VILNIAUS UNIVERSITETAS
TVIRTINU: ……………………… Pareigos Vardas, Pavardė
2019 m. ……………………mėn. …..d.
ŽEMĖS, MAISTO ŪKIO, ŽUVININKYSTĖS IR KAIMO PLĖTROS
MOKSLINIŲ TYRIMŲ IR EKSPERIMENTINĖS PLĖTROS 2015–2020 METŲ
PROGRAMA
KRAUJASIURBIŲ IR KITŲ VABZDŽIŲ ĮTAKA MECHANINIAME AFRIKINIO
KIAULIŲ MARO VIRUSO PERNEŠIME Į KIAULIŲ LAIKYMO VIETAS IR
ŠERNŲ POPULIACIJOJE
2019 M. GALUTINĖ ATASKAITA
Tyrimo vadovas
Jurga Turčinavičienė
Vilnius
2019
2
ĮVADAS
Afrikinis kiaulių maras (toliau - AKM) yra viena iš labiausiai užkrečiamų ir
letalių kiaulių bei šernų ligų. Lietuva yra viena iš šalių, kurioje dėl šios ligos
kiaulininkystės sektorius patiria didžiulius ekonominius nuostolius, todėl žinios apie šios
ligos sukėlėją, jo plitimo kelius, gamtinius židinius ir galimus vektorius yra būtinos norint
sumažinti šios ligos riziką. Nuo 2014 metų AKM virusas paplito Baltijos šalyse ir
Lenkijoje (EFSA, 2015), 2017 metais virusas aptiktas Čekijoje ir Rumunijoje, 2018
metais – Vengrijoje (EFSA, 2018). Virusu užkrėstos teritorijos plečiasi toliau į pietryčių
Europos šalis, todėl viruso plitimo būdų nustatymas leistų naudoti prevencines priemones
ir neleisti virusui plisti (EFSA, 2019).
Šiuo metu bandoma nustatyti, kur turi krypti AKM moksliniai tyrimai, ir kurioje
srityje yra mažiausiai žinoma. Identifikuotos tokios žinių spragos: pirmiausia, kokį
vaidmenį vaidina šernai šio viruso pernešime ir platinime, antra, kaip virusas išlieka ir yra
pernešamas gamtoje, trečia, kokios biosaugos priemonės yra efektyviausios. Svarbiausia,
reikalingos geresnės žinios ir išsamesni tyrimai, kaip virusas plinta ir išlieka tiek
aplinkoje, tiek laukinėse šernų populiacijose ir kaip virusas patenka į kiaulių laikymo
vietas. Taip pat pabrėžiama, kad būtina ištirti ir nariuotakojų vaidmenį šios ligos sukėlėjų
transmisijoje (EFSA, 2019). Gilesni moksliniai tyrimai padėtų sukurti tikslesnius
biosaugos protokolus ir aiškesnius epidemiologinius veiksmus dar neužkrėstose
teritorijose.
Baltijos šalyse virusas cirkuliuoja tarp naminių kiaulių (Sus scrofa domesticus) ir
šernų (Sus scrofa), sukeldamas panašius klinikinius požymius abiejų rūšių gyvūnuose,
todėl visos apsaugos priemonės yra skirtos viruso transmisijos tarp šernų ir naminių
kiaulių apribojimui. Manoma, kad taikomos priemonės yra pakankamai efektyvios, tačiau
virusas patenka ir į kiaulių fermas, kuriose yra laikomasi griežčiausių biosaugos
reikalavimų. Tokiais atvejais viruso patekimo keliai yra nežinomi.
2018 metais vykdydami projektą “Vabzdžių įtaka afrikinio kiaulių maro viruso
plitimui“ iškėlėme pagrindinę hipotezę, kuri teigia, kad AKM protrūkiai yra susiję su
kraujasiurbių vabzdžių, potencialiai galinčių pernešti AKM, gyvybiniu ciklu ir aplinkos
sąlygomis (temperatūra, drėgme ir kt.). Toliau tęsdami pradėtą darbą bei remdamiesi jau
atliktais kitų mokslininkų darbais, šio projekto rėmuose tikrinome keletą darbinių
hipotezių apie tai, kad musė kandiklė Stomoxys calcitrans yra galimas mechaninis viruso
3
pernešėjas. Dar 1987 metais buvo nustatyta, kad mechaniškai virusą pernešti gali musės
kandiklės Stomoxys calcitrans (Mellor ir kt., 1987). Be to, Olesen ir kt. (2018) patvirtino,
kad S. calcitrans gali perduoti virusą ne tik besimaitindamos gyvulio krauju, bet ir
atsitiktinai patekusios į kiaulės virškinimo traktą. Antra hipotezė buvo tokia, kad sparvos
(Diptera: Tabanidae) galėtų perduoti virusą besimaitindamos gyvulių krauju, o trečioji -
vabzdžiai, kurių lervinės stadijos maitinasi gaišenomis, tokie kaip mėsmusės (Diptera:
Calliphoridae) bei tikrosios musės (Muscidae), galėtų pernešti virusą nuo kritusių šernų
sveikiems žvėrims ir kiaulėms.
