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Construcción de un biosensor amperométrico de glucosa. Cuantificación de glucosa en un jarabe.
Daniel Martín Yerga
Resumen
En este trabajo se presenta un sensor amperométrico para la determinación de glucosa en una muestra de jarabe. El sensor se preparó utilizando pasta de carbono, ferricinio y las enzimas GOD y HRP. Se estudió mediante voltamperometría cíclica el sistema ferroceno/ferricinio. Se realizaron dos sensores, comparándolos, y obteniendo los parámetros de Michaelis-Menten para el sistema enzimático. El rango lineal para los sensores fueron de 2x10¯4-1x10¯3M y 5x10¯5-1x10¯3M, respectivamente.La determinación de la glucosa se realizó mediante el método de las adiciones estándar.
1. Introducción
La glucosa es un componente muy importante en la salud humana ya que es la fuente principal de enegía de las células. Es de tanta importancia ya que la deficiencia o un aumento de los niveles de glucosa en la sangre son síntomas de enfermedades como la hipoglucemia o la diabetes mellitus, respectivamente.
Por lo que el análisis de glucosa es muy frecuente en laboratorios químicos y, especialmente, en laboratorios clínicos.
En la bibliografía se han descrito numerosos métodos para la determinación de glucosa.Algunos de estos métodos estan basados en la construcción de diversos sensores amperométricos.Se ha utilizado un electrodo de pasta de carbono con GOD y un sistema electroquímico basado en el dimetilferroceno, para determinar la glucosa en sangre o plasma.
Se ha estudiado en un electrodo similar el efecto que tiene la especie ferrocénica utilizada, ya sea ésta ferroceno, pentilferroceno y 1,1-dimetilferroceno.
La HRP ha sido utilizada para la determinación de anilina utilizando un electrodo de pasta de carbono en un sistema FIA.
Este trabajo describe el desarrollo de un sensor amperométrico utilizando un sistema bienzimático para la determinación de glucosa en un medio acuoso.
Se ha utilizado para ello la siguientes reacciones enzimáticas:
Glucosa + O2 GOD gluconolactona + H2O2
H2O2 + Ferroceno HRP H2O + ferricinio
Para obtener la concentración de glucosa fue reducido el ferricinio electroquímicamente y la corriente de reducción obtenida es directamente proporcional a la concentración de glucosa en la muestra.
2.Experimental
2.1. Reactivos
Se realizó una disolución buffer de fosfato utilizando ácido fosfórico 0.1M llevada a pH 7.5 con hidróxido de sodio.Esta disolución fue utilizada como medio de la celda electroquímica al realizar los ensayos.
Para la realización del calibrado de la glucosa se utilizaron disoluciones estándar creadas a partir de glucosa sólida y llevadas a volumen con agua destilada.
2.2. Preparación de los electrodos de trabajo
Para el estudio del proceso del ferroceno/ferricinio se crearon in situ electrodos a partir de pasta de carbono y ferroceno sólido utilizando como base un tubo cilíndrico de teflón con un contacto metálico.La pasta de carbono fue formada con polvo de grafito y parafina.Uno de los electrodos tenía una membrana de nafión 0.5% (1:1 en isopropanol) mientras que el otro fue utilizado sin membrana.
Para la realización de la determinación de glucosa y su calibrado previo, se creó un sensor electródico con la misma pasta de carbono que los anteriores (276mg pasta de carbono con 9mg ferroceno), pero añadiendo esta vez dos enzimas como la glucosa oxidasa (15mg) y la peroxidasa del rábano silvestre (15mg). Este sensor estaba provisto de membrana de nafión.
2.3. Instrumentación
Se utilizó como electrodo de referencia en los ensayos un electrodo de plata/cloruro de plata; mientras que como electrodo auxiliar se utilizó un electrodo de platino.
El sistema de electrodos estaba conectado a un potenciostato μAutolab, que a su vez estaba controlado por un ordenador y el programa GPES.
Se utilizó una celda electroquímica de 20 ml.
2.4. Preparación de la muestra
La muestras de medida fueron preparadas a partir de una dilución del jarabe de glucosa en agua destilada.
2.5. Procedimiento
• Estudio del proceso del ferroceno/ferricinio
El proceso electroquímico del ferroceno/ferricinio fue estudiado mediante un ensayo de voltamperometría cíclica.
Fue observado como se comportaba este proceso según se variaba la velocidad de barrido de la voltamperometría.Se observó también el efecto de la agitación en las medidas obtenidas, y el efecto en el proceso que provocaba la membrana de nafión en el electrodo.
