0.5 < d < 1.0 mm (B); 1.0 < d < 1.5 mm (C) e d > 1.5 (D) dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em condição pé-franco e diferentes regimes hídricos. Letras maiúsculas indicam diferença estatística entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo. Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos dentro cada
47
regime hídrigo. NS e ns – não significativo pelo teste de Tukey (p≤0,05). As barras indicam o erro padrão
Experimento II
O estresse causado pelo déficit hídrico alterou o padrão de comportamento da
laranjeira ‘Valencia’ enxertada no diferentes híbridos avaliados, ao comparar os
resultados encontrados para as variáveis fisiológicas, bioquímicas e moleculares,
entre os diferentes regimes hídricos impostos (Tabela 4).
Tabela 4. Síntese da análise de variância para as variáveis avaliadas em função dos regimes hídricos e dos híbridos avaliados.
Variáveis
Fator de Variação / Quadrado Médio
Regime Hídrico Genótipo RH*G Erro Média Geral
CV (%)
L 46,32 *** 0,12 * 0,03 ns 0,03 -1,64 9,71
RWC (%) 3908,43 *** 5,65 ns 52,29 ns 18,72 75,36 5,74
p 50,11 *** 0,28 ns 0,80 *** 0,16 3,58 11,02
3,27 *** 0,04 ** 0,07 *** 0,01 -2,08 4,71
Cu
rva
de
Pre
ssão
-V
olu
me
(PV
) 1,08 * 0,10 ns 0,33 ns 0,17 -2,34 17,72
TLP0,71 *** 0,04 ns 0,10 * 0,04 -2,82 7,44
RWCTLP 1452,82 *** 139,26 *** 68,95 ** 11,54 79,93 4,25
293,57 *** 4,09 ns 4,72 ns 3,09 14,00 12,56
Flu
ore
scên
cia
da
Clo
rofi
la a
Fo 354,44 * 21,19 ns 164,81 ns 83,87 140,49 6,52
Fm 88758,00 *** 834,64 ns 6012,5 ** 1422,16 673,71 5,60
Fv/Fm 0,01 *** 0,0001 ns 0,0002 ns 0,0001 0,79 1,48
193,46 *** 0,23 ns 0,47 ns 0,79 3,31 26,84
gs 0,05 *** 0,0002 ns 0,0002 ns 0,0004 0,05 44,32
9,43 *** 0,11 ns 0,11 ns 0,09 0,91 32,84
Ci 32954,70 *** 1520,28 ns 791,13 ns 1824,49 247,55 17,25
A/gs 23494,33 *** 1824,57 ns 1617,13
ns 1877,75 86,56 50,06
A/E 21,97 *** 0,16 ns 0,55 ns 0,92 3,38 28,34
48
Ci/Ca 0,23 *** 0,01 ns 0,005 ns 0,01 0,65 17,21 A
tiv.
En
zi-
mát
ica SOD 0,29 ns 0,001 ns 0,02 ns 0,11 11,47 2,84
GPX 706,23 * 2003,46
*** 10,43 ns 43,26 35,17 18,70
Exp
ress
ão
Gên
ica SOD 2,14 * 0,15 1,75 22,45
GPX 2,07 * 0,17 2,38 17,49
*, ** e *** significativo a 5, 1 e 0,1% de probabilidade pelo teste F, respectivamente, e ns não significativo
A diminuição dos valores de umidade do solo durante a imposição do
estresse, nos diferentes regimes hídricos, não seguiu a mesma cinética para os
diferentes híbridos, embora um padrão de extração de água tenha sido observado
independentemente do genótipo, com quedas mais bruscas da umidade na fase
inicial e perdas mais lentas a partir do 17º dia sem irrigação (Figura 9). Entre os
compartimentos do vaso, a umidade pouco se diferenciou em cada leitura, e quando
cada planta do mesmo vaso atingiu a faixa de potencial hídrico foliar que
caracterizou o tratamento aplicado, a umidade do solo situou-se bem próxima para
os quatro diferentes híbridos. A exceção foi o híbrido 059 no tratamento MI, que
registrou valor médio de umidade do solo no final da duração do estresse de 0,126
cm3 cm-3, enquanto que para os demais híbridos registrou-se uma média de
0,141cm3 cm-3 (Figura 9). O valor médio de umidade do solo para o MO foi de 0,125
cm3 cm-3 e para o SE foi de 0,122 cm3 cm-3.
Observa-se que os valores de umidade do solo, no momento das avaliações
fisiológicas, pouco diferiu entre o tratamento MO e SE; porém, as respostas
fisiológicas diferiram significativamente entre esses dois tratamentos para a maioria
das avaliações. A redução da umidade do solo para próximo a 0,12 cm3 cm-3 indica
a umidade limite para a extração de água pelos genótipos avaliados nas condições
impostas nesse estudo, uma vez que a severidade do estresse aumentou, indicado
pelo potencial hídrico foliar, ao passo que a umidade do solo pouco alterou. Isso
pode ser explicado pela continuidade da transpiração da planta em condições de SE
sem extração de água do solo.
A severidade do estresse para o tratamento SE também foi detectada
visualmente, com folhas mais murchas e enroladas quando comparadas às plantas
do MO (Figura 10).
49
Figura 9. Umidade do solo (θ) no período do estresse hídrico para os tratamentos hídricos: estresse leve (A), estresse moderado (B), estresse severo (C) e reidratado (D).
Figura 10. Alterações morfológicas nas folhas em resposta ao déficit hídrico na laranjeira ‘Valencia’ enxertada nos híbridos 001, 041, 059 e 069, para os regimes hídricos: estresse moderado (A) e estresse severo (B).
O valor da fração de água transpirável do solo, em que se inicia a redução da
transpiração relativa ocorre quando a curva estimada pela equação logística afasta-
se de 1 e inicia-se o decréscimo linear (ponto crítico) (SINCLAIR; LUDLOW, 1986).
Assim, pode-se observar na Figura 11 que os híbridos ‘059’ e ‘069’ apresentaram
50
um declínio nas taxas de transpiração em frações de água transpirável do solo
menores do que os híbridos ‘001’ e ‘041’, indicando que esses últimos apresentam
uma estratégia mais ‘conservativa’, enquanto os primeiros apresentam uma
estratégia mais ‘produtiva’.
.
Figura 11. Transpiração relativa (TR) em função da fração de água transpirável do solo (FTSW).
