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Temario de 2º de Bachillerato. Ensayos de secuenciación, PCR, microarrays, ADN recombinante
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El ADN y la Ingeniería genética
Tema 16
Utilización de los seres vivos para obtener productos útiles al ser humano
La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten
manipular el genoma de un ser vivo.
• Producción de alimentos y bebidas• Obtención de medicamentos
• Clonación, mapas genéticos,• Organismos transgénicos, terapia génica
Biotecnología
Ingeniería genética
BiotecnologíaUtilización de los seres vivos para
obtener productos útiles al ser humano
AlimentosMedicamentos
Bebidas
Tecnología del ADN
recombinante(década 70)
Si hay modificación de genes
Animales y plantas transgenicas
No hay modificación de genes
Obtención de ADN
recombinante
Clonación de ADN PCR Secuenciación
de ADN
Técnicas utilizadas en Ingeniería genética
Medicina• Diagnóstico de enfermedades• Medicina forense• Producción de medicamentos
Agricultura• Plantas resistentes• “Fábricas” de medicamentos
Ganadería• Mejora del rendimiento• Obtención de órganos• Obtención de medicamentos
Medio ambiente• Biorremediación• Biolixiviación
Aplicaciones de la ingeniería genética
Genómica
• Estudio genoma• Estructural• Funcional
Proteómica
• Estudio de las proteínas de un organismo
Farmacogenética
• Fabricación de medicamentos personalizados
Nuevas disciplinas surgidas de la ingeniería genética
Tecnología del ADN recombinante
1. Fragmentar y aislar el ADN2. Unión a vectores.3. Introducción en las células.4. Clonación5. Búsqueda del clon idóneo.6. Análisis del ADN clonado: transferencia Southern,7. Secuenciación.8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Enzimas de restricción
1. Endonucleasas que cortan el ADN por una secuencia (siempre la misma) corta y conocida.
2. Las secuencias de corte son palindrómicas
3. El corte puede ser:
o Lisoo Escalonado (extremos cohesivos o pegajosos)
Posteriormente, los fragmentos de distintos ADN cortados con la misma enzima se podrán unir mediante otro enzima, una ADN ligasa
ADN recombinante
Formación de ADN complementario por hibridación
• Tenemos dos tipos distintos de ADN• Se separan las cadenas de ADN (desnaturalización).• Se devuelven las condiciones adecuadas y se
produce la renaturalización.• Se pueden obtener moléculas híbridas de los dos
tipos de ADN
• El porcentaje de hibridación está relacionado con el parentesco evolutivo
• Estas técnicas permiten localizar enfermedades genéticas
Síntesis de ADNc usando ARNm como molde
Se utiliza el enzima transcriptasa inversa para sintetizar un ADNc partiendo de un ARNm maduro (sin intrones) para que pueda ser utilizado luego en bacterias (los procariotas no realizan un proceso postranscripcional de eliminación de intrones
1. Una célula eucariota transcribe el ADN a ARNm. 2. La misma célula procesa la nueva cadena de ARNm eliminando los
intrones, y añadiendo una cola poli-A y un terminal GTP. 3. Esta cadena de ARNm maduro se extrae de la célula. 4. Se hibrida un oligoncleótido poli-T sobre la cola poli-A del molde de
ARNm maduro, ya que la retrotranscriptasa necesita un cebador de doble cadena para comenzar a trabajar.
5. Se añade la retrotranscriptasa, junto con las bases A, T, C y G. 6. La retrotranscriptasa va recorriendo la cadena de ARNm y sintetizando
la cadena de ADN complementaria del molde de ARNm (ADNc).7. Se sintetiza la doble cadena
AAAAAA 3’5’TTTTTT 5’
AAAAAA 3’5’TTTTTT 5’3’
TTTTTT 5’3’
Transcriptasa inversaADNc
Degradación del ARN
Síntesis de la otra cadena de ADNADN polimerasa INucleasa S1
elimina el bucle
ADN de doble cadena
Clonación de ADN
En ingeniería genética se entiende por clonación la obtención de múltiples copias de un gen específico o de un fragmento de ADN en el interior de un organismo hospedador.
Estos organismos deben cumplir las siguientes características:
1. Crecimiento rápido2. No debe ser patógeno3. Debe favorecer la entrada del transgén4. Debe ser muy bien conocido5. Debe ser fácilmente manipulable
Escherichia coli
Vectores de clonación
• Son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.
• Debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. • Tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del
fragmento de ADN a clonar.