Estos estudios se llevaron a cabo con los siguientes parámetros para la voltamperometría cíclica:
E inicial = -200 mV E final = 800 mV
• Calibrado con el sensor
Se obtuvo un calibrado para la glucosa utilizando el sensor amperométrico.Para realizar este calibrado se utilizó una cronoamperometría, midiendo las corrientes de reducción del ferricinio, según se añadían concentraciones crecientes de glucosa a la celda de medida.Se fueron añadiendo las siguientes concentraciones crecientes de glucosa: 5x10-5, 7x10-5, 1x10-4, 2x10-4, 5x10-4, 7x10-4
y 1x10-5 M.
Previamente al calibrado se obtuvo el voltamperograma cíclico del sensor, para determinar el potencial adecuado a utilizar para la reducción del ferricinio.
El calibrado fue obtenido por partida doble con electrodos diferentes.
• Adiciones estandar para la determinación de la glucosa en la muestra
Para la determinación de la muestra fue usado un método de adiciones estándar, donde se iba midiendo la corriente de reducción del ferricinio, según se añadían concentraciones crecientes y definidas de glucosa a la disolución de medida de la muestra.
3. Resultados y discusión
• estudio del proceso ferroceno/ferricinio
sin membranacon agitación
Los datos que se obtuvieron para el electrodo de trabajo sin membrana, con agitación en la celda fueron los siguientes:
vel barrido (mV/s)
ip (uA) Ep (V)
10 17.32 0.334
25 17.47 0.334
50 20.00 0.347
75 21.33 0.365
100 23.81 0.368
1000 53.45 0.531
Como se puede observar en los datos obtenidos, la corriente del pico de oxidación obtenida fue aumentando según se aumentaba la velocidad de barrido.No se obtuvo un pico de reducción por las razones explicadas posteriormente.
El voltamperograma cíclico obtenido para la velocidad de barrido de 100 mV/s fue:
Mientras que el correspondiente para una velocidad de barrido de 1.5 V/s fue:
Hay varias diferencias entre los dos voltamperogramas. La más importante es que en el voltamperograma de 100mV/s, no hay pico de reducción (lo mismo ocurrió para velocidades menores), mientras que en el voltamperograma para 1.5V/s, se puede observar un pico hacía 0.15V que corresponde a la reducción del ferricinio.
En el caso de velocidades menores no se observa este pico ya que el ferricinio es soluble en el medio utilizado y se disuelve en la disolución con lo que no da señal de reducción.En el caso de la velocidad de 1.5V/s, al ser la velocidad tan alta, al ferricinio no le da tiempo a extenderse en el seno de la disolución sino que se encuentra todavía en las cercanías del electrodo y produce la señal de reducción.También se puede observar como a esta velocidad el pico de oxidación es más achatado.
-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
-5.00E-06
0.00E+00
5.00E-06
1.00E-05
1.50E-05
2.00E-05
2.50E-05
3.00E-05
sin mebrana - con agitación - 100 mV/s
E (V)
i (A
)
-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1-8E-5
-6E-5
-4E-5
-2E-5
0E+0
2E-5
4E-5
6E-5
8E-5
1E-4sin membrana - con agitación - 1.5 V/s
E (V)
i (A
)
sin membranasin agitación
Los datos obtenidos para un electrodo preparado sin membrana, pero sin agitación en la celda son los siguientes:
vel barrido (mV/s)
ip (uA) Ep (V)
10 f b
29.76-23.90
0.3810.246
25 f b
31.23-31.35
0.3840.236
50 f b
37.13-39.50
0.3780.228
75 f b
41.54-44.10
0.3890.212
100 f b
45.81-48.48
0.3860.220
En este caso se obtuvieron dos picos, uno para la oxidación (forward) y otro para la reducción (backward).Los dos picos siguen el mismo comportamiento según se va aumentando la velocidad de barrido, y es el de aumentar su valor de corriente.Por su parte, el potencial de pico, prácticamente no varía.
El voltamperograma obtenido para 100mV/s fue el siguiente:
Se pueden observar los picos de oxidación y reducción para el sistema feroceno/ferricinio.
con membranacon agitación
Los datos obtenidos para las medidas de voltamperometría cíclica con un electrodo preparado con nafión y con agitación en la celda fueron los siguientes:
vel barrido (mV/s)
ip (uA) Ep (V)
10 f b
- -63.10
-0.171
25 f b
45.63 -101.8
0.3780.145
50 f b
80.62 -129.0
0.4330.127
75 f b
79.91 -148.9
0.4430.119
100 f b
93.95 -172.3
0.4610.109
Prácticamente el comportamiento es similar a los casos que se describieron anteriormente, exceptuando que se obtienen unos picos de valores mucho más grandes.En el voltamperograma para 10 mV/s de velocidad de barrido no se obtuvo un pico de oxidación.
