MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL: EMPLEO DE MICROORGANISMOS COMO UNIDADES DE PRODUCCIÓN, DE CONTROL O DE DIAGNOSTICO

VENTAJAS DE LOS MICROORGANISMOS COMO UNIDADES DE PRODUCCIÓN

• Rapido crecimiento debido a la favorable relación área/ volumen

• Diversidad metabólica

• Estabilidad genetica

• Crecimiento en gran escala y separacion facil de productos y sustratos

* Adaptabilidad a distintos ambientes y condiciones de crecimiento (sustratos sólidos, líquidos, frascos, fermentadores)

Incrementar la productividad

* Facilidad de manipulación genética

Modificar los productos finales

* Habilidad para sintetizar enantiómeros específicos.

* Tecnologias limpias

Los microorganismos pueden emplearse como :

• Productores de metabolitos primarios y secundarios

• Productores de biomasa y sus constituyentes (Proteínas y aminoacidos,

Vitaminas, Acidos Nucleicos, Polímeros de H de C y esteres, Biomasa)

• Huespedes para la expresion de genes homologos y heterologos

• Unidades de Biotransformacion

METABOLITOS PRIMARIOS

1- Componentes esenciales y productos formados por los microorganismos: proteinas, acidos nucleicos, polisacaridos (dextranos, alginatos, gelanos, xantanos) y poliesteres (PHB y plasticos), acidos grasos (saturados e insaturados), esteroles (ergosterol)

2- Derivados del metabolismo intermedio: azucares (fructosa, ribosa, sorbosa), ácidos organicos (gluconico, ácido láctico, cítrico, acetico, propionico, succinico, fumarico), alcoholes (xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminoacidos (Lys, Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (carotenos, B2, B12), nucleotidos saborizantes (acidos inocinico y guanilico), polisacaridos y poliesteres de reserva.

Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos.

Etanol Producido por :

1- Levaduras

* Saccharomyces (a partir de hexosas)

* Kluyveromyces fragilis (a partir de lactosa)

* Cándida o Pichia (a partir de pentosas)

2- Bacterias-

* Clostridium (a partir de celulosa) (termófilos, anaerobios)

* Zymomonas

3- Recombinantes-

E.coli recombinante: Introducción de los genes Alcohol deshidrogenasa y piruvato decarboxilasa de Zymomonas.

Pir acetaldehido etanol

AminoácidosPrincipales productores:

Bacterias de los géneros Corynebacterium y Brevibacterium

* Mutantes auxotrofas y regulatorias

* Mutantes alteradas en la secrecion

* Cepas recombinantes

Principales productos:

Acido glutámico 600,000 Toneladas/ año

U$S 915 milliones

Lisina U$S 500 milliones

Fenilalanina U$S 200 millones

Aspartato U$S 43 milliones

VitaminasVitamina B12-

Microorganismos productores: Bacterias de los generos Propionibacterium shermani y Pseudomonas denitrificans.

Producción: 150 mg/ L.

Biotina-

Microorganismo productor: cepas modificadas (mutantes) de Serratia marcescens.Producción: 150-600 mg/ L.

Vitamina B2 (Riboflavina)-

Microorganismos productores: -hongos (Eremothecium ashby y Ashbya gossypii)

Candida sp

Bacillus subtilis recombinante Producción: 20 -30 g/ L

PRODUCCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS

• Los metabolitos secundarios funcionan en los organismos que los producen como:

Reguladores del crecimientoIonoforosDefensa frente a otros microorganismos

(antibióticos, toxinas, pesticidas)Agentes de simbiosis Efectores de diferenciaciónRespuesta a Stress

ANTIBIOTICOS

Desde 1940 se han introducido una gran variedad de moléculas con actividad antibiótico para su uso en medicina y agricultura.

•En el mercado hay 160 antibióticos en uso por un valor de 23,000 millones de U$S.

•Se han descripto 6,000 antibióticos de los cuales 4,000 se han aislado de Actinomycetes, y se describen alrededor de 500 antibióticos nuevos por año. Una sola cepa de Streptomyces hygroscopicus produce aproximadamente 200 antibióticos.

•Muchos nuevos antibioticos se obtienen por semi-sintesis, es decir, por modificacion de antibioticos existentes

INHIBIDORES ENZIMATICOS

•Ej. Estatinas y acido zaragozico

•Inhibidores competitivos de la HMGCo A reductasa y escualeno ciclasa, por lo cual se emplean como anti- colesterolemicos.

• Microorganismo productor: Aspergillus terreus (hongos)

•Ej. Acido clavulanico (inhibe penicilasas)

•Ej. Acarbosa: Inhibidor de la glucosidasa intestinal. Disminuye la hiperglucemia y también la síntesis de triglicérido en los tejidos adiposos, el hígado y las paredes intestinales de individuos obesos, diabéticos o con trastornos de la lipemia.

•Microorganismo productor: Actinoplanes (actinomycetes)

BIOPESTICIDAS

Se aislaron en un principio como agentes antibióticos y luego, en las sucesivas investigaciones, surgieron nuevos usos o usos mas específicos.

Fungicidas: kasugamycin, polyoxins, anfotericina Insecticidas: toxina de Bacillus thuringiensisHerbicidas: bialaphos antihelminticos: avermectinasReguladores del crecimiento de plantas: giberellinasInmunosupresores: ciclosporinasAgentes antitumorales: mitomycin, bleomycin Antivirales: inhibidores de la transcriptasa reversa y de la proteasa de HIV (ritonavir, nevirapine, etc)

EMPLEO DE LOS MICROORGANISMOS COMO VECTORES DE GENES HETEROLOGOS

Los principales huespedes que se emplean para la produccion de proteinas recombinantes son E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polimorpha y Aspergillus niger.

