BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE

PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

LABORATORIO DE VIROLOGÍA

WESTERN BLOT

MAYTE RODRÍGUEZ MANCILLA

PRIMAVERA 2015

DEFINICIÓN

Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada en biología celular y molecular, para la separación e identificación de proteínas.

Capacidad de identificar proteínas específicas de una mezcla

compleja de proteínas extraídas de las células.

¿CÓMO FUNCIONA? Las proteínas de la muestra se separan

mediante electroforesis en gel en función de su peso molecular.

A continuación se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés.

El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidad relativa en la muestra.

Muestra:TejidoCultivo celular

Extracción de las proteínas de muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Licuadora (para grandes volúmenes de muestra)Homogenizador (para muestras pequeñas)Sonicación.

Mecánico

DetergentesSales Tampones  (favorecen la lisis y solubilizan las proteínas)

Químico

ELECTROFORESIS EN GEL En esta técnica la mezcla de

proteínas se separa mediante una electroforesis en gel, con base en:

o Peso molecularo Estructurao Hidrofobicidad

TRANSFERENCIA Estos resultados son luego transferidos

a una membrana adsorbente produciendo una banda para cada proteína. 

Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos.Membrana de nitrocelulosa o de PVDF.

Esta transferencia puede realizarse por:DifusiónPor vacío Por acción de un campo eléctrico

(electrotransferencia).

La técnica de transferencia más usada gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de proteína que se transfiere (especialmente en comparación con las otras

técnicas).

Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de proteínas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana.

BLOQUEO Puesto que la membrana escogida

necesita poder unirse proteínas de forma inespecífica, es preciso bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia.

En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la detección puede unirse a ellos, dificultando la distinción del complejo antígeno-antígeno que se forma con la proteína que se busca.

En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas:Albúmina de suero bovino o ASB (más

conocida por sus siglas en inglés, BSA)Leche en polvo o caseína

Diminuta fracción de detergente (Tween 20 o Tritón X-100)

DETECCIÓNPosteriormente la membrana se incuba con anticuerpos específicos marcados para la proteína de interés. Comprueba la presencia en la

membrana de una determinada proteína. Para ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica. De esta forma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.

Anticuerpo

primario.

El anticuerpo reconoce específicamente la proteína

desnaturalizada.

Esta incubación puede durar desde 30 minutos a una noche

entera.

Las temperaturas elevadas temperaturas favorecen las

uniones más específicas.

Anticuerpo

secundario

Reconoce de forma específica una región concreta del

anticuerpo primario.

Suelen estar marcados para ser detectables .

Varios de estos anticuerpos se unirán a cada anticuerpo

primario, amplificando la señal.

MÉTODOS DE DETECCIÓNRadiactividad•Más caro•Peligroso•Lento

Anticuerpo unido a una enzima•Enzimas que catalicen la transformación de un sustrato soluble en un producto insoluble.

•Peroxidasa de rábano (HRP) o una fosfatasa alcalina

Marcaje fluorescente•Unido a fluorocromos del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o el rojo Nilo.

Sistema avidina/estreptavidina•Anticuerpo primario unido covalentemente a moléculas de biotina.

Detección de oro•Anticuerpos primarios con proteína A unida a

partículas de oro.

ANÁLISIS Tras el lavado de las sondas marcadas

no unidas, se procede a la detección de aquellas que sí se han unido a la proteína de interés.

CUANTIFICACIÓN Es muy importante ser consciente de

que los datos producidos con un western blot se considera generalmente para ser semi-cuantitativa.

Debido a que proporciona una comparación relativa de los niveles de proteína, pero no una medida absoluta de la cantidad. 

Hay dos razones para esto; primero, hay variaciones en los tipos de carga y de transferencia entre las muestras en carriles separados que son diferentes en transferencias separadas.

Tendrán que ser normalizado antes de una comparación más precisa se puede hacer estas diferencias.

En segundo lugar, la señal generada por la detección no es lineal en todo el intervalo de concentración de muestras. 

Por lo tanto, puesto que la señal producida no es lineal, no debe ser utilizado para modelar la concentración.

APLICACIONES Investigación

Biología molecular. Inmunología.

DiagnósticoPrueba de VIH.Enfermedad de las vacas locas.Enfermedad de Lyme.Enfermedades infecciosas.

BIBLIOGRAFÍA Recuperado el 30 de Marzo de 2015:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/

http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish-wb-webinar.pdf