El voltamperograma obtenido para la velocidad de barrido de 100 mV/s fue:
El voltamperograma es más achatado que si en el electrodo no existe la membrana de nafión, pero se pueden observar los dos picos para los procesos de oxidación y de reducción, respectivamente.
-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1-5E-5-4E-5-3E-5-2E-5-1E-50E+01E-52E-53E-54E-55E-5
sin membrana - sin agitación - 100 mV/s
E (V)
i (A
)
-0.50 0.00 0.50 1.00-3E-4
-2E-4
-1E-4
-1E-20
1E-4
2E-4
3E-4con membrana - con agitación - 100 mV/s
E (V)
i (A
)
con membranasin agitación
Por último se observó el comportamiento del voltamperograma cíclico utilizando un electrodo con membrana y agitando la mezcla, obteniendo los siguientes datos:
vel barrido (mV/s)
ip (uA) Ep (V)
10 f b
20.44 -27.13
-0.171
25 f b
24.44 -40.66
0.3780.145
50 f b
35.24 -92.00
0.4330.127
75 f b
33.40 -109.80
0.4430.119
100 f b
35.80 -110.60
0.4610.109
Los voltamperogramas obtenidos fueron más achatados por lo que los datos para las corrientes de pico también fueron menores que en los anteriores casos. De todos modos, el comportamiento fue similar y la corriente de pico aumenta al aumentar la velocidad de agitación.
Se obtuvo el siguiente voltamperograma para la velocidad de 100 mV/s:
El voltamperograma es muy parecido al obtenido con agitación.
Se obtuvo el potencial formal del par ferroceno/ferricinio de 0.306 V. Para ello se utilizaron los datos obtenidos utilizando el electrodo sin membrana y sin agitación.
Se puede decir a partir de estos voltameprogramas que el par ferroceno/ferricinio es un sistema reversible.
• Calibrado con el sensor
Se obtuvo un calibrado para cada uno de los sensores realizados:
Sensor 1
El potencial que se eligió para la reducción de ferricinio en la cronoamperometría fue de -0.15V.
La gráfica obtenida en la cronoamperometría fue la siguiente:
Se pueden observar correctamente las señales que el electrodo obtenía según se iban añadiendo concentraciones crecientes de glucosa.El sensor comenzó a detectar las señales para la concentración de 2x10-4M.
-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1-4E-4
-3E-4
-2E-4
-1E-4
0E+0
1E-4
2E-4
3E-4
4E-4con membrana - sin agtación - 100 mV/s
E (V)
i (A
)
300 500 700 900
-3.5E-6
-3.3E-6
-3.1E-6
-2.9E-6
-2.7E-6
-2.5E-6Cronoamperometría (sensor 1)
t (s)
i (A
)
Se obtuvieron los siguientes datos para la realización del calibrado:
[glucosa] (M) i (nA)
2x10-4 50
5x10-4 360
7x10-4 570
1x10-3 820
Mientras que la gráfica de los datos y la recta de regresión calculada para esos datos fue:
i = 967647.1 - 130.6 [glucosa]r = 0.998
Sensor 2
El potencial que se eligió para la reducción de ferricinio en la cronoamperometría fue de 0V.
La gráfica obtenida en la cronoamperometría fue la siguiente:
Igualmente que en el anterior sensor, este sensor detectó correctamente las señales al ir añadiendo concentraciones crecientes de glucosa.El sensor comenzó a detectar las señales para la primera concentración de 5x10-5M.Desafortunadamente la segunda y tercera medidas fueron incorrectas, ya que accidentalmente cayó una punta de micropipeta en la celda de medida.
Después de extraer la punta de la celda y cuando se volvió a estabilizar las señales, se pudo continuar obteniendo datos válidos.
Se obtuvieron los siguientes datos con este sensor para la realización del calibrado:
[glucosa] (M) i (nA)
5x10-5 140
2x10-4 190
5x10-4 510
7x10-4 690
1x10-3 950
En este caso la gráfica para la recta de calibrado obtenida fue la siguiente:
i = 889690.7 + 60.1 [glucosa]r = 0.996
Comparando los dos sensores, se puede ver que los dos tienen unas pendientes de la recta de calibrado en un rango similar y que los dos poseen una linealidad buena para los datos que se obtuvieron.0 500 1000 1500
-1.7E-6
-1.5E-6
-1.3E-6
-1.1E-6
-9.3E-7
cronoamperometría (sensor 2)
t (s)
i (A
)
0E+0 2E-4 4E-4 6E-4 8E-4 1E-3 1E-3
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Calibrado (sensor 1)
[glucosa] (M)
i (n
A)
0E+0 2E-4 4E-4 6E-4 8E-4 1E-3 1E-3
0100200300400500600700800900
1000
Calibrado (sensor 2)
[glucosa] (M)
i (n
A)
El segundo sensor podría decirse que fue más sensible su comportamiento ya que obtiene señales desde la primera concentración de glucosa añadida, y también por que los valores de intensidad que obtiene son mayores para la misma concentración que los del sensor número uno.
