Zbadaj szczepionkę przeciwko malarii

Warsztaty doświadczalneprotokół

2

WprowadzenieUważa się, że malaria jest najważniejszą chorobą pa-sożytniczą na świecie i każdego roku powoduje śmierć około 800 000 osób w każdym wieku, zwłaszcza dzieci poniżej piątego roku życia i kobiet w ciąży. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) około 3000 milionów osób jest narażonych na ryzyko złapania infekcji, a w roku 2010 na świecie stwierdzono 225 milionów przypadków malarii, z których 90% wystąpiło w Afryce.

Obecnie malaria jest chorobą endemiczną w po-nad 100 krajach na terenie Afryki Subsaharyjskiej i w obszarach położonych na południu Azji, Ameryki Łacińskiej i Oceanii. Ostatnie doniesienia wskazują, że połowa populacji na świecie mieszka na obszarach, w których istnieje ryzyko zachorowania i w których malaria nie tylko ma konsekwencje dla zdrowia popu-lacji, ale także przyczynia się do dalszego pogorszenia sytuacji gospodarczej rejonu.

W celu eliminacji choroby na obszarach, na których występuje wysokie ryzyko jej przenoszenia, stosuje się wiele interwencji obejmujących połączenie róż-nych środków, takich jak -między innymi - stosowanie moskitier nasączonych środkami owadobójczymi i

W trakcie tych warsztatów zbadasz różne związki będące kandydatami na szczepionkę w celu określenia, który z nich jest najbardziej skuteczny.

aerozoli o właściwościach owadobójczych, leków profi-laktycznych, wdrażanie programów edukacyjnych oraz interwencje środowiskowe.

Społeczność naukowców intensywnie pracuje nad szczepionką, o której się sądzi, że mogłaby istotnie przyczynić się do lepszej kontroli nad malarią w połączeniu z obecnie stosowanymi środkami. Obecnie istnieje już szczepionka, znajdująca się na etapie badań klinicznych, która będzie wykazywać skuteczność w 50% przypadków.

Kraje lub obszary, w których występuje ograniczone ryzyko przeniesienia malariiKraje lub obszary, w których występuje zjawisko przenoszenia malarii

Źródło: Światowa Organizacja Zdrowia (WHO). Dane z roku 2009

2

3

W jaki sposób przenosi się malaria?

Malaria jest chorobą zakaźną, która się przenosi w wyniku ukłucia przez komara przynależnego do gatunku Anopheles przenoszącego pasożyty z rodzaju Plasmodium i pełniącego w związku z tym funkcję wektora. Wewnątrz organizmu człowieka pasożyty namnażają się w wątrobie i następnie infekują krwinki czerwone. Charakterystyczne objawy malarii obejmują gorączkę, ból głowy i wymioty, które pojawiają się od 10 do 15 dni po ukłuciu przez komara.

Z historycznego punktu widzenia szczepionki były jednymi z najbardziej skutecznych środków zapobie-gających chorobom i ratujących życie, zwłaszcza w przypadku chorób zakaźnych. Otrzymanie szczepionki, która byłaby częściowo skuteczna, mogłoby oznaczać możliwość uratowania życia setkom tysięcy osób.

Otrzymanie szczepionki stanowiłoby znaczny krok naprzód i byłoby możliwe dodanie jej do obecnego arsenału środków stosowanych w celu zapobiegania wystąpieniu malarii, takich jak moskitiery nasączone środkami owadobójczymi oraz stosowne i odpowied-nie leczenie w przypadkach już rozpoznanej malarii.

Ponieważ skuteczność szczepionki w krótkim okresie byłaby częściowa, nie zastępowałaby ona tych środków, ale je uzupełniała i wraz z nimi stanowiłaby całkowite rozwiązanie w celu zapobiegania malarii.

1

3

2

Strategie skierowane na komara, czyli wektor, mianowicie spryskiwanie przestrzeni zamkniętych środkami owadobójczymi.

Jak wyglądają interwencje stosowane w celu kontrolowania malarii?Podstawowe interwencje stosowane w celu kontrolo-wania malarii można podzielić na kilka grup:

Strategie uniemożliwiające kontakt wektora z gospodarzem, mianowicie moskitiery nasączone środkami owadobójczymi.

Strategie skierowane przeciwko pasożytowi. W tej grupie strategii znajdują się programy terapeutyczne obejmujące różne leki zawierające cząsteczkę o nazwie artemizynina, o szybkim

i skutecznym działaniu. Szczepionka także należałaby do strategii kontrolnych skierowanych przeciwko pasożytowi i w połączeniu z innymi strategiami mogłaby istotnie przyczynić się do eradykacji malarii.