Šio projekto tikslas - tęsti 2018 metais pradėtą mokslinį tiriamąjį darbą apie
kraujasiurbių ir kitų rūšių vabzdžių, kaip galimų AKM mechaninių pernešėjų, įtaką AKM
plitime, viruso mechaninio pernešimo iš gamtinių židinių į kiaulių fermas galimybes ir
galimą platinimą šernų populiacijoje. Šiam tikslui įgyvendinti buvo iškelti tokie
uždaviniai:
1. Vykdyti pagrindinių kraujasiurbių ir kitų vabzdžių rūšių, galimai galinčių
mechaniškai pernešti AKM, metinio skraidymo aktyvumo analizę Lietuvoje;
2. Nustatyti kraujasiurbių ir kitų galimų pernešėjų rūšinę sudėtį kiaulių laikymo
patalpose AKM protrūkių metu tiek komerciniuose, tiek ir nekomerciniuose kiaulių
ūkiuose ir atlikti AKM viruso paieškas juose;
3. Atlikti kraujasiurbių ir kitų galimų vabzdžių - pernešėjų rūšinę sudėtį šernų
gaišimo vietose ir atlikti AKM viruso paieškas juose;
4. Nustatyti, ar AKM virusas išlieka šernų gaišenomis besimaitinančių mėsmusių
lervose, lėliukėse ir išsiritusiuose suaugėliuose;
5. Parengti rekomendacijas kiaulių augintojams dėl vabzdžių įtakos AKM plitimui
ir galimų prevencinių priemonių.
TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
Kraujasiurbių vabzdžių rūšių, potencialiai galinčių dalyvauti AKM viruso
transmisijoje metinio aktyvumo dinamikai stebėti buvo statomos NZI mėlyno audinio
gaudyklės (1 priedas, 1 pav.), kurios pasižymi efektyvesniu kraujasiurbių vabzdžių
priviliojimu nei kitos vabzdžių gaudyklės (Mihok, 2002; Van Hennekeler ir kt., 2008).
Tyrimai, atlikti kitose pasaulio šalyse parodė, kad šios gaudyklės yra efektyvios gaudant
muses kandikles Stomoxys calcitrans, kuriose, kaip rodo pastarųjų metų tyrimai (Olesen
4
ir kt., 2018), gali išsilaikyti AKM virusu užkrėstas kraujas, bei sparvas (Tabanidae) (Van
Hennekeler ir kt., 2008).
Gaudyklės buvo pastatytos dviejose vietose, apie 5-20 metrų atstumu nuo kiaulių
laikymo vietos. Vietos buvo pasirinktos AKM užkrėstose teritorijose, kuriose buvo
nustatyti AKM užsikrėtę šernai. Pirmoji vieta buvo kiaulių fermų kompleksas
Poškaičiuose, Gaukštonių g. 79, Nemenčinės sen., Vilniaus raj. (54.891858, 25.429798
(WGS)). Aplink kompleksą auginamos įvairios žemės ūkio kultūros, kuriose buvo
stebimi šernai. Antroji vieta buvo prie stambaus kiaulių auginimo komplekso Sirvyduose,
Lekėčių sen., Šakių raj (55.009557, 23.458766 (WGS)).
Šiose vietose buvo vykdomi pagrindinių kraujasiurbių vabzdžių rūšių: musės
kandiklės (Stomoxys calcitrans) (1 priedas, 2 pav.), sparvų (Tabanidae, Haematopota,
Hybomitra), bei kitų vabzdžių – Calliphoridae (Lucilia), Muscidae (Musca) sezoninės
dinamikos stebėjimai surenkant gaudyklių medžiagą kiekvieną savaitę nuo gegužės 10 d.
(gaudyklių pastatymo data) iki spalio 31 d.
Po masinių AKM atvejų Ąžuolų Būdoje, Marijampolės sav., ir netolimose
teritorijose, liepos 24 d. NZI gaudyklė buvo pastatyta Ąžuolų Būdos kaime netoli (apie
10-15 m) kiaulių tvarto, kurio šeimininkė buvo susijusi su prieš tai Ąžuolų Būdoje
buvusiu AKM židiniu. Po savaitės ir tvarte, netoli kurio buvo atliekami vabzdžių tyrimai,
buvo nustatytas AKM židinys. Tokiu būdu buvo patikrinta, ar vabzdžiuose, kurie
potencialiai galėtų pernešti AKM virusą, buvo AKM viruso laikotarpiu tarp dviejų AKM
židinių.
Nustatant kraujasiurbių vabzdžių paplitimą kiaulių laikymo patalpose AKM
židinyje, entomologinė medžiaga buvo rinkta dviejų protrūkių metu, (liepos 15 ir 31
dienomis) Ąžuolų Būdos kaime. Vabzdžiai buvo gaudomi entomologiniais tinkleliais
kiaulų laikymo vietų viduje bei išorėje, nuo pastato sienų ir šalia esančių daiktų,
fiksuojami 96 proc. etanolyje arba DNR fiksavimo tirpale tolimesniems laboratoriniams
tyrimams. Vėliau vabzdžiai buvo identifikuojami iki rūšies arba genties lygmens.
Iš visų sugautų vabzdžių buvo išskirta DNR naudojant DNeasy Blood&Tissue Kit
(QIAGEN, Germany) pagal gamintojo instrukcijas. AKM nustatymui vabzdžiuose buvo
panaudota optimizuota diagnostinė polimerazės grandininė reakcija (PGR) su specifiniais
pradmenimis (Luo ir kt., 2017). Gauti 326 bp DNR fragmentai buvo sekvenuoti
(Macrogen, Olandija) ir sekos palygintos su Genų banke deponuotomis sekomis. Dalis
mėginių buvo patikrinta Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto
5
Molekulinės biologijos ir genetiškai modifikuotų organizmų skyriaus laboratorijoje
nustatant AKM virusą tikro laiko PGR metodu.