Se obtuvo la gráfica de Michaelis-Menten para este sensor número dos:
Para la cual los datos fueron los siguientes:
1/[glucosa] (M¯¹) 1/i (nA¯¹)
5x10-5 140
2x10-4 190
5x10-4 510
7x10-4 690
1x10-3 950
Con estos datos se obtuvieron los valores para la constante de Michaelis-Menten y el valor de la velocidad máxima del sistema enzimático que fueron de:
vmax = 2.97x10 -7
Km = 5464.9 M-1
• Adiciones estandar
Muestra 1
Se obtuvieron los siguientes datos en la cronoamperometría utilizando el método de las adiciones estándar para la muestra 1:
[glucosa] ad (M) i (nA)
2.5x10-4 86
5.0x10-4 131
7.5x10-4 179
1.0x10-3 213
Con estos datos se obtuvo la siguiente gráfica:
Y fue calculada la concentración de glucosa en la disolución de medida que fue de 2.65x10-4 M.
Muestra 2
De la misma forma para la muestra 2 fueron obtenidos los siguientes datos en la cronoamperometría utilizando el método de las adiciones estándar:
[glucosa] ad (M) i (nA)
2.5x10-4 98
5.0x10-4 139
7.5x10-4 190
1.0x10-3 242
2E-4 4E-4 6E-4 8E-4 1E-3 1E-3
0.0
50.0
100.0
150.0
200.0
250.0
Adiciones estándar (M1)
[glucosa] ad (M)
i (n
A)
0 5000 10000 15000 20000 25000
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
Michealis-Menten
1/[glucosa] (M¯¹)
1/in
ten
sid
ad
(n
A¯
¹)
Con estos datos se obtuvo la siguiente gráfica:
Y fue calculada la concentración de glucosa en la disolución de medida que en este caso fue de 2.45x10-4 M.
Muestra 3
Para la muestra número 3 se obtuvieron los siguientes datos:
[glucosa] ad (M) i (nA)
2.5x10-4 97
5.0x10-4 145
7.5x10-4 186
1.0x10-3 252
Con estos datos se obtuvo la siguiente gráfica:
La concentración obtenida para esta muestra fue de 2.16x10-4 M.
Calculando el valor medio para las muestras medidas se tiene una concentración de 2.4x10-4 ± 0.2x10-4 M.
4. Conclusiones
Se ha desarrollado un método muy barato con preparación del sensor sencilla para la determinación de glucosa.El método es sensible, con una respuesta rápida del sensor a concentraciones tan bajas como 5x10¯5M.Por lo tanto es un método que se debe tener en cuenta a la hora de analizar glucosa en cualquier laboratorio, siempre que no se necesite una gran sensibilidad, por la facilidad de la puesto a punto y su coste.
5. Agradecimientos
Este trabajo no habría sido posible de no haber contado con la ayuda de Livia Suárez y Matías Vega.
Referencias
1) A.E.G. Cass, G.Davis, G.D.Francis, H.A.O.Hill, I.J. Higgins, E.V.PLotkin, L.D.L. Scott, A.P.F.Turner, Anal. Chem., 56 (1984) 667-671
2) P.Dominguez-Sánchez, C.K.O`Sullivan, A.J.Miranda-Ordieres, P.Tuñon-Blanco, M.R.Smyth, Anal.Chim.Acta, 291 (1994) 349-356.
3) J.Wang, L-H.Wu, Z.Lu, R.Li, J.Sánchez, Anal.Chim.Acta, 228 (1990) 251-257.
4) S.Xianzheng, H.Jiwen, W.Xiuzhang, Sensors and Actuators B: Chemical, 12 (1993) 33-36.
5) A.Amine, J.M.Kauffmann, G.J.Patriarche, Talanta, 38 (1991) 107-110
2E-4 4E-4 6E-4 8E-4 1E-3 1E-3
0.0
50.0
100.0
150.0
200.0
250.0
300.0
Adiciones estándar (M2)
[glucosa] ad (M)
i (n
A)
2E-4 4E-4 6E-4 8E-4 1E-3 1E-3
0.0
50.0
100.0
150.0
200.0
250.0
300.0
Adiciones estándar (M3)
[glucosa] ad (M)
i (nA
)