Para insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.
Tipos de vectores de clonación
• Plásmidos• Virus bacteriófagos• Cósmidos• YAC’s (cromosomas artificiales de levadura)• Cromosomas artificiales de bacterias (BAC’s)• Cromosomas artificiales humanos
• Son moléculas de ADN bicatenario circular.
• Se localizan en las bacterias.• Tienen replicación independiente.• Genes propios (resistencias a
antibióticos) que permiten seleccionarlos posteriormente
• Facilidad para la manipulación.• Puntos de corte específicos para
enzimas de restricción
Plásmidos
• Virus que infectan bacterias• Incorporan material genético mediante el proceso de
transducción. • Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material
del antiguo huésped.
Bacteriófagos
• Consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacteriófago.
• Son fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y la porción COS (fragmento de fagos necesario para empaquetar el material genético)
• Lleva varios genes de plásmidos• Incorpora marcadores (resistencia a antibióticos)• Tiene varios sitios de restricción• Permite transportar grandes cantidades de ADN.
Cósmidos
Son vectores de clonación de alta capacidad.
Esto permite clonar en levaduras (microorganismos eucariotas) secuencias de ADN de hasta un millón de pares de bases o más, al comportarse como un cromosoma propio de la levadura.
Cromosoma artificial de levadura
Clonación de los fragmentos de ADN
1. Inserción de genes marcadores en el vector (plásmido o lo que sea). Generalmente de resistencia a antibióticos
2. Se cortan el ADN humano y el vector con el mismo plásmido.3. Se mezclan los fragmentos.4. Obtención de plásmidos recombinantes.5. Se juntan los plásmidos con bacterias. 6. Incorporación de los plásmidos por transformación
bacteriana.7. Cultivo de bacterias en presencia de un antibiótico.8. Las bacterias que no han incorporado el plásmido mueren (no
son resistentes).
• Una genoteca es una colección de clones cada uno de los cuales contiene un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN derivado del ADN o el ARN totales de la célula o tejido.
• La colección de clones debería contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en la fuente original de ADN, es decir, debería contener muestras de todo el ADN del organismo.
• Para encontrar el gen de interés hay que utilizar sondas de ácidos nucleicos.
• Estas genotecas pueden ser de plásmidos, fagos o de ADNc
Almacenamiento de genes clonados
Identificación de clones
Una genoteca contiene muchos
clones
Hay que identificar el que nos interesa Sondas de ADN
Sondas de ADN
• Oligonucleótidos de cadena sencilla• Se pueden sintetizar a partir de la secuencia de bases del gen o de la
secuencia de aminoácidos de la proteína• Están marcadas (radiactividad o fluorescencia) para poder ser
identificadas
Una vez localizadas, las colonias que contienen el gen de interés se cultivan en grandes cantidades
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Es una técnica que permite duplicar un número ilimitado de veces un fragmento de ADN en un tubo de ensayo. Mediante esta técnica pueden generarse millones de moléculas idénticas, a partir de una molécula de ADN y además en muy poco tiempo.
La reacción es un proceso cíclico: 1. La molécula de ADN que va a copiarse se calienta
para que se desnaturalice y se separe las dos hebras.
2. Cada una de las hebras es copiada por la ADN-polimerasa. (Se utiliza la ADN-polimerasa de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas).
3. Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias.
Aplicaciones de la PCR
Amplificación de:
• ADN antiguos (mamuts, momias, fósiles…• ADN obtenidos de la escena de un crimen
(medicina forense).• ADN de células embrionarias (diagnostico
prenatal de trastornos genéticos)• ADN de genes virales (en células infectadas
por virus difíciles de detectar, como el VIH)
Animación de la PCR: http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf
* Método del didesoxi de Sanger – método de la interrupción controlada de la replicación enzimática (de la polimerización de DNA).
* Elementos necesarios:
- DNA polimerasa - Oligonucleótido (primer o cebador), de 18-30 nucleótidos y complementario al extremo 3’ del fragmento de DNA que queremos secuenciar - Mezcla de los 4 desoxinucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) - Una pequeña cantidad de cada uno de los 4 didesoxinucleósidos trifosfato (ddATP* o ddCCTP* o ddGTP* o ddTTP*) marcados (*florescencia específica para cada uno de ellos)
Secuenciación del ADN
OHDesoxi nucleótido Didesoxi nucleótido(bloqueo de la síntesis de DNA)
Pasos de la secuenciación
1. Primero es necesario obtener una gran cantidad de fragmentos de ADN (clonación)
2. Desnaturalización del ADN (obtención de cadenas simples)3. Mezcla de todos los componentes de la reacción4. Comienza la síntesis de ADN, que termina cuando la ADN polimerasa incorpora un
ddNTP marcado5. Se obtienen fragmentos de distinta longitud, todos ellos acabados en un ddNTP*6. Se separan las moléculas marcadas mediante un gel de poliacrilamida.7. Un detector identifica cada uno de los ddNTP* finales gracias al color.8. El espectrograma resultante nos indica la secuencia de bases.
