GE Healthcare Life Sciences
Vero细胞流感病毒在WAVE生物反应器
中的Cytodex微载体无血清培养工艺
应用指南 28-9992-69 AA 疫苗
本工艺研究的目的是建立一个无动物源性成分的病毒培养
工艺,用于Vero细胞流感病毒的生产。最终的工艺快速简
单,易于放大和工业化生产。本研究评估了下列关键参
数:培养基组成、细胞消化、培养基添加剂、搅拌和病毒
感染参数。不同的培养基和蛋白酶对细胞的影响采用静态
培养方式进行评估。作为优化WAVE生物反应器中细胞生
长条件的一部分,评估了多种添加剂和不同摇动条件的影
响。接下来,对胰酶浓度和病毒储液稀释度进行比较,
以找到最佳病毒感染参数。最后,验证了使用微载体和
WAVE生物反应器用于Vero细胞中病毒培养整个工艺的稳
定性和可重复性。数据显示,已经建立了一个稳定可靠的
工艺,使用WAVE生物反应器在无动物源性成分培养条件
下使用Cytodex 1微载体贴壁的Vero细胞生产流感病毒。
使用一次性Cellbag*生物反应器的WAVE生物反应器(图
1)易于安装,无需清洗和验证,操作灵活成本低,快速
方便的取代传统不锈钢搅拌反应器。
介绍
流感病毒疫苗的培养工艺多数仍采用传统鸡胚培养方式。
这种方法劳动强度大,而且需要较大的生产厂房和空间,
不易于规模化生产放大和自动控制。
流感大流行的威胁,对快速生产大量流感疫苗的需求也随
之上升。流感疫苗在鸡胚中的生产依赖于鸡胚的有限供
应。疫苗生产从鸡胚向细胞培养方法和一次性产品的转换
提供了生产灵活性,将显著减少疫苗临床试验和报批的时
间,从而有效缩短上市周期。因此,新型的基于细胞培养
的疫苗生产工艺是确保更快速反应的一种有效方法,成为
技术发展的趋势。
多个细胞株已经广泛用于病毒类疫苗的生产。本研究使用
的Vero细胞,目前已经成为用于多种人用疫苗生产的公认
平台。因为在人疫苗生产中必须避免动物来源的成分,本
研究中经过优化的病毒培养工艺是完全无动物源性成分
的。
图1.具有WAVEPODII*反馈控制器和一次性Cellbag生物反应器的
WAVE生物反应器。
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材料与方法
细胞株、维持和扩增
源自非洲绿猴肾细胞的Vero细胞购自ATCC(Nr. CCL81)。
细胞在含有三种不同添加剂的无动物源性无血清培养基中
进行培养:Pluronic** F-68 (Sigma-Aldrich)、大豆蛋白胨
(Fluka)和大豆来源的胰酶抑制剂(Sigma-Aldrich; 1 mg/mL溶
解在磷酸盐缓冲液[PBS]中)。Vero细胞在Cytodex 1微载体
(GE Healthcare)上进行接种和扩增,然后使用WAVE20/50
生物反应器(GE Healthcare)中进行病毒感染和生产。
为了在T形瓶中维持培养或在Cell Factory (Nunc)中细胞扩
增,Vero细胞先用PBS-EDTA (Sigma-Aldrich)洗涤,然后
使用重组蛋白酶TrypLE** Select (Invitrogen)或Accutase**
(PAA Laboratories)进行消化。
微载体准备
微载体Cytodex 1终浓度为3 g/L (1)。微载体先进行水化,
并在硅化的玻璃容器(Sigmacote**, Sigma-Aldrich)用PBS洗
涤三次,之后在121℃下高压灭菌15分钟(2)。然后用
培养基洗涤后,转移到Cellbag生物反应器中。
WAVE 生物反应器
WAVEPODII反馈控制器与WAVE生物反应器一起使用以自
动控制pH、温度、氧气、CO₂和混合等参数。Vero细胞在
Cellbag-10L中培养,工作体积为2 L。培养条件为37℃,
pH 7.2,5% CO₂。用新型光纤溶氧电极监测溶氧。
细胞取样和计数
对于常规培养,Vero细胞在T型瓶中每周被传代两次。细
胞工厂被用于细胞扩增。消化的Vero细胞样品使用台盼蓝
