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Adila Regina Trubat Santos Rodrigues
Orientadora: Dra. Lígia Maria Torres Peçanha
Laboratório de Imunoparasitologia
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes
Estudo da resposta de linfócitos B murinos induzida por polissacarídeos de formas MAT alfa e MAT a
de Cryptococcus neoformans.
Universidade do Brasil -UFRJ
Cryptococccus neoformans
• Animais
Phascolarctos cinereus Tursiops truncatusColumba livia
• Ambiental - árvores e solo
Eucalyptus calmulidensis Araucaria augustifolia
Patógeno oportunista
•Infecção por inalação de esporos ou leveduras
•Meningoencefalite
•Lesões de pele
Anfotericina B e fluconazol
Fatores de virulência
NENHUMA INTERVENÇÃO TERAPÊUTICA BASEADA NA INTERFERÊNCIA DOS FATORES DE VIRULÊNCIA FOI ATÉ
AGORA DESCRITA
Produção de cápsula
Prototrofia - fenoloxidase e produção de melanina
Conjugação
Produção de cápsula
Composição da cápsula
GXM é o componente em maior abundância na cápsula, compreende um polímero de aproximadamente 1 milhão de daltons
e é composto por um esqueleto de manose, com substituições de ácido glucorônico e xilose
A galactoxilomanana é um polímero que consiste em um esqueleto de galactose com cadeias laterais trímeras de galactose e manose. Cada cadeia lateral da GalXM
sustenta entre um e três resíduos de xilose
Composição da cápsula
Composição da cápsula
Manoproteína – xilose, galactose e manose
Atividades Imunobiológicas
Glucoronoxilomanana (GXM)
•Antifagocítica - Anti opsonizante
•Cápsula aumenta a produção de IL 10
•Decréscimo da expressão de MHC II e B7
•Aumento da produção de óxido nítrico na presença de Ac
•Ativa complemento
•Suprime Ac
•Produção de TNF alfa (GalXM)
Atividades Imunobiológicas
Manoproteína
•Induz TNF por macrófagos
•Induz IL 12
•Induz IFNγ
•Componente protetor
Cryptococccus neoformans
Cryptococccus neoformans
Cryptococccus neoformans
Cryptococccus neoformans
Cryptococccus neoformans
Cryptococccus neoformans
Cryptococccus neoformans
Cryptococccus neoformans
Cryptococccus neoformans
Kuong-Chung et al, Mycology, 1992, 60:602-605
Mat α é mais virulento que Mat a
Imunidade ao fungo
Imunidade ao fungo
Th1 X Th2
•Liga C3 nos não encapsulados
•Presença de IgG e IgM em níveis normais não são suficientes para iniciar ativação
•Importante na opsonização
Complemento
Papel Protetor dos Anticorpos
Administração de mAbs para cápsula prolonga a sobrevivência:
•Eficiência de isotipos:
•IgG2a>IgG1>IgM
•IgA>IgG2b>>IgG3
•IgG3 não protetor ou potencia a doença;
•Mudança de IgG3 para IgG1 confere proteção
Células B
Linhagens de camundongos que montam respostas de anticorpos mais intensas são mais resistentes à infecção
com C. neoformans
Linhagens de camundongos deficientes de células B (como a CBA/N) são mais susceptíveis à infecção com o fungo.
Neuville et al. 2000; 68: 3724-3726.
Dromer et al. Immunogenetics 1988; 28: 417-424.
Marquis et al. Infect Immun. 1985. 47(1):288-93
Objetivos
•Verificar o efeito imunomodulador de polissacarídeos sobre a resposta de linfócitos B in vivo e in vitro.
•Caracterizar a resposta in vivo induzida por polissacarídeos purificados de C. neoformans em relação aos isotipos induzidos e a seu efeito imunizante e protetor.
•Comparar da resposta induzida in vivo por polissacarídeos isolados de amostras MAT alfa e MAT a.