Dlaczego szczepionka przeciwko malarii jest potrzebna?

1 Strategie skierowane na komara, czyli wektor, mianowicie spryskiwanie przestrzeni zamkniętych środkami owadobójczymi.

wania malarii można podzielić na kilka grup:

2Strategie uniemożliwiające kontakt wektora z gospodarzem, mianowicie moskitieryśrodkami owadobójczymi.

3 Strategie skierowane przeciwko pasożytowi. W tej grupie strategii znajdują się programy terapeutyczne obejmujące różne lekinazwie artemizynina, o szybkim

4

Instytut Zdrowia Publicznego w Barcelonie (ISGlobal)to organizacja niezarobkowa, której celem jest popra-wa zdrowia i rozwój najbardziej wrażliwych popu-lacji dzięki tworzeniu, zarządzaniu, przekazywaniu i stosowaniu wiedzy i umiejętności. Jej wizją jest świat, w którym wszyscy moglibyśmy cieszyć się dobrym zdro-wiem, a ponadto ma wsparcie między innymi takich organizacji społecznych, jak „la Caixa”. Jednym z zasadniczych fi larów działalności instytutu IS-Global są badania skierowane na problemy zdrowotne dotykające najbardziej wrażliwe populacje. Badania te są prowadzone w Centrum Badań Zdrowia Światowe-go w Barcelonie (CRESIB). Badania dotyczące malarii prowadzone w centrum CRESIB koncentrują się na następujących dziedzinach:

1. Badanie podstaw molekularnych choroby, czyli różnych odpowiedzi układu immunologicz-nego.

2. Opracowanie nowych leków i ocena ich bezpie-czeństwa, skuteczności i efektywności.

3. Ocena cech epidemiologicznych malarii w różnych środowiskach i związanych z nimi aspek-tów społeczno-kulturalnych.

4. Analiza skuteczności różnych narzędzi profi -laktycznych, między innymi związku między kosztami a skutecznością interwencji.

W ramach punktu (4) centrum CRESIB prowadzi badania kliniczne dotyczące bezpieczeństwa, skutecz-ności i efektywności szczepionek. Obecnie bierze udział w badaniach nad szczepionką RTS,S przeciwko malarii, która okazuje się być skuteczna u ponad 50% zakażonych dzieci. Jednocześnie naukowcy w centrum CRESIB pracują nad określeniem nowych związków będących kandydatami na szczepionkę.

Co robimy w ISgLOBAL - Instytucie Zdrowia Publicznego w Barcelonie?

5

Cele warsztatówW czasie tych warsztatów zapraszamy cię do przepro-wadzenia analizy różnych związków będących kandy-datami na szczepionkę przeciwko malarii iznajdujących się obecnie na etapie badań w ośrodku CRESIB, w celu określenia, który z nich jest najlepszym kandyda-tem. Związki będące kandydatami na szczepionkę w ośrodku CRESIB uzyskano z wcześniej oczyszczonych białek pasożyta.

W celu przeprowadzenia analizy tych związków bę-dziesz mieć do dyspozycji różne próbki krwi pobrane od zamieszkałych na obszarach dotkniętych malarią osób, które przebyły już chorobę w różnych okolicz-nościach i wykazują na nią odporność.

Aby potwierdzić skuteczność związków będących kandydatami na szczepionkę,, musimy się upewnić, że u osób z odpornością wystąpiła odpowiedź na te właśnie związki. Jeżeli u tych osób zaobserwuje się wystąpienie odpowiedzi immunologicznej przeciwko będącym kan-dydatami na szczepionkę białkom, będzie to oznaczać, że stanowią one dobry materiał na kandydatów na szczepionkę, ponieważ będą także mogły zainicjować odpowiedź niezbędną do ochrony przed przyszłymi zakażeniami.

3

2

1

kandydatami na szczepionkę,, musimy się upewnić, że u

1

2

3

6

Podstawowa zasada tej metody opiera się na interakcji związku będącego kandydatem na szczepionkę, czyli antygenu (1), z przeciwciałem (2). Swoiste przeciwciało połączy się ze swoistym antygenem, tworząc wyjątko-wy kompleks antygen-przeciwciało.