Diferenças significativas no L foram observadas apenas para os regimes
hídricos. Os tratamentos controle e reidratado não diferiram pelo teste de média
aplicado e apresentaram valores situados entre -0,25 e -0,35 MPa, mostrando a
capacidade dos híbridos em reestabelecer o L em poucas horas após a
reidratação. Os valores médios para o estresse leve foi de -1,13 MPa, diferindo do
estresse moderado com média de -3,01 MPa e estresse severo com valores
menores que -3,5 MPa, caracterizando a intensidade de cada estresse nos
diferentes tratamentos hídricos impostos (Figura 12).
y = -2,6448x3 + 4,2121x2 - 0,7913x + 0,2449 R² = 0,917
y = -3,5291x3 + 5,1286x2 - 0,846x + 0,2149 R² = 0,8875
y = -0,7933x3 + 0,6355x2 + 0,9148x + 0,2482 R² = 0,9763
y = -0,6121x3 - 0,047x2 + 1,487x + 0,1649 R² = 0,9907
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
TR
FTSW
001
041
059
069
51
Figura 12. Potencial hídrico foliar (L) sob influência dos regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; SE – Estresse Severo; RE – Reidratado) para os híbridos 001, 041, 059 e 069 dos cinco regimes hídricos aplicados. As letras distintas indicam diferença estatística pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05). As barras indicam o erro padrão.
Os regimes hídricos influenciaram de forma significativa o teor relativo de
água (RWC) das folhas de laranjeira ‘Valencia’ enxertada nos quatro híbridos
avaliados, decrescendo a medida que o déficit hídrico se tornou mais acentuado.
Observou-se que para os híbridos avaliados, quando submetidos a déficit hídrico
com L menor que -3,5 MPa e avaliados 24 horas após a reidratação, houve uma
recuperação parcial do RWC (81,97%) quando comparado ao tratamento controle
(87,67%). O MO foi o que ocasionou o menor RWC (55,61%), com redução de
36,57% em relação ao tratamento controle (Figura 13).
52
Figura 13. Teor relativo de água (RWC) das plantas em diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; RE – Reidratado). As letras distintas indicam diferença estatística pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05). As barras indicam erro padrão.
Houve interação entre os fatores para p com valores decrescentes quando a
disponibilidade hídrica do solo foi limitante. Mesmo apresentando resposta
significativa pelo teste de Tukey para o fator de variação porta-enxerto e regime
hídrico, os valores de p não diferiram entre os híbridos quando eles estavam em
condições de CO, MI, MO e SE, todavia, quando em RE, os híbridos diferiram entre
si (Figura 14). A turgescência foliar é influenciada de forma negativa quando a
umidade do solo decresce, corroborando com as diferenças encontradas neste
trabalho entre as condições de disponibilidade (CO e RE) e restrição (MI, MO e SE)
hídrica. O híbrido 059 não alterou seu p nas três diferentes condições de déficit
hídrico, sendo o destaque entre os híbridos para essa variável analisada, visto que
mesmo em SE manteve o mesmo p comparado ao estresse leve (MI). Os híbridos
001 e 041, em condições de déficit hídrico, só apresentaram diferenças entre o MI e
o SE (Figura 14).
Houve o reestabelecimento do p quando a avaliação ocorreu 24 horas após
a irrigação das plantas submetidas ao SE, se igualando ao p das plantas em
condição de potencial matricial do solo próximas a capacidade de campo (Figura
15), com exceção do híbrido 041 que parece responder de forma mais lenta no
processo de recuperação da turgescência foliar (Figura 14).
53
Figura 14. Potencial de turgor (p) sob influência dos híbridos 001, 041, 059 e 069 em diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; SE – Estresse Severo; RE – Reidratado). Letras maiúsculas distintas indicam diferenças entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo e letras minúsculas distintas indicam diferença entre os genótipos dentro de cada regime hídrico. ns indica não significativo pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05). As barras indicam o erro padrão.
Figura 15. Laranjeira ‘Valencia’ enxertada em porta-enxertos híbridos (001, 041, 059
e 069) apresentando p ≤ 2,25 MPa para o tratamento Estresse Severo (A) e p ≥ 5,00 MPa para o tratamento Reidratado (B).
O resultado da análise do mostrou que houve interação entre os porta-
enxertos e os regimes hídricos aplicados, com um padrão similar de comportamento
na acumulação de solutos no interior das células a medida que o estresse por déficit
hídrico foi intensificado. O processo contrário ocorreu quando a planta saiu da
54
condição limitante de água no solo para a capacidade máxima de retenção em um
período de 24 horas, com valores intermediários de situados entre os valores de
MI e MO, demostrando que é necessário um período maior que 24 horas para o
reestabelecimento dos valores da condição CO (Figura 16). Ao analisar o
comportamento dos híbridos dentro de cada regime hídrico, observa-se que o
híbrido 059 apresentou a menor concentração de solutos no interior das células
quando em condição de CO e MI, e o inverso ocorreu quando em condição de MO e
RE.
Figura 16. Potencial osmótico () dos híbridos 001, 041, 059 e 069 sob diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; RE – Reidratado). Letras maiúsculas distintas indicam diferenças entre os regimes hídricos dentro de cada genótipo e letras minúsculas distintas indicam diferença entre os genótipos dentro de cada regime hídrico. ns indica não significativo (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey. As barras indicam o erro padrão.
Os parâmetros obtidos pela análise da curva PV mostraram que o teor relativo
de água no ponto de perda de turgor (RWCTLP) e módulo elasticidade (ε)
aumentaram significativamente quando os híbridos 001, 041, 059 e 069 foram
submetidos à déficit hídrico e reidratação. A intensidade do estresse hídrico para as
plantas pertencentes ao tratamento RE foi superior ao das plantas que foram
submetidas ao MO, isso, provavelmente, explica o resultado obtido para essas
variáveis da curva PV. O híbrido 001 difere dos demais híbridos para o RWCTLP na
55
condição de disponibilidade constante de água no solo, com o menor valor (Tabela
5).
Tabela 5. Parâmetros da Curva de Pressão-Volume (PV). Média do teor relativo de água no ponto de perda de turgor (RWCTLP), potencial osmótico em plena
turgescência (0), potencial osmótico no ponto de perda de turgor (TLP), módulo de elasticidade (ε) e ajuste osmótico (AO) em folhas de laranjeira ‘Valencia’ enxertadas nos híbridos 001, 041, 059 e 069
Letras maiúsculas distintas, na coluna, indicam diferença significativa entre os regimes hídricos para cada híbrido. Letras minúsculas distintas, na coluna, indicam diferença significativa entre os híbridos para cada regime hídrico. ns não significativo (p ≥ 0,05) pelo teste de Tukey. ± indica o erro padrão.
