Vacinas Bacterianas

Vacinas Virais

Componentes:Anna CláudiaCelso MoreiraKaren LenoraRebeca Michele

Apontamento Histórico

•Jenner (1749-1823)

• Vacinação da Varíola remonta ao sec VI na China;

• Vacinação controlou 9 doenças em algumas partes do mundo:varíola,sarampo, difteria, pliomielite, rubéola, febre amarela e tétano;

•Progressos: contra a gripe, hepatite B.

Vacina da Varíola (trabalhos de Jenner)

•Ordenhadeiras: lesões nas mãos

•Durante epidemias elas não contraiam a doença (variante humana)

•Retirou material das lesões da varíola Bovina

•Injetou em si próprio

• VACINAS derivado do termo latino VACCA

Antígeno

•Substâncias de natureza protéica, polissacaridica ou constituídos por outros compostos ligados às proteínasproteínas

Antigenes do vírusda varíola humana

≈Antigenes do vírusda varíola bovina

Antigenes Estimula Produção de anticorpos

HOSPEDEIRO

MICROORGANISMO

HOSPEDEIROANTÍGENE

Induz o mecanismo de defesa a produzir anticorpos

IMUNIZAÇÃOO hospedeiro nãocontrai a doençaprovocada pelomicrorganismoinvasor

�Baseia-se em:

• Resistência específica é ativa contra umdeterminado microrganismo patogênico (ex:determinado microrganismo patogênico (ex:anticorpos que neutralizam vírus da raiva)

• Imunidade do hospedeiro (inespecífica ou

natural) ativas contra diferentes espéciesde microrganismos

Imunização ativa

•Artificialmente adquirida indução daformação de anticorpos através da introduçãoartificial do antigene

•Naturalmente adquirida introdução do antigene •Naturalmente adquirida introdução do antigene acidental (ferida, via oral)

Ex: Poliomielite – penetra pelo trato digestivo. Se houver no sangue anticorpos específicos induzidos em número suficiente, que impeçam que o vírus atinja o sistema nervoso central, não há problema.

Imunização passiva

•Naturalmente adquirida transferência de anticorpos para o feto através da placenta

•Artificialmente adquirida os anticorpos são injetados no organismo proporcionando proteção imediata

(ex: soro antidiftérico (contendo anticorpos de cavalo contra a exotoxina diftérica)

Ação de antibiótico ≠ soro diftérico

O antibiótico impede a reprodução e excreção da toxina mas não é eficaz contra a substância já presente

Principais tipos de vacinas

•Cólera (Vibrio cholerae)

•Febre Tifoide (Salmonella

typhi)

•Tuberculose (Mycobacterium

bovis)

•Poliomielite

•Varíola

•Raiva

•Rubéola

•Influenzabovis)

•Difteria (Corynebacterium

diphterae)

•Tétano (Clostridium tetani)

•Peste (Yersinia pestis)

•Meningite (Neisseria

meningitidis)

•Pneumonia Lombar (

Diplococcus pneumoneae)

•Influenza

•Sarampo

•Febre amarela

Fermentação na produção de

vacinas

Volume do inoculo necessário depende de:

•Condução dos processos fermentativos, logo da[microrganismos] e [antigenes] obtidos;[microrganismos] e [antigenes] obtidos;•Via de aplicação da vacina (parenteral ou oral)•Posterior purificação do antigene

• > nº requerido para pureza especificada

• > o volume necessário a 1 dose humana

Ampliação de Escala (obstáculos)

A) vacinas virais preparadas e rotina com matéria prima (ex: pele de bezerro, ovos de galinha) são problemáticos quando em grande Escala

B) Alguns processos ainda são desenvolvidos em institutos e laboratórios

C) cultivo de bactérias patogênicas e vírus exigem condições complexas.