Metoda ELISA umożliwia nam sprawdzenie obecno-ści przeciwciał i tym samym tego, czy utworzyły się kompleksy antygen-przeciwciało w trakcie kontaktu próbek krwi ze związkami będącymi kandydatami na szczepionkę.

Aby przeprowadzić identyfi kację, stosowane są różne przeciwciała połączone z cząsteczką o nazwie enzym (3), która może reagować z dodawanym przez nas związkiem o nazwie substrat (4), powodując zmianę koloru.

Jeżeli zatem w próbce znajduje się przeciwciało, które chcemy wykryć, połączy się ono z dodawanym przez nas przeciwciałem z enzymem, co z kolei sprawi, że substrat spowoduje zmianę koloru, co oznaczać będzie wynik pozytywny.

1. Antygen: dowolny materiał pochodzenia zewnętrznego, który w sposób swoisty łączy się z przeciwciałami lub swoistymi limfocytami, wywołując odpowiedź immunologiczną. Zwykle masa cząsteczkowa antygenów jest wysoka i najczęściej są to białka lub polisacharydy.

2. Przeciwciało: białka (immunoglobuliny - Ig) surowicy, które się tworzą w odpowiedzi na inwazję organizmu przez cząsteczki pochodze-nia zewnętrznego w wyniku naturalnej ekspozycji na antygen lub immunizacji za pomocą szczepionek. Mają postać litery Y i składają się z czterech łańcuchów polipeptydowych połączonych za pomocą międzyłańcuchowych wiązań disiarczkowych. Przeciwciała mają region stały i region zmienny.

3. Enzym: białko ułatwiające swoiste reakcje metaboliczne.

4. Substrat: roztwór zawierający związek, na który oddziałuje enzym.

Podstawowe zasady metody eLISA

Celem tych warsztatów jest zapoznanie się z najczę-ściej stosowanymi w laboratoriach biomedycznych metodami, takimi jak test immunoenzymatyczny ELISA (ang. Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).

Warsztaty będą obejmować analizę mającą na celu określenie, czy w próbkach krwi występują prze-ciwciała. Obecność przeciwciał swoistych względem

związków będących kandydatami na szczepionkę będzie oznaczać, że mogą one wywoływać odpowied-nią odpowiedź immunologiczną i dlatego taki związek można uznać za dobrego kandydata.

Dzięki tej metodzie odkryjemy, który dokładnie z posia-danych przez nas w laboratorium antygenów jest dobrym kandydatem na szczepionkę przeciwko malarii.

PrzeciwciałoEnzym

Antygen

7

Aby stwierdzić, który związek będący kandydatem na szczepionkę lub antygen jest najbardziej sku-teczny, będziemy sprawdzać, czy w próbkach krwi osób odpornych na malarię znajdują się przeciwciała

1. UnIeRUCHOMIenIe BIAŁeK BĘDĄCyCH KAnDyDAtAMI (LUB AntygenÓW) nA POWIeRZCHnI DOŁKÓWPierwszy etap będzie obejmować przytwiedzenie badanych białek będących kandydatami do stałego podłoża

2. UtWORZenIe KOMPLeKSÓW Antygen-PRZeCIWCIAŁANastępnie dodamy próbki krwi, konkretnie surowicę (odpowiadającą próbkom krwi bez komórek i czynników krzepnięcia) i przeciwciało oznakowane enzymem, które będziemy określać mianem przeciwciała drugorzędowe-go. W próbkach krwi, w których znajduje się badane przeciwciało, utworzą się kompleksy antygen-przeciwciało, które następnie połączą się z przeciwciałem oznakowanym enzymem.

3. ODCZyt WynIKU ReAKCJINa końcu dodamy substrat enzymu, który zmieni kolor, jeżeli będzie obecny kompleks antygen-przeciwciało. Dzię-ki temu będziemy wiedzieć, czy w próbkach krwi znajdowały się badane przeciwciała, a jeżeli tak, w jakiej ilości.

Organizacja warsztatówreagujące na te związki.W tym celu eksperyment zostanie podzielony na 3 główne etapy.

Surowica pacjentów

Substrat enzymu

Przeciwciało drugorzędowe oznakowane

enzymem

Dzięki otrzymanym wynikom będziemy mogli zoba-czyć, który związek będący kandydatem na szczepion-kę powoduje powstanie najbardziej intensywnej odpo-

wiedzi immunologicznej i tym samym jest najlepszym kandydatem.