Dos três parâmetros avaliados pelo medidor portátil de luz modulada com
base na fluorescência da clorofila a, houve efeito isolado do fator regime hídrico para
a variável rendimento quântico máximo do fotossistema II (Fv/Fm) e efeito da
interação entre os fatores para fluorescência máxima (Fm), não havendo diferença
significativa entre os tratamentos para a fluorescência mínima (F0) (Tabela 5).
Ao analisar a resposta da Fm sobre os regimes hídricos para cada híbrido
avaliado, verifica-se que os menores valores dessa variável foram encontrados no
SE e RE, e os maiores valores nos tratamentos CO e MI, padrão bem definido pelos
híbridos 041 e 069. A Fv/Fm foi alterada pela intensidade do estresse, dado ao
agrupamento do SE e RE pela análise estatística. O MI não causou perturbações no
sistema fotossintético, visto que não houve inibição da atividade fotoquímica quando
comparado ao tratamento CO (Tabela 6).
56
Tabela 6. Fluorescência da clorofila a de folhas de laranjeira ‘Valencia’ enxertada nos híbridos 001, 041, 059 e 069 sob diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; SE – Estresse Severo; RE – Reidratado) para os parâmetros: F0 = fluorescência mínima; Fm = fluorescência máxima; Fv/m = eficiência máxima do fotossistema II.
Letras maiúsculas distintas, na coluna, indicam diferença significativa entre os regimes hídricos para cada híbrido. Letras minúsculas distintas, na coluna, indicam diferença significativa entre os híbridos para cada regime hídrico. ns indica não significativo (p ≥ 0,05) pelo teste de Tukey. ± indica o erro padrão.
Não houve diferença entre os porta-enxertos quanto a taxa líquida da
fotossíntese (A), condutância estomática (gs), transpiração (E), concentração de
carbono intercelular (Ci), eficiência intrínseca do uso da água (A/gs), eficiência
instantânea de uso da água (A/E) e razão das concentrações interna e atmosférica
de CO2 (Ci/Ca). Essas variáveis fisiológicas tiveram alteração somente quando as
plantas foram submetidas aos diferentes regimes hídricos (Figuras 17).
Diferenças nas trocas gasosas entre os porta-enxertos provavelmente não
foram detectadas porque no primeiro nível de déficit hídrico (MI), em que as plantas
estavam em uma umidade média do solo, entre os compartimentos, de 0,138 cm3
cm-3, esses parâmetros não diferiram entre os híbridos. No entanto, observa-se que
quando a umidade do solo situa-se entre 0,204 a 0,15607 cm3 cm-3 (entre o 5º e 14º
dia após a suspensão da irrigação), a A, gs e E diferiu entre os híbridos, com base
57
nos valores encontrados, tendo o híbrido 069 os maiores valores no 14º dia (Figura
18).
O déficit hídrico, para os híbridos avaliados, causou decréscimo nos valores
dos parâmetros de trocas gasosas e o SE foi o mais prejudicial às plantas, com uma
redução de 93,77% na A, 43,64% na gs e 84,43% na E, em relação as plantas
mantidas em umidade do solo próximo a capacidade campo (Figura 17). Entre o MI,
MO e RE não houve diferenças nas respostas das plantas, permanecendo com os
parâmetros de trocas gasosas inalterados, com a umidade do solo e L, em MI e
MO, alterando de 0,141 cm3 cm-3 e -1,33 MPa para 0,125 cm3 cm-3 e -3,01 MPa,
respectivamente. A exceção foi para a gs, que mesmo registrando o menor valor sob
SE, não diferiu estatisticamente entre os regimes com déficit hídrico e reidratado.
Figura 17. Taxa líquida da fotossíntese (A), condutância estomática (gs), transpiração (E) e concentração de carbono intercelular (Ci), em laranjeira ‘Valencia’ enxertada em quatro diferentes porta-enxertos (001, 041, 059 e 069) submetidos a cinco diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; SE – Estresse Severo; RE – Reidratado). Letras distintas indicam diferença significativa (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey. Barras indicam erro padrão.
58
Figura 18. Variação da fotossíntese (A), condutância estomática (gs), transpiração (E) e umidade do solo (θ) ao longo de 26 dias sem irrigação para os hídridos 001, 041, 059 e 069.
Os valores de A/gs foram maiores quando as plantas estavam ou passaram
por déficit hídrico, com exceção para o SE que ocasionou uma redução significativa
dos valores dessa relação equiparando-se ao tratamento CO. Conforme o déficit
hídrico se intensificou, os valores da relação A/gs diminuiram, registrando valores de
109,76, 98,66 e 36,48 µmol CO2 mol-1 H2O para os MI, MO e SE, respectivamente
(Figura 19).
A A/E das plantas em condições de MO e RO foi a mesma para as plantas em
condições de CO e MI, com impacto negativo da A/E somente para as plantas em
SE (Figura 19). A razão Ci/Ca permaneceu constante entre os regimes hídricos, com
elevação da concentração de CO2 no mesófilo foliar apenas quando as plantas
estavam em SE (Figura 19).
59
Figura 19. Eficiência intrínseca do uso água (A gs-1), eficiência instantânea de uso da
água (A E-1) e razão das concentrações interna e atmosférica de CO2 (Ci Ca-1) em laranjeira ‘Valencia’ enxertada em quatro diferentes porta-enxertos submetidos a
BC
A AB
C
A
00,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
160,0
Control Leve Moderate Drought Rehydrated
A/g
s (µ
mo
l CO
2 m
ol-1
H2O
)
Condictions
A
B
AB
C
AB
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
Control Leve Moderate Drought Rehydrated
A/
E (µ
mo
l CO
2 m
mo
l-1 H
2O
)
Condictions
B B B
A
B
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
CO MI MO SE RE
Ci/
Ca
(µ
mo
l CO
2 m
ol-1
H2O
)
Water Regime
60
cinco diferentes regimes hídricos (CO – Controle; MI – Estresse Leve; MO – Estresse Moderado; SE – Estresse Severo; RE – Reidratado). Letras distintas indicam diferença significativa (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey. Barras indicam erro padrão.
A atividade da enzima SOD não diferenciou entre os dois regimes hídricos
(CO e MI) e nem entre os dois híbridos avaliados (‘001’ e ‘059’) (Figura 20A),
indicando que a atividade da SOD não altera seu padrão de acumulação da enzima
frente a fase inicial do estresse hídrico (MI). Para a atividade enzimática da GPX,
houve efeito isolado dos fatores, com maior atividade da enzima para o híbrido ‘001’,
independente do regime hídrico, e em condições de MI a atividade da GPX
sobressai quando em condições de CO, independente do híbrido avaliado (Figura
20B).