Metodologia
e
Resultados
Metodologia
B-3501 - WT, tipo conjugativo alfa (MAT alfa )
C.neoformans var. neoformans - sorotipo D
B-3502 - WT, tipo conjugativo a (MAT a)
Os fungos
Kuong-Chung et al, Mycology, 1992, 60:602-605
Os animais
BALB/c - Th1C57Bl/6 - Th2
Metodologia
ELISA paraavaliação da
produção de IgM
Medida da proliferação de linfócitos B por incorporação
de timidina
Linfócitos B em cultura estimulados ou não com polissacarídeos de C. neoformans MAT a e MAT alfa , LPS e anti-IgD-Dextrana
Isolamento de linfócitos B de baços de camundongos normais
C57Bl/6 e BALB/c
0 1 10 0 1 100
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
LPSMeio
Dose do conjugado 3501 (Mat alfa)0 1 10 0 1 10
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
DEXMeio
Dose do conjugado 3501 (Mat alfa)
0 1 10 0 1 100
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
LPS
Meio
Dose do conjugado 3502 (Mat a)0 1 10 0 1 10
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
DEX
Meio
Dose do conjugado 3502 (Mat a)
Inco
rpo
raçã
o d
e T
imid
ina
Trit
iad
a (c
pm)
Medida da proliferação de linfócitos B por incorporação de timidina
BALB/c
0 10 1 1 10 10
5000
10000
15000
20000
25000
LPS
Meio
Dose polissacarídeo 3501 (Mat alfa)0 10 1 0 10 1
0
5000
10000
15000
20000
25000
DEX
Meio
Dose do polissacarídeo 3501 (Mat alfa)
0 10 1 0 10 10
5000
10000
15000
20000
25000
LPS
Meio
Dose do polissacarídeo 3502 (Mat a)0 10 1 0 10 1
0
5000
10000
15000
20000
25000
DEX
Meio
Dose do polissacarídeo 3502 (Mat a)
Inco
rpor
ação
de
Tim
idin
a Tr
itiad
a (c
pm)
Medida da proliferação de linfócitos B em cultura por incorporação de timidina
C57Bl/6
0 1 10 0 1 100
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
LPSMeio
Dose do Conjugado 3501(Mat alfa)
0 1 10 0 1 100
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
LPSMeio
Dose do Conjugado 3502(Mat a)
0 1 10 0 1 100
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
DEXMeio
Dose do Conjugado 3501(Mat alfa)
0 1 10 0 1 100
10002000
3000400050006000
70008000
900010000
1100012000
130001400015000
DEXMeio
Dose do Conjugado 3502(Mat a)
Co
ncen
traç
ão d
e Ig
M n
o s
obr
enad
ante
de
cultu
ra (
ng/m
l)
Produção de IgM em sobrenadante de cultura de linfócitos B
BALB/c
0 1 10 0 1 100
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
LPSMeio
Dose do Conjugado 3501(Mat alfa)
0 1 10 0 1 100
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
LPSMeio
Dose do Conjugado 3502(Mat a)
0 1 10 0 1 100
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
DEXMeio
Dose do Conjugado 3501(Mat alfa)
0 1 10 0 1 100
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
14000
15000
DEXMeio
Dose do Conjugado 3502(Mat a)
Co
ncen
traç
ão d
e Ig
M n
o s
obr
enad
ante
de
cultu
ra (
ng/m
l)
Produção de IgM em sobrenadante de cultura de linfócitos B
C57Bl/6
Imunização de camundongos C57Bl/6 e BALB/C com polissacarídeos de C. neoformans de Mat alfa e Mat a (50µg/animal i.p.)
Obtenção de soros
Realização de testes ELISA: cinética de produção de IgM específica para as frações da
cápsula de C. neoformans
Metodologia
Realização de testes ELISA: mapeamento da produção de isotipos de imunoglobulinas específicas para as frações da cápsula de C.
neoformans
14 dias7,14 e 21 dias
3501 3502
BALB/c
C57Bl/6
Cinética de produção de IgM em animais imunizados
8 15 210
20
40
60
80
100
8 15 210
20
40
60
80
100
8 15 210
20
40
60
80
100
8 15 210
20
40
60
80
100
BA
C D
ND
Dias após a imunização
(34)
(9)(19)
(<10)
(<10) (<10) (<10)
(14)
(69)
(19) (18)
Produção de isotipos de imunoglobulinas específicas para as frações de cápsula de C. neoformans
BALB/c
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
imune 01 imune 020
150
300
450
600
750
900
1050
1200
1350
1500
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
700
IgM
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
IgG1
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
IgG2b
imune 01 imune 020
150
300
450
600
750
900
1050
1200
1350
1500
IgG3
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
700
Tít
ulo
sé
rico
de
ant
ico
rpo
s an
ti-p
olis
saca
ríd
eo
A B C D
E F G H
Tipo de Antígeno usado na imunização
(21) (>10) (>10) (>10) (>10) (>10) (>10)
(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)
(41)
Produção de isotipos de imunoglobulinas específicas para as frações de cápsula de C. neoformans
C57Bl/6IgM
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
IgG1
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
IgG2b
imune 01 imune 020
150
300
450
600
750
900
1050
1200
1350
1500
IgG3
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
700
IgG2a
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
Títu
los
séric
os d
e an
ticor
pos
anti-
polis
saca
ríde
o
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
700
imune 01 imune 020
150
300
450
600
750
900
1050
1200
1350
1500F
A B C D E
JIHG
Tipo de Antígeno usado na imunização
ND
ND
ND
ND
(>10) (>10)(>10)
(39) (50) (31) (34) (16) (13) (11) (<10)
(100) (54)(32) (20) (>10)
Infecção de camundongos C57BL/6 e BALB/C com C. neoformans MAT alfa e MAT a (1x105 leveduras/animal i.v.)