Produção de Vacinas (processo unitário)

a) Temperaturas de cultivo ≈ 37ºC

b) Meios de cultivo com composição Complexab) Meios de cultivo com composição Complexa

c) Volumes de meios de cultura < do que noutros processos industriais (25-3500L)

Produção de Vacinas (processo unitário)

d) A natureza complexa dos meios, o pH ótimo ≈ 7,5 e a temperatura, sendo condições favoráveis à proliferação de larga gama de microrganismos patogênicos, exige estrita assepsia e proteção patogênicos, exige estrita assepsia e proteção especial dos operadores contra infecções acidentais

e) As substâncias de interesse (os antigenes) não constituem o principal produto metabólico

Produção de Vacinas (processo unitário)

f) Os efeitos colaterais decorrente da aplicação da vacina devem ser minorizados

g) Nem sempre é possível saber a eficácia da vacina durante o processo de cultivo, a mesma baseia-se em efeitos observados em animais de laboratório

Vacinas Bacterianas Classificação / Processos

de Produção

Segundo localização do antigene (corpo bacteriano ou meio):

• Partículas (ex: cólera, BCG, febre tifoide)• Partículas (ex: cólera, BCG, febre tifoide)

• Não particuladas (toxoides: diftérico tetânico)

Pode influenciar tratamento final a quando da produção da

vacina

Vacina contra cólera e febre tifóide

(enterobacterianas)

•Infecção transmitida Homem – Homem, alimentos e água;

•Bactérias Gram Negativo

• Problemas no trato gastro-intestinal

• Reproduzem-se em meios simples

• Igual meio de cultivo e processamento posterior;

Cólera - Apontamento Histórico

•Vibrio cholerae – descoberto por KocK• Doença originária na Índia e Paquistão• Melhoria das condições sanitárias restringiu a• Melhoria das condições sanitárias restringiu adoença• Variedade benigna “El Tor”• Melhor imunidade conseguida por uma vacinacontendo estirpe atenuada (Inaba e Ogawa)• Aplicação da metodologia do DNA recombinante

Febre Tifóide . Apontamento Histórico

•Doença descrita por Budd em 1856

•Bacilo responsável descrito por Berth em 1880•Bacilo responsável descrito por Berth em 1880

• Isolado por Gaffky (disc. Kock) 1884

•Salmonella typhi penetra pela via digestiva e atinge corrente sanguínea

Vacina

Tradicional

• Bactérias de S. typhi (estirpe Tyz de Felix)• Inativada pelo calor a 53ºC por 1 hora• Preservada em fenol a 0,5 %• Preservada em fenol a 0,5 %

Ou

• acetona ou álcool + suspensão da bactérialiofilização

Cultivos submersos podem ser realizados em

fermentador:

- Meio de cultura simples (c/ ext.Levedura e glicose, adicionada aos poucos senão teor de antigenes )

-pH 7,3 - 7,6-pH 7,3 - 7,6

-Tendo em consideração que são aeróbios obrigatórios

- Fase estacionária ao fim de 6-8 horas defermentação

BCG Apontamento Histórico

•1882 – relacionou a etiologia da tuberculose à Mycobacterium tuberculosis (tipo humano)

•Crescimento muito lento em meio sólido•Crescimento muito lento em meio sólido

•Kock tentou obter vacina inativando o agente por calor, formalina, outros químicos

Continuação

•Calmette (1921) suspeita que imunidade é adquirida pela presença de microrganismos vivos

•Desenvolvimento de uma estirpe atenuada deMycobacterium bovis

•Foram precisas 250 sub-culturas com meio de batata, glicerina e bilis bovina

•Estirpe conhecida por Bacilo Calmette-Guerin (BCG)

•Administração oral (-eficaz) ou parenteral

Método de Cultivo

Cultivo estático

-elevado nº de frascos

-p/ compensar crescimento lento e dispersão bacilar: desagregação com esferas em moinho de bolas (que causa morte de 40-60%)

- Adição de tensioactivos p/ facilitar adispersão bacilar sem gd agitação

Cultivo submerso

-Produto final mais viável (7x) para mesmaquantidade de biomassaquantidade de biomassa

-Bactérias cultivadas em profundidade maisresistentes a posterior liofilização.