Figura 20. Atividade enzimática da SOD (A) e GPX (B) em folhas de laranjeira
‘Valencia’ enxertada nos genótipos 001 e 059 em diferentes regimes hídricos. Letras
maiúsculas indicam diferença estatística entre os regimes hídricos dentro de cada
genótipo. Letras minúsculas indicam diferença estatística entre os genótipos dentro
de cada regime hídrico. NS e ns – não significativo.
Houve aumento de mRNA dos genes que codificam para as enzimas SOD e
GPX quando as plantas estavam em condição de MI, com base nos resultados
encontrados por qRT-PCR, com diferenças significativas entre os genótipos (Figura
21). A expressão do gene SOD para o híbrido 001 foi 2,34x quando comparado ao
nível de expressão em condição de CO, e para o híbrido 059 a quantificação
observada foi de 1,15x. Ao analisar a expressão do gene GPX, o híbrido 001 produz
1,79x mais transcritos quando em MI e o híbrido 059 alcança níveis de 2,96x.
61
Figura 21. Análise da expressão do gene SOD e GPX em folhas de laranjeira
‘Valencia’ enxertada nos genótipos 001 e 059 em condições de Estresse Leve. Os
níveis de expressão foram equiparados com os níveis de expressão gênica de
plantas em condições controle. Letras indicam diferença estatística entre os
genótipos para SOD e GPX. SOD: CV = 22,45%; Significativo a 0,5. GPX: CV =
17,49%; Significativo a 0,5.
A
B
B
A
0
1
2
3
4
001 059
Qu
anti
fica
ção
Re
lati
va
Genotypes
SOD GPX
62
6 Discussão
Experimento I
A compreensão dos mecanismos de respostas e comportamentos dos
híbridos em condição pé-franco permite inferir sobre as possíveis interações e
influências do genótipo como porta-enxerto para tolerância ao déficit hídrico. Na
citricultura é interessante a utilização de porta-enxertos com boas características de
aclimatação às condições climáticas, principalmente as de tolerantes à seca, que
possuam diversidade de respostas à deficiência hídrica, fato que possibilitará a
diversificação de materiais (SUASSUNA et al., 2012). Neste estudo, foram
observados comportamentos diferenciais entre os híbridos nos diferentes regimes
hídricos, com relação às variáveis analisadas.
A umidade do solo e o L foram os parâmetros com maiores discrepâncias
entre os híbridos, sendo preponderantes para compreensão das variações de
respostas dos híbridos e nos regimes hídricos para outras análises realizadas. O
suprimento de água às plantas é determinado pela habilidade da cultura em utilizar a
água disponível no solo, entretanto essa capacidade vai além das culturas,
diferentes genótipos expressam respostas adversas à disponibilidade de água no
solo (CARLESSO,1995). Neste contexto, observou-se que o hibrido ‘041’
apresentou a menor umidade do substrato em restrição hídrica, sugerindo que
dentre os genótipos, este híbrido possui uma alta capacidade de extração de água,
diferentemente do híbrido ‘069’, que apresentou um comportamento mais
conservador mantendo uma umidade do substrato 4x maior quando comparado ao
‘041’ (Figura 4).
63
A inibição de crescimento da parte aérea também é um dos efeitos mais
significativos do estresse por seca, havendo limitação da expansão foliar e com o
aumento da intensidade do estresse, pode acarretar em abscisão foliar, a fim de
contribuir para economia de água (KHANNA-CHOPRA et al., 1999; CHAVES et al.,
2003; CLAEYS; INZÉ, 2013). Todos os genótipos avaliados, com exceção do híbrido
‘069’, apresentaram redução da área foliar pela suspensão da irrigação, diferindo ao
encontrado por Peixoto et al. (2006), que em genótipos citrinos com potenciais para
tolerância ao deficit hídrico, verificaram que o LCR não diferiu significativamente em
área foliar quando em déficit hídrico, bem como a maioria dos híbridos avaliados.
Isso pode ser explicado pelo curto período de estresse progressivo (12 dias). O
híbrido ‘059’ apresentou maior área foliar, dentre os genótipos, independente do
regime hídrico, contudo apresentou um menor número de folhas sob seca.
Contrariamente, o híbrido ‘041’ tem uma menor área foliar com um número de folhas
similar ao híbrido ‘059’ (Figura 5). A diferença de crescimento foliar entre os regimes
hídricos para os dois genótipos foi mais acentuado para o híbrido ‘041’, com
destaque para o 14º dia, ao qual parece ocorrer diferenciação e caracterização do
regime hídrico imposto para cada genótipo, e ao 36º dia (Figura 06) por um provável
processo de aclimatação que requer gasto energético, resultando, em redução do
crescimento (LACHER, 2000).
A gs é um mecanismo bastante eficiente no controle da perda de água na
planta em condições de déficit hídrico tornando-se um potencial indicador da
tolerância à seca (PEDROSO et al., 2014; ULLAH et al., 2017) por estratégia de
conservação da água no ponto crítico. Com exceção do ‘069’, todos os genótipos
tiveram redução significativa da gs em função da diminuição da umidade do
substrato, confirmando que o fechamento estomático é uma das primeiras linhas de
defesa contra a dessecação em plantas cítricas, uma vez que é um processo mais
rápido e flexível, principalmente a curto prazo (CHAVES, 1991). A maior gs em
condição controle foi verificada para o híbrido ‘041’, havendo um decréscimo de 78%
na imposição ao estresse. Já o híbrido ‘059’ teve decréscimo de 68,5% entre o
período sem e com estresse, valor superior ao encontrado por Suassuna et al.
(2014). Estes autores avaliaram também os parâmetros E e A do híbrido ‘059’ sob
restrição hídrica e observaram uma correlação positiva de gs, E e A, havendo uma
redução de 64,52% e 78,82% para E e A, respectivamente, com relação as plantas
em condições de umidade do solo na capacidade de campo. O fechamento
64
estomático também gera custos para a temperatura da folha, este parâmetro é
importante no controle do estado da água das folhas sob o estresse por seca
(ANJUM et al., 2011; MARTIN-STPAUL et al., 2017). Neste estudo, mesmo o híbrido
‘069’, que tinha maior umidade de substrato entre os híbridos para o tratamento
déficit hídrico, apresentou aumento significativo da temperatura foliar sendo similar
ao híbrido ‘041’, indicando uma via de resposta rápida a dessecação.