Avaliação da carga fúngica por unidades formadoras de colônias nos pulmões, baço
cérebro e sangue.
Avaliação de isotipos de
imunoglobulinas
Metodologia
Perfil de infecção com cepas 3501 (MAT alfa) ou 3502 (MAT a) de C. neoformans – BALB/c
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Nú
mer
o d
e C
olô
nia
s
A B
C
D
(0)(10,7) (7,2) (0,25) (7,7) (0) (0) (0)
(1,7) (23,2) (0) (0) (1,0) (0,25) (0) (0)
D
C D
A B
(0)(2,3)(0,4)(0,6)
(0)(2,2)(0,7)(23,7)(220,8) (3,2) (10,5) (0)
(1814)
(46,9) (2,4) (0)
Perfil de infecção com cepas 3501 (MAT alfa) ou 3502 (MAT a) de C. neoformans – C57Bl/6
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
1000
2000
3000
4000
5000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
1000
2000
3000
4000
5000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
1000
2000
3000
4000
5000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
1000
2000
3000
4000
5000
Núm
ero
de
Co
lôni
as
infect alfa infect a0
50
100
150
200
250
300
350
infect alfa infect a0
100
200
300
400
500
600
infect alfa infect a0
100
200
300
400
500
600
700
infect alfa infect a0
150
300
450
600
750
900
1050
1200
1350
1500
IgM
infect alfa infect a0
50
100
150
200
250
300
350
IgG1
infect alfa infect a0
100
200
300
400
500
600
IgG2b
infect alfa infect a0
150
300
450
600
750
900
1050
1200
1350
1500
IgG3
infect alfa infect a0
100
200
300
400
500
600
700
Títu
los
séri
cos
de
antic
orpo
s an
ti-po
lissa
carí
deo
A B C D
E F G H
Tipo de forma conjugativa do fungo usada na infecção
(>10)
(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)
(>10) (>10) (>10) (>10)
(27)
(40) (34)
(50)
(17)
Produção de imunoglobulinas em animais infectados – BALB/c
A B C D E
F G H I J
IgM
infect alfa infect a0
50
100
150
200
250
300
350
IgG1
infect alfa infect a0
100
200
300
400
500
600
IgG2b
infect alfa infect a0
150
300
450
600
750
900
1050
1200
1350
1500
IgG3
infect alfa infect a0
100
200
300
400
500
600
700
IgG2a
infect alfa infect a0
50
100
150
200
250
300
Títu
los
séri
cos
de a
ntic
orpo
s an
ti-po
lissa
carí
deo
infect alfa infect a0
50
100
150
200
250
300
350
infect alfa infect a0
100
200
300
400
500
600
infect alfa infect a0
50
100
150
200
250
300
infect alfa infect a0
150
300
450
600
750
infect alfa infect a0
150
300
450
600
750
900
1050
1200
1350
1500
Tipo de forma conjugativa do fungo usada na infecção
(37) (>10) (>10) (>10)
(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)
(61) (24) (24) (50) (39) (75)
(48) (14) (21) (18)
Produção de imunoglobulinas em animais infectados – C57Bl/6
Imunização de camundongos C57/B6 e BALB/C com polissacarídeos de C. neoformans de Mat alfa e Mat a (50µg/animal i.p.)
Desafio com C. neoformans Mat alfa e Mat a (105 leveduras i. v.)
Avaliação da carga fúngica por unidades formadoras de colônias nos
pulmões, baço e cérebro.
