DEGRADACIÓN DE LIGNINA DEL BAGAZO DE CAÑA (Saccharum officinarum) UTILIZANDO HONGOS ASCOMICETOS.

LIGNIN DEGRADATION OF THE CANE BAGASSE (Saccharum

officinarum) USING ASCOMICETES FUNGI.

Jácome, E.A. Asanza, H.F. * Carrión, F.H Centro de Biología Celular y Molecular. Universidad Técnica Particular de Loja. Loja –

Ecuador. 11-01-608. fhcarrion@utpl.edu.ec

Se evaluó la actividad enzimática para establecer el potencial de degradación de lignina del bagazo de caña de varias cepas de hongos colectados en el Parque Nacional Podocarpus, en la Provincia de Loja al Sur del Ecuador. De un total de 100 cultivos disponibles en el cepario micológico del Centro de Biología Celular y Molecular (CBCM), a los cuales se los sometió a un ensayo preliminar para determinar la capacidad cualitativa de degradación enzimática, se tomó las tres cepas que presentaban mejor actividad (Scopulariopsis Sp., A. coelomycetes y Ascomycetes 45ch.). Para determinar la actividad ligninolítica cualitativa de las especies en estudio se empleó ABTS como revelador a una concentración de 10 mM. Las cepas que mostraron actividad positiva fueron sometidas a fermentación sumergida en medios de cultivo alimentados con bagazo de caña de azúcar como sustrato. Los productos obtenidos se sometieron a pruebas espectrofotométricas para medir la actividad cuantitativa de la Lignina peroxidasa y Lacasa. La mayor actividad Lacasa fue de 2800 unidades enzimáticas por litro (U/L), producida por Ascomycetes 45ch a los 37 días de cultivo, a una concentración de sustrato del 1,5%. La tasa máxima de degradación de lignina en las fibras de bagazo alcanzada por la misma cepa, después de la etapa de fermentación, fue del 44% respecto a su contenido inicial. En ninguno de los casos se detectó actividad Lignina peroxidasa. Palabras Clave: Scopulariopsis, Coelomycetes, Ascomycetes, lignina peroxidasa, lacasa. Keywords: Scopulariopsis, Coelomycetes, Ascomycetes, lignin peroxidase, laccase. 1. Introducción

Las fibras naturales contienen elevadas cantidades de celulosa la misma que es un compuesto de especial interés en la industria para la producción de pulpa y papel, pero para llegar a este valioso recurso se debe penetrar una gran barrera formada por hemicelulosa y lignina, que son polímeros muy complejos que

encadenan las moléculas de celulosa (Rowell, R. 1991). El impacto ambiental que causa el tratamiento de las fibras en las etapas de pulpaje y blanqueo es muy severo. El pulpaje Kraft es el proceso más empleado en el mundo, su objetivo es remover la lignina para liberar la fibra de celulosa pero la utilización de diversos químicos genera la emisión de gases sulfurados denominados TRS ó azufre total reducido (Fuentes, J. 1991).

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Por otra parte en el blanqueo se emplean productos clorados que permiten la eliminación de la lignina residual pero son productores directos de diotoxinas (Fuentes, J. 1991), por tal motivo la aplicación de sistemas biológicos para la remoción de lignina es una alternativa a este problema. Se considera que la mayoría de los hongos del suelo únicamente descomponen la celulosa; sin embargo los hongos que descomponen la madera, tales como los hongos de pudrición blanca Basidiomicetos y Ascomicetos, han sido reconocidos como los más eficientes degradadores de lignina. (Martin, J. P., and Haider, K. 1971). Algunas de las cepas estudiadas, bajo las condiciones adecuadas, podrían ser herramientas potenciales para la deslignificación de las fibras naturales, aunque aún no se conoce a profundidad cual es el conjunto de enzimas involucradas en la deslignificación por hongos (Broda, P. et al. 1996). Las enzimas ligninolíticas que son responsables de la degradación de la lignina de los materiales lignocelulósicos son fundamentalmente Lignina peroxidasa (Lip), Lacasa (Lac) y Manganeso peroxidasa (MnP), la mismas que actúan liberando moléculas de celulosa, a partir de las cuales se pueden obtener unidades de glucosa que son de gran interés en la industria alimentaria para la elaboración de jarabes y etanol (Forchiassin et al, 1999). Así mismo el sistema ligninolítico tiene aplicaciones biotecnológicas muy prometedoras, tanto en el desarrollo de métodos alternativos de deslignificación de la madera, pulpeo o blanqueo, como para el tratamiento de efluentes o la biorrecuperación de suelos y aguas subterráneas contaminadas. (Gonzales et al. 2002).