Viruso išlikimas šernų gaišenomis besimaitinančių musių lervose ir suaugėliuose
buvo nustatomas tiriant lervas surinktas iš šerno gaišenos. Kritęs nuo AKM šernas buvo
izoliuotas tinkline tvora nuo aplinkos (Ilgakiemis, Kauno apskritis, 54.76593, 23.83296
(WGS)). Tyrimas buvo suderintas su NMVT Skubios veiklos skyriumi. Surinktų lervų
auginimas vykdytas NMVRVI laboratorijoje. Iš kritusio šerno paimama 20 III-IV ūgio
lervų (1 priedas, 3 pav.): 10 lervų nuplaunama steriliu fosfatiniu buferiu ir paliekama
vystytis indeliuose laboratorijoje apie savaitę, o kitos10 lervų nenuplaunamos ir
paliekamos vystytis indeliuose laboratorijoje tokiomis pat sąlygomis. Po vidutiniškai7
parų kambario temperatūroje lervos paprastai virsta lėliukėmis. Iš dviejų tiriamų musių
grupių (nuplautų buferiu ir neplautų) paimama po 5 lėliukes viruso nustatymui PGR būdu
(kiekviena lėliukė analizuojama atskirai), o kitos lėliukės paliekamos indeliuose
laboratorijoje tolesniam vystymuisi. Po DNR išskyrimo išsaugomi po lizavimo likę
lėliukių likučiai (užpilti 70% spiritu) morfologiniam lervų identifikavimui. Maždaug po 7
dienų (14 dienų nuo lervų paėmimo iš šerno) kambario temperatūroje lėliukės virsta
suaugėliais. Iš dviejų tiriamų grupių paimami 5 suaugėliai viruso nustatymui PGR būdu,
o po DNR išskyrimo išsaugomi vabzdžio likučiai anksčiau nurodytu būdu, kiekvienas
vabzdys analizuojamas atskirai.
Tam, kad patikrintume, kaip virusas išsilaiko AKM užkrėstoje šerno gaišenoje
besivystančiose musių lervose natūraliomis sąlygomis, iškasėme 6 šių vabzdžių lėliukes
aplink gaišeną esančioje miško paklotėje ir laboratorijoje iš jų išauginome muses. Iš
imago buvo iškirta DNR ir patikrinta, ar musėse išlieka AKM virusas.
REZULTATAI
KRAUJASIURBIŲ IR KITŲ VABZDŽIŲ RŪŠIŲ, GALIMAI GALINČIŲ
MECHANIŠKAI PERNEŠTI AKM, METINIO AKTYVUMO ANALIZĖ LIETUVOJE
Sezoninė kraujasiurbių ir kitų vabzdžių skraidymo aktyvumo dinamika buvo
nustatyta analizuojant NZI gaudyklėmis (1 priedas, 1 pav.) surinktus duomenis. Šiais
metais surinktų vabzdžių skraidymo aktyvumas buvo palygintas su 2018 metų
duomenimis. Viso buvo surinkti ir apibūdinti 1806 vabzdžiai, tame tarpe kraujasiurbiai
6
vabzdžiai: 45 sparvos Haematopota sp. (Tabanidae), 1012 sparvų Hybomitra sp.
(Tabanidae), 366 musės kandiklės S. calcitrans (Muscidae), 58 kraujasiurbiai uodai
(Culicidae). Per tyrimų laikotarpį buvo pagautos tik 8 Chrysops genties ir 2 Tabanus
genties sparvos (Tabanidae), o taip pat lavonmusių (Sarcophagidae).
Apskaičiuotas santykinis kiekvieno taksono gausumas kaip procentinė išraiška
nuo visų sugautų to taksono vabzdžių. Sparvų Haematopota gausiausiai buvo pagauta
Sirvyduose birželio ir rugpjūčio mėnesiais, tačiau Poškaičiuose jų gausumo dinamika
buvo visiškai kitokia – šie vabzdžiai buvo sugauti tik liepos viduryje ir rugpjūčio
pradžioje (1 pav.). Gegužės paskutinę savaitę šie vabzdžiai taip pat buvo fiksuoti, tačiau
tuo metu gaudyklė Sirvyduose dar nebuvo pastatyta, todėl duomenų apie šios genties
musių skraidymą gegužės mėnesį palyginti negalime (1 pav.). Hybomitra genties sparvos
buvo gausiausiai pagauta Tabanidae šeimos sparvų grupė Sirvyduose, kur jų didžiausias
gausumas buvo nustatytas birželio mėnesį. Tuo tarpu Poškaičiuose sugauti vos keli
Hybomitra genties individai (2 pav.). Po rugpjūčio paskutinės savaitės nebuvo pagauta
nei viena Tabanidae šeimai priklausanti musė.
Tuo tarpu S. calcitrans musės buvo aptinkamos visu tyrimų metu (nuo gegužės
paskutiniosios savaitės iki spalio antros savaitės), tačiau jų gausumas ryškiai išauga
liepos antroje pusėje ir išliko aukštas iki spalio mėnesio vidurio (3 pav.).