Avaliação de isotipos de imunoglobulinas
Metodologia
15 dias
21 dias
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Núm
ero
de
Co
lôni
as
CBA
FED
(0)(0)(3,3)(6,3)
(0) (0) (0) (0)
(0) (0) (0)(1)(0)(0)(23,5)(1,7)
(0)(0)(0,6)(1) (0,6)(0)(0)(0,25)(1)
Carga fúngica em camundongos BALB/c imunizados com polissacarídeos e posteriormente infectados
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
1000
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3000
4000
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7000
8000
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10000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
1000
2000
3000
4000
5000
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8000
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10000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Cérebro Pulmão Baço Sangue0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000Núm
ero
de
Co
lôni
as
CBA
FED
(0)
(0) (0) (0) (0) (0)
(0)(0)(0)(0)(0) (0,5)(0,5)(0,4) (2,3)(0)
(1808)
(46,9) (2,4) (0) (371,3) (121,7) (7,3)
(3,5)
Carga fúngica em camundongos C57Bl/6 imunizados com polissacarídeos e posteriormente infectados
Produção de isotipos de imunoglobulinas em animais imunizados e posteriormente infectados
com C. neoformans
BALB/c
IgM
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
IgG1
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
IgG2b
imune 01 imune 020
1503004506007509001050120013501500
IgG2b
IgG3
imune 01 imune 020
100200300400500600700
IgG3
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
imune 01 imune 020
100200300400500600700
imune 01 imune 020
1503004506007509001050120013501500
Título
s sé
ricos
de a
ntic
orp
os
anti-
polis
sacarí
deo
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
imune 01 imune 020
1503004506007509001050120013501500
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
700
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
imune 01 imune 020
100200300400500600700
imune 01 imune 020
1503004506007509001050120013501500
Tipo de antígeno usado na imunização
BA C D
HGFE
I J K L
PONM
(>10)
(15) (14) (>10) (>10) (>10) (>10) (27) (>10)
(23) (>10) (>10) (45) (102)
(359)
(54)
(>10)(20) (>10) (>10) (>10) (>10) (66) (>10)
(10)(>10) (>10) (>10) (14) (25) (282) (70)
Produção de isotipos de imunoglobulinas em animais imunizados e posteriormente infectados
com C. neoformans
C57Bl/6
IgM
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
IgG1
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
IgG2b
imune 01 imune 020
150300450600750900
1050120013501500
IgG3
imune 01 imune 020
100200300400500600700
IgG2a
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
imune 01 imune 020
100
200300400
500600
700
imune 01 imune 020
150300450600750900
1050120013501500
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
imune 01 imune 020
150300450600750900
1050120013501500
imune 01 imune 020
100200
300400500
600700
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
Títu
los
séri
cos
de a
ntic
orpo
s an
ti-po
lissa
carí
deos
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
350
imune 01 imune 020
100
200
300
400
500
600
imune 01 imune 020
50
100
150
200
250
300
imune 01 imune 020
100200300400500600700
imune 01 imune 020
150300450600750900
1050120013501500
F JG H I
A EB C D
KOL M N
P TQ R S
Tipo de antígeno usado na imunização
(79)(171)(72)(532)(56)
(111)(167)(104)
(93)
(101)
(<10)(40)(16)(21)(10)
(37)
(26)(14)(50)(58)
(<10)(<10)(59)(<10)(51)(19) (<10)(86) (<10)(<10)
(46)(<10)(46)(<10)(17)(<10)(<10)(<10)(35)(26)
Perfil de tamanho e granulosidade – 10 dias de infecção
( x = 1,51)
( x = 3,36)
( x = 2,58)
Perfil de tamanho e granulosidade – 17 dias de infecção
( x = 0,96)
( x = 1,74)
( x = 0,73)
CONCLUSÕES
Proliferação de Linfócitos B em Cultura
• Os polissacarídeos de cápsula não induzem isoladamente a proliferação de células B de camundongos BALB/c e C57BL/6;
• Os polissacarídeos aumentam a resposta proliferativa de células de camundongos BALB/c induzida por LPS, mas não por anti-IgD-Dextrana.
Produção de IgM em Cultura
• Os polissacarídeos parecem potenciar a produção de IgM em C57Bl/6 estimulados por LPS. Efeito semelhante ocorre em BALB/c, porém em menor magnitude.
Cinética da produção de IgM Sérica na imunização
• Animais BALB/c imunizados apresentam uma cinética de produção de IgM mais lenta ao 3501, e não respondem ao 3502;
• Animais C57BL/B6 imunizados com polissacarídeos de 3501 ou 3502 têm uma resposta mais rápida para o polissacarídeo de 3502
Isotipos de imunoglobulinas séricas na imunização
• C57BL/B6 imunizados respondem mais fortemente que BALB/c aos polissacarídeos de 3501 e 3502 (IgM, IgG2a e IgG2b);
Perfil de infecção
• BALB/c tem maior resistência à infecção tanto para as formas MAT alfa, quanto para as formas MAT a;
• C57Bl/6 infectados com MAT alfa apresentam infecção maciça do tecido cerebral.
Isotipos de imunoglobulinas séricas na infecção
• BALB/c praticamente não produzem anticorpos reativos contra as cepas 3501 e 3502;
• C57Bl/6 produzem títulos baixos de anticorpos contra 3501
Isotipos de imunoglobulinas séricas na imunização e posterior infecção
• BALB/c produzem resposta muito baixa, sendo detectável IgG3 contra 3501 (imunização e infecção)
• C57Bl/6 produzem títulos mais altos, principalmente contra 3501, independente do polissacarídeo da imunização prévia.
Perfil de granulosidade e tamanho de células esplênicas
• Foi detectado no baço de animais infectados com a forma MAT alfa o aparecimento de uma população de alta granulosidade.
Não parece haver correlação entre a resistência de BALB/c e a produção de anticorpos
O aumento da resistência de C57Bl/6 ocorre paralelamente a uma maior produção de
anticorpos