Varias especies de Ascomicetos y hongos imperfectos causantes de la pudrición suave de la madera están involucrados en la degradación de lignina, lo que hace que estos microorganismos jueguen un papel importante en diversos sistemas biológicos. 2. Materiales y Métodos

Microorganismos. Sé utilizó tres especies de Ascomicetos (Scopulariopsis Sp, Coelomycetes y Ascomycetes 45ch), pertenecientes al cepario micológico del CBCM. Estos fueron mantenidos en medio MYP a temperatura ambiente. Ensayo cualitativo. En cajas petri se colocó 10 ml de medio MYP, medio basal (MgSO4. 7H2O, 0.5 g; HK2PO4, 0.6 g; H2KPO4, 0.5 g; CuSO4.5H2O, 0.4 mg; MnCl2.H2O, 0.09 mg; H3BO3, 0.07 mg; NaMoO4.2H2O, 0.02 mg; FeCl3, 1 mg; ZnCl2, 2.5 mg.) y ABTS (2,2’ - azinobis (3-etilbenzotiazoline-6-sulfonato) (SIGMA) como inductor y revelador a una concentración de 10mM. Se coloca un disco (ø 5 mm) con cultivo crecido, en el centro de la placa y se incuba a temperatura ambiente.

Fermentación. En matraces de 125 ml, se colocó 30ml de medio GA (GA. Glucosa, 1%; Asparagina, 0,4%; SIGMA) suplementado con bagazo de caña (fibras de ø 1mm) en concentraciones de 0.5%; 1.0% y 1.5%. Se reguló el pH a 5,5 con HCl 0,1 N y se esterilizó a 121 oC por 20 minutos. En los medios estériles se inoculó un disco de agar con micelio fúngico (ø 1 cm), se incubó a temperatura ambiente con agitación constante de 120 rpm.

Actividad enzimática. Se tomaron periódicamente, tres muestras semanales, de los sobrenadantes para la cuantificación enzimática.

Lacasa: Se usó como sustrato ABTS 0.5 mM en buffer acetato de sodio 0.1 M, pH 5, a 30 ˚C. (“420 36000 M-1cm-1).

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Lignina Peroxidasa. Se utilizó como sustrato alcohol veratrílico 2 mM, H2O2 0.4 mM, buffer tartrato 50 mM y la muestra de la enzima. El H2O2 inicia la reacción (“310 9333 M-1cm-1). Determinación de glucosa. Se realizó con el método enzimático (Randox) a 505 nm. Solución estándar: glucosa, 1 g/L; Reactivo de trabajo: glucosa oxidasa (GOD), peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4- AF) y ácido salicílico pH: 7,4. Cuantificación de lignina. Las fibras sometidas a la fermentación se separaron mediante filtración se lavaron con agua destilada a 90ºC, luego se solubilizó la celulosa y hemicelulosa por medio de una hidrólisis con ácido sulfúrico al 72%, permaneciendo la lignina como resto insoluble (Papinuttti et al, 2003). El peso de la fracción insoluble corresponde a la lignina. 3. Resultados y discusión. Actividad Enzimática

Enzimas Ligninolíticas

0

5

10

15

20

25

2 5 7 9 12 14 16 19 21 23

T, días

Activ

idad

Enz

imát

ica,

U/m

l

0,5%1%1,5%

Gráfico 1. Producción de Lacasa por Coelomycetes (Ascomycetes) a diferentes concentraciones Coelomycetes (Ascomycetes) presentó su mayor expresión enzimática en el quinto día de cultivo, alcanzando una producción de actividad Lac de 17,5 y 20 Unidades/Litro (U/L) para las concentraciones de sustrato de 1% y 0,5% respectivamente (Gráfico 1).

Enzimas Ligninolíticas

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

2 5 7 9 12 14 16 19 21 23 26 28 30 33 35 37 40 42 44

T, días

Activ

idad

Enz

imát

ica,

U/m

l

0,5%

1%

1,5%

Gráfico 2. Producción de Lacasa por Ascomycetes 45ch a diferentes concentraciones Ascomycetes 45ch presentó una elevada actividad Lac, alcanzando valores superiores a 2800 U/L, a una concentración de 1,5% de sustrato en un periodo de 37 días (Gráfico 2).