染色方法在Cedex** HiRes细胞分析仪(Innovatis)上进
行计数。
WAVE生物反应器中生长的细胞每天取样以测定细胞密
度和细胞形态。细胞悬液样品经过袋子内置的无菌取样
口在连续摇动状态下取出。样品(1 mL)被转移到一根
试管中,然后去除800 μL的上清,同时加入等体积的工
作染色液(0.1%结晶紫溶解于0.1 M柠檬酸和1% Triton**
X-100)。然后上清漩涡振荡45秒,最后在Bürker血球计
数板中计数细胞核。
细胞形态和贴附
使用连接照相机(Eclipse TS100, Nikon)的倒置显微镜观
察细胞形态及微载体上的贴附状态。
Vero细胞Cytodex 1微载体贴壁
评估不同的摇动参数和培养基组成以确定适合Vero细胞
贴附到Cytodex 1微载体的最佳条件。在工作体积为2 L的
Cellbag-10L中进行细胞培养。所有的培养都接种4×10⁵
细胞/mL。参考文献3中介绍的摇动参数略作修改如下所
示:
• 间歇摇动6小时(1 6 r p m / 4 . 5°摇动2分钟,然后0
rpm/0°静止18分钟)。为了促进细胞铺展,培养物在
切换到连续摇动(11 rpm/4.5°)前保持2小时静止。
• 间歇摇动6小时(1 6 r p m / 4 . 5°摇动2分钟,然后0
rpm/0°静止8分钟)。为了促进细胞铺展,培养物在切
换到连续摇动(11 rpm/4.5°)前保持2小时静止。
• 连续摇动(11 rpm/4.5°)。
• 连续摇动(12 rpm/5°)
• 连续摇动(12 rpm/5°),然后在24小时后提高速度到
(14 rpm/5°)
病毒储液制备
Influenza A/Solomon Islands/3/2006 (H1N1) IVR145 WHO
(源自鸡胚)在Vero细胞中经过传代适应。建立工作病
毒储液,并使用组织培养感染剂量50(TCID)50测试病毒感
染性。计算五次TCID50分析的平均值得到病毒储液滴度为
106.9。
工艺开发
工艺开发被分为两部分:细胞贴壁和生长;病毒感染。
细胞贴壁和生长的优化
评估下列参数:
培养基组成
• VP-SFM (Invitrogen)
• OptiPRO**-SFM (Invitrogen)
重组蛋白酶(用于传代前的细胞消化)
• TrypLE Select
• Accutase
培养基添加剂(用于替代动物血清)
• Pluronic F-68,一种非离子型乙烯和环氧丙烯共聚物,
被用作消泡剂和抗击细胞培养中剪切力的细胞膜稳定
剂,常用于各种生物反应器。
• 大豆蛋白胨,脱脂大豆粉的木瓜蛋白酶 /胰酶消化产
物,是维生素和碳水化合物的极好的来源。
• 大豆胰酶抑制剂 在细胞培养中用于抑制细胞消化期间
的胰酶活性,尽可能减少细胞损伤/死亡。
摇动条件
• 摇动条件如上文Vero细胞Cytodex 1微载体贴壁中所述。
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Vero细胞在T型瓶中的生长
Vero细胞在T型瓶中使用VP-SFM或OptiPROSFM培养基进
行扩增。细胞传代是先用PBS-EDTA洗涤T型瓶一次,然
后加入TrypLE Select或Accutase在37℃孵育大约2分钟。
在Cedex HiRes细胞分析仪中测定细胞数和活力。细胞以
4×104细胞/cm2的密度被接种到新的T型瓶中,然后在
37℃含有5%CO₂的恒温培养箱中培养。
Vero细胞在WAVE生物反应器中的生长
为了更好的支持细胞在无血清培养中生长,细胞培养基中
添加Pluronic F-68、大豆蛋白胨(Soy peptone)和胰酶抑制
剂。使用上面列出的摇动条件(见第2页)对不同培养基
添加剂的细胞生长进行评估。
病毒感染参数的优化
在T型瓶和WAVE生物反应器中的感染
使用范围为1:1000到1:5000的病毒稀释倍数进行T型瓶和
WAVE生物反应器的感染。使用的胰酶(猪胰酶,Sigma-
Aldrich)浓度为5到25 µg/mL。使用TCID50检测法测定病