Literatūros duomenimis šios rūšies musės pietvakarių Prancūzijoje bei Danijoje
turi du skraidymo aktyvumo pikus: vasaros pradžioje ir vasaros pabaigoje - rudenį
(Jacquiet ir kt., 2014, Skovgard ir kt., 2012). Tai, kad nemaža dalis musių kandiklių buvo
pagautos gegužės (Poškaičiai) ir birželio (Sirvydai) mėnesiais, rodo, kad Lietuvoje S.
calcitrans musių skraidymo aktyvumas gali būti panašus, t.y. turintis du skraidymo
aktyvumo pikus.
Gaudyklė Ąžuolų Būdoje buvo pastatyta tik liepos mėnesio viduryje, todėl
neturime duomenų apie galimą S. calcitrans musių skraidymo aktyvumą gegužės-birželio
mėnesiais šioje tyrimų vietovėje. Stomoxys calcitrans gausumas Ąžuolų Būdos
gaudyklėje yra labai aukštas palyginus su kitomis tyrimų vietomis – per savaitę buvo
pagaunama iki 46 šios rūšies musių . Viena iš šio musių kandiklių gausumo priežasčių
galėtų būti tai, kad gyventojai augina nemažai karvių, o S. calcitrans paprastai maitinasi
galvijų krauju. Šis priežastinis ryšys buvo pastebėtas ir tiriant AKM viruso plitimo
priežastis - tikimybė plisti virusui didesnė ten, kur kiaulės laikomos tame pačiame tvarte
7
su karvėmis (A. Malakauskas, žodinis pranešimas). Be to, šio vabzdžio sezoninis
skraidymo aktyvumas iš esmės koreliuoja su AKM protrūkiais Ąžuolų Būdoje (3 pav.).
1 pav. Sparvų Haematopota santykinis gausumas NZI gaudyklėse tirtose AKM
teritorijose 2019 m.
2 pav. Sparvų Hybomitra santykinis gausumas NZI gaudyklėse tirtose AKM teritorijose
2019 m.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II
Gegužė Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis Spalis
Haem
ato
pota
mus
iųsa
ntyk
inis
ga
usum
as (
%)
Poškaičiai Sirvydai
0
5
10
15
20
25
30
35
III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II
Gegužė Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis Spalis
Hyb
om
itra
mus
ių s
anty
kini
s ga
usum
as
(%)
Poškaičiai Sirvydai
8
3 pav. Stomoxys calcitrans gausumo dinamika NZI gaudyklėse tirtose AKM teritorijose
2019 m. Rodyklėmis pažymėtos AKM protrūkių datos.Gaudyklė Ąžuolų Būdoje
pastatyta tik liepos mėnesio viduryje.
VIRUSO DNR NUSTATYMAS NZI GAUDYKLĖMIS SUGAUTUOSE
VABZDŽIUOSE
Iš 366 NZI gaudyklėse sugautų S. calcitrans, 80 vabzdžių buvo patikrinta dėl AKM
viruso DNR. Išskyrus vabzdžių DNR, buvo atlikta specifinė PGR reakcija AKM viruso
identifikavimui. Šešiuose iš jų rasta viruso DNR (4 pav.).
Viruso DNR buvo nustatyta dar viename kraujasiurbyje vabzdyje – uode
(Culicidae), o taip pat musėje M. domestica bei viename voragyvyje (Pseudoscorpiones).
Nei sparvose, nei gaudyklėmis pagautose mėsmusėse nebuvo aptikta AKM viruso DNR.
Tai, kad iš gaudyklėmis pagautų musių kandiklių net 7,5% buvo aptikta AKM viruso
DNR rodo, kad šioms musėms turėtų būti skirtas didesnis dėmesys kuriant apsaugos nuo
AKM viruso priemones.
Atlikus gautų p72 geno fragmentų sekoskaitą, pastebėtas kintamumas 104059
saite (palyginus su visu viruso genomu) (5 pav.). Vieno nukleotido pakaita nustatyta
AKM viruso sekose rastose dviejuose gaudyklėse sugautuose S. calcitrans ir viename
Pseudoscorpiones individe. Nors šios sekos priskiriamos II genotipo sekoms, tačiau tai
rodo ir viruso kintamumą vieno genotipo viduje, kas buvo pastebėta ir pirmo AKM
viruso genotipo atveju (Gallardo ir kt., 2009)
02468
101214161820
III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II
Gegužė Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis Spalis
Sto
moxy
sm
usių
san
tyki
nis
gaus
umas
(%
)
Poškaičiai Sirvydai Ąžuolų Būda
9
4 pav. AKM viruso DNR paieškos rezultatai gaudyklėmis sugautuose vabzdžiuose.