Combinação meio / estirpe / geometria de

fermentos

• perda de viabilidade durante cultivos prolongados• efeitos tóxicos dos tensioactivos• Manutenção de assepsia dt 8 dias de cultivo com agitaçãoagitação•O facto do pH ser +/- 7,5 o risco de contaminação•< imunogenicidade em cobaias quando comparado com a estática•Respeitar normas da OMS

Toxoides - moléculas de toxina

modificada

•As toxinas:

- São de natureza protéica

-Posteriormente submetidas a um destoxificação

-Sem alterar propriedades imunogênicas

Método para detectar presença de toxinas no

meio

Toxina + Soro com anticorpos contra esta

toxina (antitoxina)

Floculação visível a olho nu

Exotoxinas • termolábeis• Originam anticorpos específicos• + facilmente excretadas pela célula

Endotoxinas • termoestáveis• Não induzem formação de anticorpos específicos• Além de proteínas contêm lipopolissacáridos

Classificação das exotoxinas segundo tipo

de libertação

a) Toxinas ligadas firmemente às células libertadas (ex: toxina da Pasteurella pestis)

b) Difundem-se livremente no meio de culturadurante a reprodução microbiana[intracelular]≈[extracelular] (ex: toxina diftérica)

c) Difundem-se no meio mas [intracelular]>[extracelular] (ex: Clostridium sp.)

•Corynobacterium diphtheriae (35ºC)

• Vacina descoberta por Behring

• Toxina é um polipeptido, molécula com dois fragmentos A ( responsável pela toxicidade) e B

Toxoide Difterico

fragmentos A ( responsável pela toxicidade) e B (responsável pela penetração na célula).

• Anticorpos para B protegem da infecção

• Há efeitos colaterais (febre) devido à presença de proteínas estranhas no toxoide

•Meio de cultura desenvolvido por Linggod Fenton, inclui extracto de carne bovina, ext. levedura e Maltose

•A presença de ferro é prejudicial à formação da

Método de cultivo

•A presença de ferro é prejudicial à formação da toxina

• A quantidade dissolvida no meio proveniente do inox dos contentores está abaixo do Prejudicial

• O crescimento bacteriano não é inibido

•Podem ser usados outros materiais como vidroe alumínio;

•Formação da toxina não está associada à reprodução bacteriana Atividade torna-se mensurável a partir da bacteriana Atividade torna-se mensurável a partir da fase de declínio (48h de fermentação)

•pH baixa de 7,8 → 7,5

•Com arejamento insuficiente pH baixa de 7,8→6,5 < produção de toxina.

MODELO DE REATOR

• Controle de pH• Termostato• Agitação aeróbica• Agitação aeróbica• Agitação mecânica• Presostato• Sistema de filtração• Outros acessórios conforme necessidade

Maltose Glicose Ác. orgânicos CO2 + H2O

FórmicoAcéticoLáctico

Propionico

Depende:

Disponibilidade do oxigênio livre arejamento + lenta

1 2 3

PropionicoSuccínico

logo acumulação dos ác.Orgânicos

e acentuada do pH

Acumulação dos ácidos depende da rapidez de fornecimentoda glicose e de oxidação dos ácidos

> arejamento > produção toxina[ácido] [toxina]

Fermentação

Filtração Tangencial

Filtração Molecular

Cromatografia

Separação das bactérias, do meio onde se encontra toxina.

Separação dos nutrientes residuais e dos metabolitos da toxina

Moléculas separadas por tamanho e

Processo Industrial

Cromatografia

Destoxificação

Cromatografia

Filtração esterilizante Mistura com toxoide tetânico

Moléculas separadas por tamanho e carga.