Durante o início da seca, a redução na gs leva a menor influxo de CO2 para
os cloroplastos, reduzindo as taxas fotossintéticas. Essa restrição da difusão de CO2
contribui para o menor acúmulo de biomassa para a manutenção do
desenvolvimento vegetal (VERSLUES et al, 2006; CHAVES, 1991). Neste estudo,
observa-se que não há diferença significativa para a variável MSF entre os regimes
hídricos para o híbrido ‘041’, todavia há um decréscimo de 23% da MSF de controle
para estresse hídrico no híbrido ‘059’ (Figura 5). Esses dados corroboram com o
encontrado por Suassuna et al. (2012) que observaram uma redução significativa de
MSF para o híbrido ‘059’ quando exposto a estresse hídrico por déficit, sendo este
comportamento semelhante ao LCR no mesmo estudo. Em relação a MSPA,
espera-se que com a progressão do estresse ocorra uma maior redução da
fitomassa da planta como observado na maioria das variedades do estudo de
Cerqueira et al. (2004). Por outro lado, dentre os genótipos avaliados por estes
autores, os híbridos apresentaram menor sensibilidade ao déficit hídrico progressivo.
Contrariamente, Suassuna et al. (2012) constataram que o híbrido ‘059’ teve MSPA
maior quando comparado ao LCR. No presente estudo, o híbrido ‘059’ apresentou
fitomassa superior aos outros genótipos avaliados independente do regime hídrico
(Figura 05), logo, mesmo com a imposição ao estresse, este híbrido mantém uma
maior MSPA. Este fato, possivelmente pode ter ocorrido, visto que o híbrido ‘059’ foi
o que apresentou maior altura, não havendo distinção entre os híbridos 041 e 059
quanto ao diâmetro do caule na restrição hídrica (Figura 5). Vale ressaltar que todos
os genótipos tiveram reduções proporcionais relacionadas ao regime hídrico para
variável diâmetro do caule, diferentemente do observado por Nascimento et al.
(2010), ao qual observaram diferenças entre os regimes hídrico, sendo que o LCR
apresentou maior sensibilidade a restrição hídrica do que os genótipos utilizados no
estudo.
O aumento de raízes é uma das respostas das plantas frequentemente
observadas em restrição hídrica (CHAVES et al., 2003; FAROOQ et al., 2012), seja
65
pelo alto aprofundamento da raiz nas camadas mais profundas ou pela maior
densidade (BLUM, 2005). A expansão do sistema radicular para zona mais
profundas e úmidas do solo permiti o aumento da área de absorção efetiva de água,
assim, normalmente, com uma limitação na disponibilidade hídrica intensa ou
contínua, há um aumento da densidade e comprimento de raízes. Os híbridos ‘041’
e ‘059’ apresentaram resultados contrastantes quanto ao comprimento total e
diâmetro de raízes (Figura 07), no qual o híbrido ‘041’ apresentou aumento do
sistema radicular em diâmetro na classe 0.0 < d < 0.5 mm em condições de limitação
hídrica (Figura 08), corroborando com Moumeni et al. (2011), que observaram que
em situação de déficit hídrico, houve a ativação de genes responsáveis pelo
crescimento e alongamento na ponta das raízes de espécies de arroz tolerante a
seca. O aumento de diâmetro no híbrido ‘041’ condicionou a um incremento
significativo também na MSR, diferentemente dos outros híbridos analisados (Figura
5). Entretanto, a variação da resposta radicular entre os híbridos pode ser justificada
pela diferença de umidade de solo entre eles, dado que em condições de estresse, o
crescimento de raízes pode ser estimulado em resposta à deficiência hídrica como
mecanismo de obtenção de água no solo, mas o crescimento também pode ser
muitas vezes mantido (GRAY; BRADY, 2016; XU et al, 2010), representando
portanto um mecanismo distinto entre os híbridos em resposta ao déficit.
Circunstancialmente, o híbrido ‘041’ apresentou um maior diâmetro de raízes na
suspensão hídrica como uma possível estratégia de manter o equilíbrio da absorção
e perda de água.
Dentre os genótipos avaliados neste estudo, o híbrido ‘041’ foi o que
apresentou características mais semelhantes ao LCR, caracterizado pela alta
capacidade de extração de água no solo e aumento do sistema radicular.
Contrariamente, o híbrido ‘069’ em condição de pé-franco parece usar estratégias de
conservação da água no solo para retardar os efeitos do estresse. Os híbridos
analisados apresentam distintas estratégias e mecanismos de tolerância ao estresse
por déficit hídrico.
66
Experimento II
Ao submeter à laranjeira ‘Valencia’ enxertada nos híbridos ‘001’, ‘041’, ‘059’ e
‘069’ a condições deficitárias de água no solo, observou-se que as respostas
fisiológicas alteraram, com diferenças significativas entre as plantas que estavam ou
foram submetidas a um nível de déficit hídrico e aquelas que sempre permaneceram
em plena irrigação, com a umidade do solo próximo a capacidade de campo durante
todo o período amostral. Entretanto, a umidade do solo nos diferentes
compartimentos do vaso pouco diferiu e não caracterizou diferenças significativas no
L entre os híbridos independente do regime hídrico imposto. Contrariamente, no
experimento I, os híbridos em condição pé-franco, registraram diferentes umidade de
solo. Sendo assim, a combinação entre os diferentes híbridos no mesmo vaso
possibilitou o compartilhamento da água no solo tornando semelhante entre estes a
extração e armazenamento de água.
O L e o RWC são parâmetros utilizados para medir a intensidade do
estresse hídrico em plantas (FLEXAS et al., 2004), e no presente estudo, para cada
regime hídrico, as plantas apresentaram diferentes valores desses dois parâmetros,
sendo possível verificar que diferenças no potencial matricial do solo modificou o
estado hídrico da laranjeira ‘Valencia’ sem influência dos híbridos avaliados. O
mesmo comportamento, para essa laranjeira enxertada em outros porta-enxertos, foi
observado por Santana-Vieira et al. (2016), Gonçalves et al. (2016), Neves et al.
(2013), Machado et al. (1999), entre outros, quando submetida a déficit hídrico. Os
resultados obtidos confirmam que o estresse por déficit hídrico altera o L e o RWC
e a intensidade do estresse faz com que os valores para cada parâmetro diminua
com diferenças significativas, e com recuperação rápida quando as plantas são
reidratadas.