Materiales necesarios para la secuenciación
Obtención de cadenas de distinto tamaño
acabadas en un ddNTP*Separación de
fragmentos por tamaños e identificación por
color
Identificación de genes codificadores de proteínas
Genes que interactúan entre sí
Comparación de genomas de distintas especies
El estudio de la genómica es el conocimiento del genoma completo y
de las interacciones entre los genes que lo forman.
objetivoGenómica
Genómica
Conocimiento del genoma completo
Identificación de genes
Rastreo de secuencias de inicio de transcripción
Comparación con genes conocidos
Genómica
Interacciones entre los genes del genoma
Genes que interactúan entre sí
La expresión de un gen afecta a otros y varía en función de las condiciones
La expresión del genoma se evalúa con chips de ADN
Ensayo de micromatrices de ADN
Sirve para saber si un tejido normal presenta genes alterados que podrían provocar una enfermedad
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/
Animación secuenciación genoma humano http://www.pbs.org/wgbh/nova/genome/sequencer.html#
Estudios sistemáticos de las proteínas codificadas por el genoma de un
organismo.
Conjunto de proteínas de una célula, tejido o genoma completo
PROTEÓMICA
Proteoma
Proteómica
El conjunto de proteínas supera con mucho al de los genes. Su importancia radica en que son ellas las que desempeñan las actividades celulares
Ingeniería genética y medicina
Obtención de productos
farmacéuticos
Insulina
Hormona de crecimiento
Factor VIII de coagulación
Medicina forense
Huella genética
Marcadores genéticos
Diagnostico de enfermedades
Clonación de genes
Identificación en el enfermo
Identificación en portadores
Terapia génica
Ex vivo
In vivo
In situ
Obtención de productos
farmacéuticos
Insulina
Hormona de crecimiento
Factor VIII de coagulación
1. Secuencia de la proteína (insulina)2. Síntesis de los ADN3. Obtención de plásmidos
recombinantes con los genes para formar las dos cadenas de la insulina.
4. Expresión en E. coli5. Purificación y procesado químico6. Obtención de insulina activa
Medicina forense
Huella genética
Marcadores genéticos
1. Los seres humanos difieren en un 0.1% del genoma.
2. Estas diferencias están localizadas en regiones cromosómicas concretas.
3. Estas zonas se usan como marcadores genéticos
4. Con la identificación de los marcadores se hace la huella genética (método de Southern blot)
5. La comparación de huellas genéticas permite resolver casos policiales.
MÉTODO DE SOUTHERN BLOT
Ingeniería genética y medicina
Terapia génica
Ex vivo
In vivo
In situ
Ingeniería genética y agricultura
Obtención de plantas transgénicas
Resistencia a herbicidas
Mejora del producto
Plantas farmacéuticas
Se introduce un gen de E. coli que permite
usar mayores concentraciones de
herbicidas sin dañar a la planta de interés, y
eliminando malas hierbas.
Las plantas producen sustancias medicinales, vacunas o anticuerpos
(planticuerpos).
Se mejora el valor nutricional del
producto, por ejemplo añadiendo beta-caroteno al arroz
Ingeniería genética y medio ambiente
Biorremediación Bioadsorción Biolixiviación
Uso de bacterias modificadas para degradar materia
orgánica (petróleo)
Obtención de metales a partir de minerales
de baja ley
Fijación de metales pesados a la superficie
de la célula para limpieza de suelos
Ingeniería genética y ganadería
MEJORA DE RAZAS
PRODUCCIÓN DE MEDICAMENTOS
ESTUDIO DE ENFERMEDADES
HUMANASObtener razas mas
resistentes, mas productivas, con mayor desarrollo, resistentes
a condiciones más difíciles
Se estudia la expresión de genes humanos en
organismos transgénicos
Se usan animales transgénicos.
Se pueden obtener sustancias de interés
como proteínas humanas para combatir
enfermedades:Enfisema hereditario
Factores de coagulación