Enzimas Ligninolíticas

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

2 5 7 9 12 14 16 19 21 23 26 28 30 33 35 37 40 42 44

T, días

Activ

idad

Enz

imát

ica,

U/m

l

0,5%1%1,5%

Gráfico 3. Producción de Lacasa por Scopulariopsis Sp. a diferentes concentraciones Con Scapulariopsis Sp. a una concentración de 0,5% de sustrato se llegó a obtener valores máximos de 213 U/L de actividad Lac en el día 37 de fermentación (Gráfico 3).

El ensayo cuantitativo detectó únicamente actividad Lac. Ninguna de las tres especies involucradas en esta investigación presentó actividad Lip, aunque cabe destacar que esta enzima no se ha encontrado en la mayoría de los hongos de pudrición blanca estudiados (Pelaez, F., et al. 1995).

El patrón de expresión de las actividades enzimáticas depende de los

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diferentes organismos, es decir, mientras unos secretan Lip y MnP (no producen Lac), otros secretan MnP y Lac (no producen Lip) (Martín, C., et al. 2004). Es interesante conocer esto debido a que en esta investigación solo se consideró el estudio de las enzimas Lip y Lac, pero al tener los organismos este patrón de comportamiento es muy probable que alguna de las tres especies investigadas haya producido conjuntamente Lac y MnP.

La concentración del sustrato tiene una relación directamente proporcional con la producción enzimática del género Ascomycetes 45ch, es decir, a mayor concentración de fibra (1,5%), mayor actividad enzimática 2800 U/L, que se logró usando únicamente bagazo de caña como sustrato; esto contrasta con otros reportes en los que se usa cofactores (Fenol 10 mg/L)y se obtiene menores cantidades enzimáticas (Lac 2575 U/L) (Nurdan Kasıkara. 2004), esto sugiere que posiblemente esta cepa posea una capacidad mayor de producir biocatalizadores.

Consumo de glucosa. El género Ascomycetes 45ch, mostró un acelerado consumo de glucosa, agotando completamente este monosacárido en el día 7 de cultivo, lo que implicaría una activación de su metabolismo secundario para producir enzimas extracelulares (Lac), las cuales son oxidasas que en determinadas condiciones contribuyen a despolimerizar la compleja estructura de lignina (Cullen, D. 1997).

Degradación de lignina. Ascomycetes 45ch mostró la tasa máxima de degradación de lignina (44% respecto al contenido inicial), ratificando la eficiente acción de la Lac, que al catalizar las primeras reacciones rompen uniones dentro de la molécula de lignina, generando moléculas más pequeñas e incorporando estos

productos de degradación a los ciclos metabólicos del organismo que como producto final dan CO2 (Kirk, T. Farell, R. 1987).

4. Conclusiones.

Las tres especies fúngicas mostraron únicamente actividad Lacasa. La actividad Lignina peroxidasa fue nula.

Se determinó que Ascomycetes 45ch es la cepa más productiva, reportando una importante actividad Lacasa (2800 U/L) a los 37 días de la etapa fermentativa.

El bagazo de caña de azúcar demostró ser un excelente sustrato para la producción de enzimas extracelulares.

La tasa máxima de degradación de lignina fue del 44% alcanzada con Ascomycetes 45ch a una concentración de 1,5% de sustrato.

La producción enzimática comienza cuando la concentración de glucosa en el medio de cultivo empieza a disminuir. Referencias

ALEXOPOULOS, C., MIMS, C and BLACKWELL, M. (1996). Introductory Mycology. Fourth Edition. John Wiley & Sons, Inc. United States of America.

CURTIS, Helena y BARNES, Sue. (1993). Biología. Quinta Edición. Editorial Médica Panamericana S. A. Buenos Aires. Argentina.1999 pág.

FORCHIASSIN, Flavia. MAGNELLI, Paula. DIORIO, Luis Alberto y MERCURI, Oscar Alberto (1999). Manual de Procedimientos. Segunda Edición. Laboratorio de Micología Experimental. Universidad de Buenos Aires. Argentina.

MENDOZA, Laura. (2004).Producción de enzimas de

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interés para biotecnología por hongos del cepario del instituto de investigación fármaco BIOQUÍMICA (IIFB).

PAPINUTTI, V., et al. (2003). Degradación de madera de álamo por Fomes sclerodermeus: producción de enzimas ligninolíticas en aserrín de álamo y cedro. Laboratorio de Micología Experimental. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Argentina.

UHLIG, Helmut. (1998), Industrial Enzymes and their Applications. New York, USA.