Quimosina recombinante (Clonado del gen de la quimosina bovina en una levadura). Se emplea para la coagulacion de la caseina, en la obtencion de quesos.

Insulina humana (en E.coli) Hormona de crecimiento humana (en E.coli y

levaduras) Vacuna Hepatitis (en levaduras ) Farmacos (interferon 2 alfa)

EMPLEO DE PLANTAS TRANSGENICAS CON GENES BACTERIANOS CLONADOS (bt)

•MAIZ Y ALGODON “BT”

Uso de Microorganismos en biotransformaciones

Reacciones Quimicas realizadas por microorganismos:

Oxidaciones

* Hidroxilacion : introduccion de grupos HO con regio y estereo especificidad. Ej obtencion de esteroides

Produccion de 11OH derivados y eliminacion de cadena lateral (cortisol, prednisolona, testosterona, etc)

* Epoxidaciones

* Desaturaciones

* Rupturas oxidativa de anillos

Reducciones

Reacciones hidroliticas

Condensaciones

Resolution of b-amino acid esters using P. cepacia lipase.

Resolution of pipecolic acid by oxidation with D-amino acid oxidase and recycling of the achiral oxidation product.

Overexpression in E.coli

Ingenieria metabolica: ruta artificial para la

obtencion de hidrocortisona en levaduras Artificial pathway for the

biosynthesis of the hydrocortisone as rebuilt in yeast

• The enzymes in red come from human, bovine and plant organisms and their genes were engineered before introduction in yeast cells.

• Those in blue are original yeast enzymes whose genes were modified to change their expression levels.

• The green pathway is the main pathway for hydrocortisone production, the red one corresponds to controlled side reactions and the yellow one to secondary biosynthesis pathway coexisting with the major green one.

PRINCIPALES ETAPAS DE UN PROCESO DE PRODUCCION

• Búsqueda y selección de microorganismos (“Screening”) Organismos mesofilos Organismos extremofilos

SI BIEN LOS MICROORGANISMOS SON BUENOS PORDUCTORES DE UNA GRAN VARIEDAD DE COMPUESTOS, LOS PRODUCEN EN BAJA CANTIDAD, POR LO QUE SE REQUIERE :

Aumentar los rendimientos mediante:• Obtención de mutantes (tecnicas de mutagénesis, recombinación genética, fusión

de protoplastos)

• Empleo de tecnología de DNA recombinante (para aumento del dosaje genético de enzimas claves, utilización de nuevos sustratos, etc).

• Diseño y selección de medios de cultivo que maximicen la produccion, disminuyan los costos o faciliten la recuperacion de productos.

Diseño y selección de las condiciones y sistemas de cultivo mas convenientes

PRINCIPALES PRODUCTOS

300,00030,00020001000

Corynebacterium glutamicumBrevibacterium flavumCorynebacterium glutamicumBrevibacterium flavum

AminoacidosAcido glutamicoLisinaFenilalaninaarginina

250,00050,00050,000

Aspergillus nigerAspergillus nigerLactobacillus delbrueckii

Acidos organicosAcido citricoAcido gluconicoAcido lactico

500,00050,000

Levaduras y bacterias lacticasCandida utilis

BiomasaStarters para alimentosProteina unicelular

20 millones2000

Saccharomyces cerevisiaeClostridium acetobutylicum

SolventesEtanolAcetona/butanol

PRODUCCION(Ton/año)

ORGANISMOPRODUCTO

< 0.1Corynebacterium diphteriaeClostridium tetaniBordetella pertussisVirus atenuado crecido en riñon de mono o celulas diploides humanasIdem anteriorAntigenos de superficie expresados en levadura

VacunasDifteriaTetanosPertussisPolio RubéolaHepatitis B 

5Claviceps paspaliAlcaloides del ergot

10Propionibacterium shermaniiEremothecium ashbyii

VitaminasB12Riboflavina

6005005005001005050

Bacillus sppBacillus amyloliquefasciensAspergillus nigerBacillus coagulansAspergillus nigerMucor o levaduras recombinantes

EnzimasProteasasAlfa-AmilasasGlucoa-amilasaGlucosa isomerasaPectinasaReninaotras

PRODUCCION(Ton/año)

ORGANISMOPRODUCTO

< 0.1Bacillus thuringiensisInsecticidasEsporas bacterianas

80,00015,00015,00010,0002,0001,000

Penicillum chrysogenumCephalosporium acremoniumStreptomyces aureofaciensStreptomyces erythreusBacillus brevisStreptomyces griseusPenicillum griseofulvum

AntibioticosPenicilinasCefalosporinasTetraciclinasMacrolidos (eritromicina)Polipeptidicos (gramicidina)Aminoglicosidos (estreptomicina)Aromáticos (griseofulvina)

< 0..01 Celulas de hibridomaAnticuerpos monoclonales

< 0.1E. coli recombinanteE. coli recombinante o celulas de mamífero recombinantecelulas de mamífero recombinantecelulas de mamífero recombinanteE. coli recombinante

Proteinas de uso terapéuticoInsulinaHormona de crecimientoEritropoyetinaFactorVIII-CActivador del plasminogenoInterferon alfa2

< 0.1Lithospermum (plantas)Levaduras

PigmentosShikoninasBeta-carotenos

PRODUCCION(Ton/año)

ORGANISMOPRODUCTO