毒滴度。Vero细胞在96孔板中生长,用10倍系列稀释的
病毒悬液感染,然后孵育5天。显示细胞病变效应的孔被
计数,然后根据Reed and Müench的方法计算TCID50滴度
(4)。
使用Biacore*(GE Healthcare)测定血凝素浓度(HA)
(5)。
结果
细胞贴壁和生长的优化
Vero细胞在T型瓶中的生长
在VP-SFM或OptiPRO-SFM培养基中生长的Vero细胞在T型
瓶中经过七次传代后评估细胞生长和形态。采用VP-SFM
的平均倍增时间为30小时;采用OptiPRO-SFM观察到的
倍增时间略短,为25小时。对于每次传代,使用TrypLE
Select或Accutase重组蛋白酶消化细胞。
使用这两种蛋白酶进行细胞消化,倍增时间无明显差别。
然而,用TrypLE处理的培养物根据显微镜观察具有略好的
细胞形态(图2A VS 2B)。
Vero细胞在微载体上的贴壁和生长
为了研究细胞贴壁和生长,Vero细胞使用OptiPRO-SFM培
养基中在24孔板内的Cytodex 1上生长。在接种到Cytodex
1之前,细胞使用TrypLE消化。
在孵育1小时后,细胞开始贴附到微载体上,如图3A所
示。细胞在22小时后铺展和开始增殖(图3B)。48小时
后,细胞被均匀分布,且微载体接近汇合(图3C)。
A)
B)
A) B) C)
图2.Vero细胞分别使用TrypLE Select或Accutase进行细胞消化,
在OptiPRO-SFM中生长48小时。A)使用TrypLE的OptiPRO-SFM
培养基;B)使用Accutase的OptiPRO-SFM培养基。
图3.采用OptiPRO-SFM培养基在Cytodex 1上生长的Vero细胞形态。在孵育A)1小时;B)22小时和C)48小时后的细胞形态。
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Vero细胞在WAVE生物反应器中的生长
从静止培养移动到搅拌混合反应器系统意味着细胞将经受
混合带来的剪切力。可以向培养基中加入剪切力保护剂
Pluronic F-68。为了获得无动物源性成分的培养条件,可
以使用大豆蛋白胨而不是血清,然后加入胰酶抑制剂以灭
活蛋白酶。
当比较间歇式和连续式摇动条件进行贴壁时(见第2
页),可以观察到在微载体上分布细胞的明显差别。当使
用连续摇动条件时,细胞均匀度被提高。为了在连续摇
动条件中获得一个稳定可靠的接种,通过测试三个不同
浓度(0.1%、0.2%和0.3%)评估大豆蛋白胨的作用,同
时保持胰酶抑制剂和Pluronic F-68的浓度在20 mg和0.2%
不变。根据显微镜观察评估贴壁和生长(数据此处未列
出)发现,最佳的大豆蛋白胨浓度为0.3%。所需要的胰
酶抑制剂的量取决于用于细胞消化的TrypLE的量。例如,
当100 mL的TrypLE被加入2 L培养物时,使用20 mg的胰
酶抑制剂。获得最佳的细胞生长需要添加这三种添加剂
(Pluronic F-68, 0.2%; soy peptone, 0.3%和胰酶抑制剂,
2L培养物加20 mg),如图4和5所示。
病毒感染参数的优化
T型瓶中感染
感染时的细胞密度大约为1.1×106细胞/mL,收获时间
(TOH)为感染后3天。每天对细胞进行目视检查以观察
细胞病变效应(CPE)。使用TCID50对收获的材料进行分
析(数据未列出)。关于CPE和病毒滴度,用于感染的最
佳条件是胰酶浓度为12.5 µg/mL,病毒稀释度为1:1000。
根据病毒储液滴度106.9、病毒稀释度1:1000和细胞密度
1.1 × 106细胞/mL计算病毒感染复数(MOI)。 计算的
MOI为0.004。
WAVE生物反应器中的感染
为了研究工艺稳定性和可重复性,在WAV E生物反应
器中,使用3 g/L的Cytodex 1微载体和含0.2% Pluronic
F-68、0.3%大豆蛋白胨和20 mg胰酶抑制剂的OptiPRO-
SFM培养基进行2升规模多个批次的培养。为了获得均匀