Desnaturar a toxina pela ação doformaldeido a 37ºC, 4-6 semanas

Purifica e concentra toxoidesnos padrões estabelecidos

•Clostridium tetani – Bacilo Gram Positivo

•1884 – descoberta natureza infecciosa

Tétano Apontamento Histórico

•1884 – descoberta natureza infecciosa

•1889 – Kitasato isola microrganismo in Vitro

•1890 – descoberta da toxina por Faber

•Produz esporos termoestáveis•É estritamente anaeróbio•N insuflado pode levar a contaminação acidental

Toxoide Tetânico

Cultivo de bactérias

•N insuflado pode levar a contaminação acidental•Meio de cultura desenvolvido por Mueller e•Miller (modificado por Latham) constituído porum produto da digestão enzimática da caseína(N2case), infusão de coração de bovino, saisminerais e vitaminas

Toxina Tetânica ≠ Toxina Diftérica

Tetânica:

Já está presente no interior da

Diftérica:

Não se observano interior da célula em quantidade considerável em estágios precoce da fermentação.

Não se observaacumulaçãoIntracelular na fase de crescimento.

Fermentação

Filtração Tangencial

Filtração MolecularUsar formaldeído, mistura permanece a incubar a 37ºC, 4

Processo Industrial

Destoxificação

Cromatografia

Filtração Esterilizante

permanece a incubar a 37ºC, 4 semanas – fazer controlo de toxoides – se houver toxicidade adicionar mais formaldeído

Filtro de 0,22 صm

• Toxicidade específica

Controle do Toxoide

• Ausência de contaminantes

• Conteúdo e potência do antígene

Vacinas Virais

•Reprodução dos vírus em culturas in vitro em células animais (em órgãos como rins de macaco ou cobaia)ou cobaia)

• Cultura estática

• Cultura submersa

• Cultura sem agitação em 1 ou mais camadasde células até a superfície do meio ficar coberta

destas

Cultura estática

Inoculação com os vírus

que se propagam podendo causar lise ou não

separação, purificação inativação (ou não)

• Freqüentes operações de inoculação de frascos, trocas de meio e colheitas

Desvantagens

> risco de contaminação

• Em condições homogêneas, submersa,em suspensão

Cultura submersa

em suspensão

• Reprodução de células• Constante agitação do meio• Em biorreactores (apropriados)

• risco de contaminação< mão de obra envolvida• Equipamentos com controle das condições de:

(pH, O2 dissolvido, temperatura, volume de

Vantagens

(pH, O2 dissolvido, temperatura, volume de entrada e saída; agitação)

Condições ambientais constantemente favoráveis

> Uniformidade dos lotes de vacinas obtidos

1) Difícil manter uma suspensão de células individuais (pode-se promover a adesão

Desvantagens

individuais (pode-se promover a adesão dessas células sobre esferas microscópicas ou microcarregadores que permanecem em suspensão graças à agitação mecânica do meio)

2) Quando a escala

2.1. problemas na definição de necessidades nutricionais de cultivo

2.2. acumulação de subprodutos do metabolismo e sua remoção

Desvantagens

remoção

2.3. transferência de O2 no biorreactor

2.4. Sensibilidade das células às restrições físicas e fisiológicas no crescimento (tensões devido à agitação, limitações de transporte em situação de alta [células]

2.5. adoção de métodos de monitorização e controlo do processo

Devem:

• Permitir adesão das células aos

Sistemas de agitação

• Permitir adesão das células aos microcarregadores

• Evitar efeitos mecânicos decorrentes da agitação que levem ao rompimento das membranas celulares

• Evitar arejamento excessivo

HUMANOS VETERINÁRIOSPoliomielite Febre Aftosa

Sarampo Raiva

Rubéola Encefalite equina

Influenza Febre bovina

Vacinas

Influenza Febre bovina efémera

Raiva Doença de Newcastle

Herpes

Varicela