O fechamento estomático num maior valor de fração de água transpirável no
solo, durante um déficit de curta duração, segundo Ray e Sinclair (1997), será
traduzido em perda de produtividade. Porém, em condições de monocultura, a
espécie que fecha os estômatos em maior fração de água transpirável no solo
apresenta uma estratégia ‘conservativa’, já que irá poupar água e aumentar suas
chances de sobrevivência durante as secas de longo prazo, ainda que haja perda na
67
produtividade (RODRIGUES et al., 2015). Os padrões distintos de resposta de
transpiração para a fração de água transpirável do solo (FTSW) entre os porta-
enxertos, ilustram suas diferentes estratégias adaptativas frente à condições de
deficiência hídrica (Figura 11). As plantas em '001' e '041' mostraram uma estratégia
mais ‘conservativa’ do que as de '069' e '059', reduzindo suas taxas de transpiração
em valores de FTSW relativamente maiores. Plantas pé-franco de 'Sunki Maravilha'
também mostraram uma estratégia ‘conservativa’ em condições de deficiência
hídrica, visto que o início de declínio de transpiração nessas plantas ocorreu em
FTSW de ~0,70, enquanto as plantas pé-franco de limoeiro 'Cravo' mostraram uma
estratégia 'produtiva', mantendo sua transpiração em FTSW de até ~0,60 (NEVES et
al., 2013).
Em reposta a desidratação das folhas (Figuras 12 e 13), as plantas
acumularam solutos no vacúolo e/ou citosol nas células das folhas da laranjeira
‘Valencia’ à medida que o estresse hídrico foi intensificado, com diferenças entre os
híbridos para as mesmas condições impostas. O híbrido 059 foi o que teve a menor
concentração de solutos em MI e a maior em MO. Mesmo não avaliando essa
variável em condições de SE, estima-se que esse híbrido também tenha mantido
uma concentração de solutos mais elevada, em relação aos demais híbridos, para
essa condição hídrica, com base no dados de p, sendo o híbrido com a maior
turgescência foliar. Variação no padrão de reposta para é influenciado tanto pelo
o porta-enxerto, como verificado neste estudo, quanto pela copa, comportamento
esse evidenciado por Santana-Vieira et al. (2016).
Acúmulo de solutos em folhas de citros, sob condições de estresse, é um
mecanismo que também mantém o turgor das células (MARIJUAN; BOSCH, 2013),
como observado no presente estudo, havendo pouca alteração do p pouco alterado
nas três diferentes condições de déficit hídrico (Figura 14). Sugere-se que este
mecanismo seja uma resposta viável da planta ao déficit, mesmo em condições
iniciais de estresse (Figura 16), visto que os hidratos de carbono, além de serem
uma ótima fonte de energia, podem atuar como osmoprotetores e também manter o
turgor das membranas celulares e evitar a degradação protéica (MARIJUAN;
BOSCH, 2013; SCHER et al., 2012; ASHRAF et al., 2011). Esses mesmos
carboidratos previnem as células de danos oxidativos através da interação com
68
espécies reativas de oxigênio (ROS), exercendo uma atividade antioxidante
(KEUNEN et al., 2013).
A crescente acumulação de soluto em condições de limitação hídrica,
corrobora com os dados da curva PV, ao indicar que houve ajuste osmótico (AO)
entre os híbridos avaliados (Tabela 5), sugerindo que o aumento nas concentrações
de soluto responsáveis pelo AO foi proporcionado pelo processo de perda de água
que as células tiveram, conforme redução nos valores de RWC (Figura 13). O
acúmulo de solutos compatíveis não é nocivo ao metabolismo celular e, por
aumentar a pressão osmótica no interior das células, mantêm a absorção de água e
a pressão de turgor das células, o que contribui para a continuidade dos processos
fisiológicos, ainda que em níveis menores (MARIJUAN; BOSCH, 2013;
RODRÍGUEZ-GAMIR et al., 2010). Esse mecanismo de aclimatação ajuda a folha a
conservar a água dentro de uma certa variação do potencial de água no solo. O
enrijecimento da parede celular reduz o potencial hídrico foliar quando há diminuição
do teor relativo de água na folha (LENZ et al. 2006), e o aumento da rigidez e
acumulo de solutos na célula para a manutenção da turgescência celular se dá pelo
processo de aclimatação pela condição imposta, sendo um mecanismo de tolerância
da planta (VERSLUES et al., 2006; MEDINA et al., 2005). Assim, o ajustamento
osmótico permite que o crescimento celular ocorra sob um potencial hídrico que
geralmente seria inibidor de tal condição. Ele também auxilia a manutenção da
abertura estomática e o funcionamento do maquinário fotossintético (Figura 17),
permitindo que este opere mesmo em condições de baixo potencial hídrico
(TURNER 1997).
O teor relativo de água no ponto de perda de turgor (RWCTLP) aumentou
significativamente quando os híbridos 001, 041, 059 e 069 foram submetidos ao
déficit hídrico. Estes dados são diretamente proporcionais ao aumento significativo
no módulo de elasticidade (ε), os quais indicam que as suas paredes celulares se
tornaram mais rígidas com o déficit hídrico. O inverso ocorreu com o potencial
osmótico em plena turgescência (0), diminuindo em déficit hídrico, o que demonstra
a ocorrência de ajuste osmótico para esses híbridos (Tabela 5). Esse mesmo
mecanismo de ajuste foi encontrado em ‘Sunki Tropical’ (Citrus sunki Hort. ex. Tan.)
e trifoliata ‘Flying Dragon’ (Poncirus trifoliata L.) quando enxertados em laranjeira
‘Westin’ em condição de seca (GONÇAVES et al., 2016) e em Poncirus trifoliata e
tangerineira ‘Cleópatra’ enxertado em laranjeira ‘Valencia’ (RODRÍGUEZ-GAMIR et
69
al., 2010). Quando o 0 e o TLP diminuem em condições de déficit hídrico é um
indicativo de maior tolerância à deficiência hídrica, pois os tecidos suportam a
condição adversa por mais tempo antes das células atingirem o estado de
plasmólise (MARUR, 1999). O TLP define o potencial de água no solo abaixo do
qual a planta não pode absorver água suficiente para recuperar seu máximo teor de
água.
Quando a fluorescência da clorofila a apresenta alterações em plantas sob
diferentes regimes hídricos, isso pode ser um indicativo de comprometimento no
processo fotossintético. Dessa forma, avaliação dessa variável fisiológica torna-se
útil para mensurar as alterações na capacidade fotossintética das plantas em
decorrência de estresse causado por deficiência hídrica. A relação Fv/Fm é uma
estimativa da eficiência quântica máxima da atividade fotoquímica do fotossistema II,
quando todos os centros de reação estão abertos (BAKER; ROSENQVST, 2004).