和稳定可靠的细胞生长,选择下列摇动条件:12 rpm/5°
摇动24小时贴壁,然后提高到14 rpm/5°直到收获。起
始的Vero细胞密度为0.4×106细胞/mL。微载体在48小时
后接近汇合(图6)。感染参数为:MOI, 0.004; TOI, 48 h;
TOH, 72 h; 温度,37℃。目测检查所有批次的CPE(图7),
并使用TCID50分析病毒滴度(图8)。感染24小时后观察
到早期病变效应(图7A),然后细胞从微载体上脱落,
并在感染72小时后被病毒裂解(图7B)。
A) B)
0 24 48
(×10
6 cel
ls/m
L)
(h)
with supplementswithout supplements
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
A) B)
A) B)
图4.在48小时生长后的细胞形态。A)无添加剂;B)有添加
剂。
图6.Vero细胞在WAVE生物反应器中的微载体接种后的细胞形
态。接种后A)5小时和B)48小时。
图7. WAVE生物反应器中的培养物的病毒感染后的CPE。A)感染
后24小时;B)感染后72小时。
图5.添加剂对细胞生长的影响。
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培养期间血凝素浓度和病毒滴度的动力学
在感染后的不同时间点取样。使用Biacore检测法测定血
凝素(HA)浓度,使用TCID50分析病毒感染滴度。结果如
图9所示。在相对早期(感染后12小时)出现滴度峰值,
而HA浓度的上升会延迟几天。
结果和讨论
本工艺研究的目的是建立一种无动物源性成分的培养工
艺,用于在Vero细胞中生产流感病毒,最终获得了一种易于
放大和适合工业化生产的快速、简单可靠的培养工艺。例
如,使用一次性Cellbag在WAVE生物反应器中的流感病毒的
生产是传统不锈钢生物反应器的一种快速和方便的替代,因
为WAVE很容易安装,不需要清洗,操作灵活成本低。
我们已经能够在无动物源性成分的条件中生长这些培养
物。从制药法规安全的角度来看,在人类疫苗生产中避免
任何动物成分十分重要,而且它对于活的病毒疫苗至关重
要,因为灭活外来病毒的选择十分有限。
本研究确定了用于WAVE生物反应器最适的摇动条件。为
了确定无血清条件下尽可能减少剪切力的最佳条件,测试
了许多参数,通过对微载体上生长的Vero细胞的形态学检
查来评估。发现在微载体上提供均匀的细胞分布十分重
要。
最佳收获时间根据在感染后相对早期达到峰值的病毒滴度
来确定。对于裂解疫苗或亚单位疫苗,病毒滴度不是最
关键的因素,为了获得最大量的病毒抗原(在本例中为
HA),往往有可能在稍后收获。
在本研究中,我们没有研究放大的影响。然而,这里使用
的所有方法和设备目前已经被用于商业上大规模的疫苗生
产。
根据TCID 50值的计算表明,假设总工艺收率为20%,剂
量为107感染性病毒颗粒,从2升培养物中可以生产大约
50,000剂量的单价活流感病毒(LIV)疫苗。因此,一个
100升的WAVE反应器将能够生产2,500,000剂量的单价活
疫苗。
优化后的疫苗生产工艺的简单流程图如图10所示。
1 2 3 4 5 6 7
Tite
r (lo
g 10)
109876543210
图8.WAVE生物反应器中七批不同的2升流感病毒的TCID50值。
图9.培养期间HA和TCID50的动力学。
图10.Vero细胞在WAVE生物反应器中使用Cytodex微载体的流感病毒培养的工作流程图。
72 96 12024 48 144Time post-infection (h)
HA (µg/mL)TCID50 (log10)
12
10
8
6
4
2
0
12
10
8
6
4
2
0
Vero Vero
WAVEA/Solomon
Islands/H1N1 TCID50
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