1 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
2 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
3 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
4 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
5 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
6 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
7 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
8 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
9 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
10 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
11 -GTCTGGAAAAGCTGTATCTCT-
12 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
13 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
14 -GTCTGGAAAAGCTGTATCTCT-
15 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
16 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
17 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
18 -GTCTGGAAAAGCTGTATCTCT-
19 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
20 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-
5 pav. p72 geno fragmento kintamumas 104059 saite (rėmelyje). 1-4 ir 7-20 iš mūsų
mėginių gautos sekos, 5-6 sekos MH713612.1ir LC322016.1 iš Genų banko
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
10
KRAUJASIURBIŲ IR KITŲ GALIMŲ PERNEŠĖJŲ RŪŠINĖ SUDĖTIS KIAULIŲ
LAIKYMO PATALPOSE AKM PROTRŪKIŲ METU IR AKM VIRUSO DNR
NUSTATYMAS
Šiais metais vabzdžiai buvo tirti dviejuose AKM židiniuose. Buvo surinkti
dvisparnių būriui priklausantys vabzdžiai, o vyraujančios dvisparnių vabzdžių šeimos –
Muscidae, Calliphoridae, Tabanidae. Musė kandiklė S.calcitrans (Muscidae) buvo gana
gausi gaudyklėse, tačiau tvartų viduje buvo sugauti tik pavieniai vabzdžiai. Panašiai
tvartuose buvo pagautos tik pavienės Haematopota sp. bei Hybomitra sp. (Tabanidae)
sparvos, nors gaudyklėse kai kada tai buvo dominuojantys vabzdžiai. Tiek viduje, tiek
išorėje buvo sugauta Musca (Muscidae) genties vabzdžiai bei pavienės Lucilia genties
mėsmusės. Rūšinė vabzdžių sudėtis gerokai skyrėsi nuo 2018 metų stambiose fermose
sugautų vabzdžių, nes buvo sugauta daugiau įvairių vabzdžių rūšių.
Iš visų surinktų vabzdžių buvo išskirta DNR bei atlikta PGR su specifiniais AKM
viruso pradmenimis. Vabzdžių, sugautų ir ištirtų kiaulių laikymo patalpose bei išorėje
dviejuose AKM židiniuose skaičius ir rūšinė sudėtis yra parodyta 1 lentelėje.
1 lentelė. Vabzdžiai AKM židiniuose
Vidus Tirtų individų
skaičius (rastas
AKMV)
Išorė Tirtų individų
skaičius
Hybomitra 2 Lucillia 1
Muscidae 4 (1) Haematopota 1
Stomoxys 3 (1) Muscidae 2
Stomoxys 5
Tvarto viduje sugautuose Stomoxys ir Muscidae vabzdžiuose buvo identifikuota
viruso DNR. Nusekvenavus gautus AKM viruso P72 geno DNR fragmentus, 326 bp ilgio
seka buvo palyginta su Genų banke deponuotomis sekomis. Buvo patvirtinta, kad visos
sekvenuotos sekos priklauso AKM viruso II genotipui ir yra beveik identiškos viruso
sekoms, kurių identifikavimo numeriai yra šie: MH713612, MH681419, LC322016,
LS478113. Tai, kad dalyje viduje sugautų vabzdžių buvo nustatyta viruso DNR, rodo kad
viruso plitimas lokaliai galėtų būti susijęs su šiais vabzdžiais.
11
Žinoma, kad iš kraujasiurbių vabzdžių būtent musė kandiklė Stomoxys calcitrans
gali mechaniškai perduoti AKM virusą maitindamasi tiek užkrėstų šernų, tiek kiaulių
krauju, nors labiau tikėtina, kad virusas patenka kiaulėms atsitiktinai suėdus muses
(Olesen ir kt., 2018). Be to, Stomoxys musės dažniausiai vystosi ir dauginasi ten, kur
auginami gyvuliai. Kita vertus, mokslininkų tyrimų duomenys rodo (Forth ir kt., 2017),
kad užkrėstoje virusu mėsoje besivystančios Lucilia sericata ir Caliphora vicina lervos
inaktyvuoja virusą, todėl vėliau išsiritusios musės jau nebeturi aktyvaus viruso ir viruso
rezervuaro vaidmens negalėtų atlikti. Vabzdžiuose, sugautuose tvarto išorėje nebuvo rasta
viruso DNR.
Buvo tikėtasi rasti AKM viruso DNR ir kitų kraujasiurbių vabzdžių mėginiuose,
tačiau sparvose Hybomitra ir Haematopota viruso DNR nebuvo aptikta. Sparvų
vystymasis nėra susijęs su fermos aplinka, tačiau jos vystosi drėgnose vietose, kuriose
galėtų kontaktuoti su AKM virusu užkrėstais šernais ir vėliau patekę į fermą pernešti
virusą.
AKM židinių vietoje, Ažuolų Būdos kaime po pirmojo protrūkio pastatytoje NZI
gaudyklėje buvo gaudomi vabzdžiai iki sezono pabaigos. Laikotarpiu po pirmojo
protrūkio (2019. 07.12) iki kito protrūkio (2019.07.29) buvo patikrintos tuo metu į
gaudyklę papuolusios S. calcitrans musės. Ištirta 19 vabzdžių ir nustatytas vienas S.
calcitrans individas, kuriame aptikta AKM viruso DNR (6 pav.).
6 pav. Elektroforezės nuotrauka po PGR atlikto su specifiniais AKM viruso
pradmenimis. 1 – DNR molekulinis žymuo (fragmentų ilgis (bp)), 2-9 neigiami mėginiai,
10 - Stomoxys calcitrans (326 bp fragmentas), 11 – neigiama kontrolė, 12- teigiama
kontrolė.