Essa relação tem sido utilizada frequentemente para detectar perturbações no
sistema fotossintético causada por estresses ambientais, visto que a diminuição
indica inibição da atividade fotoquímica. Mesmo a planta em plena turgescência
foliar, potencial hídrico foliar condizente a condições ótimas de umidade no solo e
teor relativo de água acima de 80%, a maquinaria fotossintética do fotossistema II
das plantas pertencentes ao tratamento RE tem uma eficiência fotoquímica reduzida
quando comparado ao tratamento CO e MI, indicando que reduções bruscas do
RWC podem afetar o fotossistema II, mesmo a planta sendo avaliada 24 horas após
a rega. Apesar dessas reduções terem sido significativas pelo teste de Tukey, o
valores obtidos de Fv/Fm para SE e RE estão dentro da faixa indicativa de aparelho
fotossintético intacto (BOLHÀR-NORDENKAMPF et al., 1989; MAXWELL;
JOHNSON, 2000). Com base nesses autores, mesmo com diferença estatística
entre os regimes hídricos, não houve dano fotoinibitório nos centros de reação do
fotossistema II pelos tratamentos em que as plantas estavam ou passaram por
déficit hídrico.
A água é um dos fatores que regula a abertura e o fechamento dos
estômatos, sendo essa estrutura responsável pela regulação do fluxo de CO2 em
direção ao sítio de carboxilação, de modo que a redução desse fluxo é uma das
principais causas da redução da fotossíntese (BOSCO et al., 2009; SHIMAZAKI;
YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007). A restrição de água no solo fez a A, gs e E
diminuírem, com valores de cada parâmetro situados abaixo da faixa considerada
70
limite para citros (MATTOS JUNIOR et al., 2005), demostrando que as plantas
alteraram as respostas para esses parâmetros em função das condições de estresse
hídrico em que foram submetidas, sem diferenças significativas entre os porta-
enxertos. Alguns pesquisadores têm verificado resposta similares ao submeterem
laranjeiras enxertadas tanto em híbridos quanto em cultivares de citros e em outras
espécies cultivadas (SANTANA-VIEIRA et al., 2016; PEDROSO et al., 2014
CLAEYS; INZE, 2013; ROMERO et al., 2006; MACHADO et al., 1999). Em estudo de
campo feito por Carvalho et al. (2016) com diferentes portas-enxertos na estação de
seca, verificaram que a gs e E em folhas de laranjeira ‘Pera‘ de aproximadamente
2,5 anos não diferiram entre limoeiro 'Cravo' comum, limoeiro 'Cravo Santa Cruz',
‘TSKC X CTSW - 041’ e ‘TSKC x (LCR x TR) - 059,’ enquanto que a A, A E-1 e A gs-1
foram parâmetros em que o ‘059’ sobressaiu. O comportamento semelhante entre os
híbridos, no presente estudo, para as variáveis mencionadas, podem estar sob a
influência da variedade copa e/ou intensidade do estresse.
Ao avaliar o efeito da restrição hídrica a partir de 45% abaixo da capacidade
de campo, a condutância estomática diminuiu em 79,5%, 80,2%, 88,4% e 81,0%
para os tratamentos MI, MO, SE e RE, respectivamente. No experimento I, a gs não
diferiu significativamente entre os híbridos, em condição de restrição hídrica, mesmo
havendo uma menor umidade para o híbrido ‘041’, logo sob restrição hídrica há uma
resposta imediata dos estômatos mantendo-se constante independente do aumento
na severidade ao estresse e após reidratação. Uma redução tão significativa da gs
desde o primeiro nível de estresse (MI) pode ser um indicativo da ocorrência de
ajustamento fisiológico mais eficiente sob a influência dos híbridos avaliados, por
aumentar a resistência estomática ao fluxo de vapor d’água das folhas através dos
estômatos para a atmosfera externa a fim de manter o potencial hídrico nas folhas
(TAIZ; ZEIGER, 2009). Cerqueira et al. (2004) ressaltam que a abertura dos
estômatos, que é diretamente relacionada à condutância estomática, depende do
grau de saturação hídrica das células estomáticas, e pode influenciar a taxa de
transpiração. Plantas que reduzem rapidamente a condutância estomática são
consideradas preventivas (LEVITT, 1980), e o fechamento parcial dos estômatos é
devido à desidratação das células-guardas e, provavelmente, por resposta
hormonal.
Santana-Vieira et al. (2016) obtiveram resultados semelhantes para os
parâmetros de troca gasosa quando submeteram a laranjeira ‘Valencia’ enxertada
71
em limoeiro ‘Cravo’ e tangerineira ‘Sunki Maravilha’ a condição de déficit hídrico
com L ≤ -2,0 MPa. Os resultados obtidos no estudo citado mostraram que esses
parâmetros melhoram suas respostas de forma significativa 24 horas após a
reidratação, com valores intermediários entre controle e déficit hídrico, o que não foi
observado no presente estudo. Esses mesmo autores relatam que a concentração
de ácido abscísico (ABA) nas folhas e raízes aumentou sob condições de seca, e
observaram que esse resultado está associado a diminuição da condutância
estomática. Possivelmente, os híbridos utilizados neste estudo realizam estratégia
de prevenção com alteração rápida na condutância estomática mesmo em
condições leve de estresse. Todavia, não houve recuperação imediata da
condutância estomática após 24 horas de reidratação. Mesmo não havendo como
inferir se houve influência de respostas hormonais para tais respostas. Gomes et al.,
1999 relatam que mesmo em condições pós-estresse (reidratado), níveis de ABA
podem permanecer elevados mantendo o fechamento parcial dos estômatos. Neves
et al. (2013) verificaram que a concentração de ABA em folhas de ‘Sunki Maravilha’
aumentou em 80% quando a umidade do solo foi reduzida de 0,17-0,16 cm3 cm-3
para 0,15-0,14 cm3 cm-3, indicando uma possível regulação do fechamento
estomático mediado por ABA no presente estudo, conforme dados de umidade do
solo ao longo do tempo (Figura 18).