12
AKM VIRUSAS ŠERNŲ GAIŠENOMIS BESIMAITINANČIŲ VABZDŽIŲ
LERVOSE, LĖLIUKĖSE IR IŠSIRITUSIUOSE SUAUGĖLIUOSE
Viruso išlikimas šernų gaišenomis besimaitinančių musių lervose ir suaugėliuose
buvo nustatomas tiriant lervas iš šerno gaišenos. Kritęs nuo AKM šernas buvo izoliuotas
tinkline tvora nuo aplinkos (Ilgakiemis, Kauno apskritis). Lervos paimtos ir paruoštos
auginimui VMVTI laboratorijoje taip, kaip aprašyta metodų dalyje. Tyrimo metodus ir
objektus iliustruoja 5 paveikslas 1 priede. Iš 10-ties lervų, kurios buvo nuplautos
fosfatiniu buferiu, nei viena iš penkių išsiritusių musių Calliphora vomitoria neturėjo
AKM viruso DNR. Tokie patys rezultatai buvo gauti ir tiriant muses užaugintas iš
nenuplautų lervų. Šie rezultatai dar kartą patvirtino, kad mėsmusių lervos inaktyvuoja
virusą, todėl vėliau išsiritusios musės jau nebeturi aktyvaus viruso ir viruso rezervuaro
vaidmens negalėtų atlikti (Forth ir kt., 2017). Tokie rezultatai buvo auginant lervas
laboratorijoje ant substrato, kuriame nėra viruso, todėl tai nevisai atitinka natūraliomis
sąlygomis šerno gaišenose besivystančių musių aplinkos. Norint, kad eksperimentas
labiau atitiktų natūralias sąlygas, aplink gaišeną esančioje miško paklotėje buvo iškastos
ir iki suaugėlio stadijos laboratorioje išaugintos 6 mėsmusių lėliukės . Iš imago buvo
išskirta DNR ir individualiai patikrintas užsikrėtimas AKM virusu. Viruso DNR nebuvo
rasta nei viename tirtame mėginyje, kas patvirtina, kad lervos inaktivuoja virusą ir iš
tokių lervų išsiritę suaugėliai neturi AKM viruso DNR.
Norint nustatyti, kokie vabzdžiai skraido ir kokia jų skraidymo dinamika netoli
yrančios šerno gaišenos, NZI gaudyklė buvo pastatyta 3 m atsumu nuo aptvertos šerno
gaišenos. Gegužės – birželio mėnesiais gaudyklės turinys buvo išrenkamos kas savaitę, o
liepos ir rugpjūčio mėnesiais - kas dvi savaitės, nes tuo metu šerno gaišena jau buvo
stipriai apirusi, o vabzdžiai gaudyklėje buvo sugaunami itin negausiai.
Kaip ir buvo tikėtasi, gegužės-birželio mėnesiais tarp pagautų vabzdžių vyravo
mėsmusės Calliphoridae, kurioms buvo labai palankios sąlygos vystytis šerno gaišenoje
(7 pav.). Nuo birželio vidurio gausiai buvo sugaunamos Hybomitra genties sparvos, kurių
skraidymo aktyvumas Ilgakiemyje buvo panašus kaip ir vienoje iš fermų (Sirvyduose) –
skraidymo aktyvumo pikas registruotas birželio paskutiniąją savaitę (7 pav.). Šios genties
sparvos šiais metais Ilgakiemyje buvo sugaunamos trumpiau - tik iki liepos, o Sirvyduose
- iki rugpjūčio pabaigos. Liepos ir rugpjūčio mėnesiais aplink šerno gaišeną buvo labai
negausiai aptinkamos Hybomitra sparvos, mėsmusės bei Sarcophagidae šeimos
13
lavonmusės. Visu tyrimo metu gaudyklėje buvo aptinkami pavieniai kraujasiurbiai uodai
(Culicidae) (7 pav.).
7 pav. NZI gaudykle prie šerno gaišenos surinktų vabzdžių gausumas.
PROJEKTO REZULTATŲ VIEŠINIMAS
Lapkričio 6 d. perkaitytas pranešimas “Galimas AKM plitimas per vabzdžius” VMVT
Skubios veiklos skyriaus veterinarijos inspektoriams organizuotuose mokymuose
“AFRIKINIO KIAULIŲ MARO SITUACIJOS APŽVALGA”. LSMU Veterinarijos
akademija, Kaunas, 2019.
Tezės ASF-STOP COST konferencijoje (2020 m. sausis)
Turčinavičienė, J., Bernotienė, R., Petrašiūnas, A. Possible transmission of ASFV by
insects: studies in Lithuania.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
EFSA Panel on Animal Health and Welfare. 2014. Scientific opinion on African swine
fever. EFSA Journal, 12 (3628), 1-77.
EFSA Panel on Animal Health and Welfare. 2015. Scientific opinion on African swine
fever. 13(4163), 1-92.
Risk assessment of African swine fever in the south-eastern countries of Europe. 2019.
EFSA Journal, 17(11):5861.
Research gap analysis on African swine fever. 2019. EFSA Journal, 17(8):5811.
0
20
40
60
80
100
120
140
23 30 6 13 19 28 11 31 14 22
gegužė birželis liepa rugpjūtisSur
inktų
mus
ių g
ausu
mas
(i
nd.)
Calliphoridae Sarcophagidae kitos sparvos Hybomitra Culicidae
14
Forth J.H., Amendt J., Blome S., Depner K., Kampen H. 2017. Evaluation of blowfly
larvae (Diptera: Calliphoridae) as possible reservoirs and mechanical vectors of African
swine fever virus. Transbound Emerg Dis. 65, e210-e213.
Gallardo C., Mwaengo D. M., Macharia J. M., Arias M., Taracha E. A., Soler A., Okoh
E., Martin E., Kasiti J., Bishop R.P. Enhanced discrimination of African swine fever virus
isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes. 2009.
Virus Genes, 38:85-95.
Jacquiet P., Rouet D., Boushira E., Salem A., Lienard E., Franc M. 2014. Population
dynamics of Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera:Muscidae) in southwestern France. Revue
Med Vet. 165:9-10, 267-271.
Luo Y., Atim S., Shao L., Ayebazibwe Ch., Sun Y., Liu Y., Ji Sh., Meng X-Y., Li s., Li
Y., Masembe C., Stahl K., Widen F., Liu L., Qiu H-J., 2017. Development of an updated
PCR assay for detection of African swine fever virus. Arch Virol 162:191-199.
MacLeod J., Donnelly J., 1963. Dispersal and Interspersal of Blowfly Populations.
Journal of Animal Ecology 32 (1): 1–32.
Mellor P.S., Kitching R.P., Wilkinson P.J. 1987. Mechanical transmission of
capripoxvirus and African swine fever virus by Stomoxys calcitrans. Research in
Veterinary Science, 43, 109-112.
Mihok S. 2002. The development of a multipurpose trap (the Nzi) for tsetse and other
biting flies. Bulletin of Entomological Research, 92, 385-403.
Olesen A.S., Hansen M. F., Rasmussen T.B., Belsham G.J., Bodker R., Botner A. 2018.
Survival and localization of African swine fever virus in stable flies (Stomoxys
calcitrans) after feeding on viremic blood using a membrane feeder. Veterinary
Microbiology 222:25-29.
Olesen A.S., Lohse L., Hansen M. F., Boklund A., Halasa T., Belsham G.J., Rasmussen
T.B., Botner A., Bodker R. 2018. Infection of pigs with African swine fever virus via
ingestion of stable flies (Stomoxys calcitrans).Transbound Emerg Dis. 1-6.
Sanchez-Cordon
Skovgard H., Nachman G. 2012. Population dynamics of stable flies Stomoxys calcitrans
(Diptera: Muscidae) at an organic dairy farm in Denmark based on mark-recapture with
destructive sub-sampling. Environmental Entomology 41(1):20-29.
15
Van Hennekeler K ., Jones R . E ., Skerratt L. F., Fitzpatrick L. A ., Reid S. A . and
Bellis G. A. 2008. A comparison of trapping methods for Tabanidae (Diptera) in North
Queensland, Australia. Medical and veterinary Entomology, 22, 26-31.
IŠVADOS IR REKOMENDACIJOS
Sezoninės vabzdžių dinamikos duomenys rodo, kad Stomoxys aktyvumas gali
būti susijęs su AKM židinių atsiradimu. Šios musės gausiau aptinkamos netoli galvijų
laikymo vietų, todėl galvijų ir kiaulų laikymas toje pačioje patalpoje arba netoliese galėtų
būti rizikos veiksniu AKM viruso plitimui (Ąžuolų Būdos protrūkių atvejai).
Iš NZI gaudyklėmis surinktų vabzdžių daugiausia AKM viruso DNR aptikimo
atvejų nustatyta Stomoxys calcitrans musėse (7,5 %). Tai, kad iš gaudyklėmis šalia
kiaulių ūkių pagautų musių kandiklių net 7,5% buvo aptikta AKM viruso DNR rodo, kad
šioms musėms turėtų būti skirtas didesnis dėmesys kuriant apsaugos nuo AKM viruso
priemones.
Musėse Musca sp. (Muscidae) sugautose AKM židinio vietose buvo nustatyta
AKM viruso DNR, todėl prielaida, kad viruso plitimas galėtų būti susijęs su šiais
vabzdžiais negalėtų būti atmesta, nes šie vabzdžiai yra judrūs ir jų gausumas kiaulių
laikymo vietose yra didelis.
Per visą tyrimo laikotarpį (2018-2019) mėsmusėse Lucilia, Cynomyia
(Calliphoridae) ir Fannia (Fanniidae) genties musėse (AKM židinių vietose) buvo
nustatyta AKM viruso DNR, todėl viruso plitimas galėtų būti susijęs ir su šiais
vabzdžiais.
Kraujasiurbiuose vabzdžiuose – sparvose (Tabanidae) nebuvo aptikta AKM
viruso DNR.
Mėsmusių Calliphora (Calliphoridae) vystymosi AKM virusu užkrėstose
gaišenose metu AKM virusas neišlieka išsiritusiuose suaugėliuose, todėl mažai tikėtina,
kad musės išsivysčiusios kritusiuose šernuose dalyvauja AKM viruso pernešime.
AKM virusas buvo aptiktas viename Culex genties kraujasiurbiame uode. Tai
rodo, kad šios grupės kraujasiurbiai turėtų būti plačiau tiriami kaip galimi AKM viruso
pernešėjai.
16
REKOMENDUOTINA kiaulių laikymo vietose riboti vabzdžių patekimą, naudoti
nuo vabzdžių apsaugančius langų tinkliukus, užtikrinti jų sandarų įrengimą.