A fotossíntese teve uma correlação positiva, tanto com a condutância
estomática quanto com a transpiração, mostrando que as respostas dessas
variáveis estão interligadas quando plantas cítricas estão submetidas a condição de
seca, corroborando com os resultados de Santana-Vieira et al. (2016) e Pedroso et
al. (2014). Quando as plantas estavam com o L -3,5 MPa, a A diminuiu
significativamente dentre os regimes com restrição hídrica, comportamento não
registrado para a gs, não diferenciando entre SE e MI, mantendo a condutância em
SE sem diferenciar de MI. Tal fenômeno pode também ter sido atribuída por fatores
não estomáticos, determinadas, possivelmente, pela inativação parcial da enzima
rubisco, bem como a sua concentração (RIBEIRO; MACHADO, 2007; VU;
YELENOSKY, 1988). Isso pode justificar o aumento de Ci, podendo estar
relacionado a queda na atividade de enzimas envolvidas no processo de fixação de
CO2 (MACHADO et al., 1999) e possível diminuição na carboxilação (MATTOS
JUNIOR et al., 2005) ou pelo aumento d fotorespiração. Outra hipótese seria pela
redução da eficiência fotoquímica do fotossistema II (MAGNANI, 2005), contudo esta
72
é menos provável, visto que os dados desse trabalho evidenciam a integridade
desse fotossistema.
Para os parâmetros de trocas gasosas houve recuperação, de forma parcial,
das taxas 24 horas após a reidratação, indicando que é necessário um período
maior que esse para o completo retorno da atividade fisiológica, como mostrado em
diversos trabalhos (SANTANA-VIEIRA et al., 2016; NEVES et al., 2013;
CERQUEIRA et al., 2004; MACHADO et al., 1999).
Consequentemente, essas mudanças de respostas para os parâmetros de
trocas gasosas frente aos estresses em que as plantas foram submetidas, reflete
nos resultados das análises das relações desses parâmetros, com diferenças
significativas para os regimes hídricos em que as plantas estavam condicionadas. O
melhor resultado da AE é quando a planta absorve o máximo de CO2 com o mínimo
de perda de água, que está relacionada à quantidade de carbono que a planta fixa
por cada unidade de água que perde (SHIMAZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI,
2007; TAIZ; ZEIGER, 2009). Segundo Larcher (2000), a melhor relação entre
absorção de CO2 e perda de H2O é alcançada quando os estômatos estão
parcialmente fechados. O mecanismo de regulação estomática tende acompanhar a
quantidade de água no solo, confirmados nesse estudo, fechando os estômatos
antes que ocorra grandes alterações na fotossíntese líquida da planta. Isso
evidencia que os híbridos avaliados foram eficientes quanto ao uso da água, pois
A/E e A/gs não diferiram entre CO, MI, MO e RE (Figura 19), com valores elevados
para os regimes de restrição hídrica, com exceção para o SE. Coêlho e Oliva (1981)
asseguram que alto valor de AE associado a uma menor taxa transpiratória, e em
condições de turgidez, sugere um comportamento conservador, enquanto que em
uma situação contrária sugere um comportamento consumidor. A utilização da água
disponível de forma mais eficiente é um mecanismo da planta para sobreviver por
período prolongado em condições de seca, característica indicada para plantas
cultivadas em sistema de sequeiro. Deve-se considerar que a perda de água foi
somente por transpiração, o que não ocorre nos pomares citrícolas, que pode ser
atenuado pelo adensamento das plantas, já que os híbridos são indutores de
redução da copa. Assim, as respostas morfológicas e fisiológicas das folhas ao
déficit hídrico são cruciais para reduzir a perda de água e promover a eficiência do
seu uso (FANG; XIONG, 2015).
73
As enzimas SOD e GPX são importantes componentes do sistema de
eliminação de ROS em plantas expostas a fatores de estresses. O incremento na
atividade dessas enzimas tem sido correlacionado com a maior capacidade dos
genótipos em evitar danos oxidativos e dessa forma melhorar a aptidão para tolerar
o déficit hídrico (BOARETTO et al., 2014; FU, 2014; BELA et al., 2015; Zhang et al.,
2015; GONÇAVES et al., 2016; Anjum et al., 2017). No presente estudo, a
expressão gênica e a atividade enzimática relacionada a SOD não se
correlacionaram, indicando que um ou mais níveis de regulação pós-transcricional
podem estar envolvidos na regulação da atividade dessa enzima. Não foram
observados incrementos da atividade dessa enzima em decorrência do estresse de
deficiência hídrica, em nenhum dos híbridos avaliados. Esse resultado sugere que o
estresse vivenciado pela planta (MI) provavelmente não promoveu aumento do
ânion superóxido (O2-) para que os níveis da enzima SOD alterasse entre os
tratamentos CO e MI. Por outro lado, uma correlação positiva entre a atividade
enzimática e a expressão gênica foi verificada para GPX, em que houve incremento
nos valores dessas variáveis em condições de MI para ambos os híbridos avaliados.
Comportamento semelhante foi encontrado por Gonçalves et al. (2016), ao relatarem
que limoeiro ‘Cravo’ enxertado com a copa de laranjeira ‘Westin’ não diferiu no
valores da atividade da SOD entre o tratamento controle e déficit hídrico; porém,
houve um aumento do nível de expressão gênica para essa enzima em condições
de seca. Esses mesmos autores observaram que a atividade da GPX para ‘Cravo’ e
‘Sunki Tropical’ não teve diferença significativa entre as plantas em condições
controle e de seca, mas houve o aumento na expressão do gene, contrariamente ao
obtido para os híbridos avaliados nesse experimento. No entanto, esses autores
relataram um aumento significativo nos níveis de expressão gênica e atividade
enzimática de GPX em plantas de laranjeira ‘Westin’ enxertadas em trifoliata ‘Flying
Dragon’ submetidas à deficiência hídrica. Portanto, coletivamente esses resultados
indicam que GPX é a mais importante enzima antioxidante a atuar em condições de
estresse por deficiência hídrica em citros.
74
7 Conclusão
Em condição de deficiência hídrica, os híbridos pé-franco avaliados apresentam
respostas similares de fechamento estomático, mas respostas distintas quanto a
extração de água do solo, crescimento e distribuição radicular quanto a classe de
diâmetro.
Os quatros híbridos avaliados na condição de enxertia possuem os mesmos padrões
de respostas fisiológicas quando em condições limitantes de água no solo em
diferentes intensidades de estresse, mantendo as eficiências instantânea e intríseca
do uso da água mesmo com redução significativa no teor relativo de água foliar,
indicando possível mecanismo de prevenção da desidratação.
Os ajustamentos osmótico e elástico das paredes celulares e a indução da
expressão gênica e atividade de GPX garantiram a turgescência mínima e
homeostase celular para a realização da fotossíntese e manutenção do crescimento,
mesmo que em menores níveis.
75
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