Atsižvelgiant į tai, kad AKM virusu kiaulės gali užsikrėsti ir suėdę tam tikrą kiekį
užkrėstų vabzdžių, ir nors šis užsikrėtimo kelias negalėtų būti tipiškas, tačiau siūlome
netaikyti cheminių priemonių suaugusių musių naikinimui kiaulių laikymo vietose.
Tokioms nugaišusioms musėms pakliuvus į pašarus, tikimybė užsikrėsti AKM išlieka.
Atsižvelgiant į tai, kad daugybinių židinių vietoje (Ąžuolų Būda) buvo
užfiksuotas palyginus didelis su kitomis vietomis Stomoxys calcitrans musių gausumas,
rekomenduotina nelaikyti galvijų vienoje patalpoje su kiaulėmis, nes tokiu būdu šie
vabzdžiai gali lengviau patekti į kiaulių laikymo vietas.
SUDERINTA: (Tyrimų priežiūros komisijos pirmininkas)
(Vardas, Pavardė)
(Data)
17
1 PRIEDAS
1 pav. NZI gaudyklė kiaulių komplekso teritorijoje Poškaičiuose, Nemenčinės sen., Vilniaus raj.
2 pav. Stomoxys calcitrans – musė kandiklė. Musės ilgis 5,5 – 7,2 mm, straublys ilgas,
čiuopikliai trumpi.
18
3 pav. Lervų, surinktų nuo kritusio šerno, auginimo schema.
4 pav. NZI gaudyklė ir izoliuotas kritęs šernas.
5 lervos qPGR
25 lervų šerno 10 lervų nuplaunama, auginama iki lėliukės (po 5 lervas į 2 ind.)
5 suaugėliai PGR
5 lėliukės PGR
10 lervų neplaunama, auginama iki lėliukės (po 5 lervas į 2 ind.)
5 suaugėliai PGR
5 lėliukės PGR
~ 1 savaitė ~ 2 savaitės
19
5 pav. AKM viruso paieška skirtingos vystymosi stadijos musėse.
1 lentelė. NZI gaudyklėse sugauti Stomoxys calcitrans, Hybomitra, Haematopota,
Calliphoridae ir Culicidae vabzdžių sezoniniai duomenys.
Mėnuo Stomoxys calcitrans diena Poškaičiai diena Sirvydai diena Ilgakiemis diena Ąžuolų Būda
Gegužė 20 23 27 1 30
Birželis 1 7 13 6 10 14 1 13 17 21 1 19 25 1 28 3 28
Liepa 8 2 5 9 15 1 12 11 22 19 29 2 26 2 31 31 46
Rugpjūtis 5 2 2 7 30 12 9 1 14 14 26 19 16 3 21 11 26 27 10 22 28 16
Rugsėjis 9 1 2 14 4 13 9 11 11 10 16 7 18 67 23 25 36 27
Spalis 4 1 2 18 9 7
VISO 8 78 0 280 366
Mėnuo Haematopota (Tabanidae) diena Poškaičiai diena Sirvydai diena Ilgakiemis diena Ąžuolų Būda
Gegužė 20 23 27 1 30
Birželis 1 7 4 6 10 14 2 13 1 17 21 1 19
20
25 28 3 28 4 Liepa 8 5 2
15 12 11 5 22 1 19 29 1 26 5 31 4 31
Rugpjūtis 5 1 2 3 7 12 9 1 14 1 14 19 16 2 21 1 26 27 2 22 28
Rugsėjis 9 2 4 9 11 16 18 23 25 27
Spalis 4 2 9
VISO 4 25 15 1 45
Mėnuo Hybomitra (Tabanidae) diena Poškaičiai diena Sirvydai diena Ilgakiemis diena Ąžuolų Būda
Gegužė 20 23 6 27 30 1
Birželis 1 7 34 6 20 10 14 31 13 39 17 2 21 108 19 96 25 28 204 28 131
Liepa 8 5 170 15 12 11 12 22 3 19 8 29 26 97 31 3 31
Rugpjūtis 5 2 22 7 12 9 14 14 14 19 16 3 21 26 27 8 22 28
Rugsėjis 9 2 4 9 11 16 18 23 25 27
Spalis 4 2 9
VISO 5 699 308 1012
Mėnuo Calliphoridae diena Poškaičiai diena Sirvydai diena Ilgakiemis diena Ąžuolų Būda
Gegužė 20 1 23 37 27 4 30 5
Birželis 1 1 7 6 74 10 2 14 13 11 17 12 21 19 8 25 28 28 14
Liepa 8 5 15 12 11 7 22 19 29 26 31 7 31
Rugpjūtis 5 2 7
21
12 9 14 4 14 19 16 21 3 26 27 33 22 2 28 2
Rugsėjis 9 6 2 17 4 1 9 8 11 1 16 4 18 23 25 1 27
Spalis 4 2 9
VISO 26 62 169 8 265
Mėnuo Culicidae diena Poškaičiai diena Sirvydai diena Ilgakiemis diena Ąžuolų Būda
Gegužė 20 23 5 27 30
Birželis 1 7 1 6 5 10 14 13 4 17 21 1 19 1 25 28 1 28 3
Liepa 8 5 15 12 11 1 22 1 19 6 29 26 2 31 31
Rugpjūtis 5 6 2 1 7 12 2 9 14 1 14 19 16 3 21 26 27 6 22 2 28
Rugsėjis 9 1 2 1 4 9 11 1 16 18 2 23 25 27
Spalis 4 2 1 9
VISO 10 22 22 4 58