Wyniki i wnioski

8

Aparaty i wyposażenie laboratoryjne

Materiały jednorazowe

1. W przypadku braku mieszadła magnetycznego można zakupić płynny PBS2. W przypadku braku mikropipet można wykorzystać pipety Pasteura o małej pojemności

Wymagany sprzęt i materiały

Mieszadło magnetyczne (1) (do przygotowania buforu PBS-tween)

Chronometr

Plastikowe pipety Pasteura, wyskalowane

Pisak niezmywalny

Mikropipeta o pojemności od 20 do 200 µl (2)

Płytki 12-dołkowe dla testu eLISA i podstawki

Bibuła chłonna

Końcówki do mikropipety

Rękawice, okulary i fartuch laboratoryjny

Mieszadełko magnetyczne i „wędka magnetyczna”

LejekProbówka o pojemności 100 ml

Szklana butelka o pojemności 250 ml

Aparaty i wyposażenie laboratoryjne

Mieszadło magnetyczne (1) (do „wędka magnetyczna”

Probówka Szklana butelka o Lejek

Płytki 12-dołkowe dla testu eLISA i podstawki

Bibuła chłonna

9

Odczynniki i próbki

tabletka PBS do przygotowania roztworu (3)

Substrat lub roztwór rozwijający

Detergent tween-20 (4) Woda destylowana

Próbki surowicy pobrane od 4 osób zamieszkałych na obszarach endemi-cznych występowania malarii, które wykazują odporność na chorobę

Związki będące kandydatami na szczepionkę (antygeny)

Kontrole pozytywne i negatywne (5)

Przeciwciało drugorzędowe z enzymem

(peroksydaza)

Przeciwciało drugorzędowe Przeciwciało drugorzędowe

Substrat lub Próbki surowicy pobrane od 4 osób zamieszkałych na obszarach endemi-Próbki surowicy pobrane od 4 osób zamieszkałych na obszarach endemi-Próbki surowicy pobrane od 4 osób zamieszkałych na obszarach endemi-Próbki surowicy pobrane od 4 osób zamieszkałych na obszarach endemi-Próbki surowicy pobrane od 4 osób zamieszkałych na obszarach endemi-Próbki surowicy pobrane od 4 osób zamieszkałych na obszarach endemi-Próbki surowicy pobrane od 4 osób zamieszkałych na obszarach endemi-

A

1 2 3 4

C+ C-

Prz

eciw

ciał

o dr

ugor

zędo

we

Subs

trat

B

3. Związek pomagający zachować odpowiednie pH roztworu dzięki zawartości fosforanu sodu i potasu 4. Związek zapobiegający nieswoistym połączeniom przeciwciał5. C+: zawiera mieszankę surowic pobranych od osób zamieszkałych na obszarach endemicznych występowania malarii, które wykazują odporność na chorobę. C-: mieszanka surowic od osób, które nigdy nie były narażone na malarię

10

Aby określić obecność lub brak występowania przeciwciał swoistych w stosunku do 2 dostępnych w laboratorium antygenów będących kandydatami na szczepionkę, połączymy krew (a konkretnie surowicę) różnych pacjentów zamieszkałych na obszarach ende-

micznych występowania malarii z tymi antygenami, aby zobaczyć, czy we wspomnianych próbkach surowicy znajdują się przeciwciała swoiste dla naszych antyge-nów.

Płytki z mikrodołkami zostaną pokryte związkami będącymi kandydatami na szczepionkę (antygenami), które chcemy zbadać w celu sprawdzenia, czy są one dobrymi kandydatami na szczepionkę przeciwko malarii.

Unieruchamianie tych antygenów na powierzchni dołków zachodzi z łatwością dzięki temu, że dołki są wykonane z poddawanego obróbce tworzywa charakteryzującego się wysokim powinowactwem w kierunku łączenia białek.

Sposób postępowania

1 Unieruchomienie antygenów na powierzchni dołków

PROtOKÓŁ UnIeRUCHAMIAnIA AntygenÓW nA POWIeRZCHnI DOŁKÓW

Zanotuj następnie, co zostało dodane do każdego dołka (kontrole, próbki krwi i nazwy badanych antygenów).

Opisz dołki, zaznaczając,w którym znajduje się każda próbka.

1

2

będącymi kandydatami na szczepionkę (antygenami), które chcemy zbadać w celu sprawdzenia, czy są one dobrymi kandydatami na szczepionkę przeciwko malarii.

dołków zachodzi z łatwością dzięki temu, że dołki są wykonane z poddawanego obróbce tworzywa charakteryzującego się wysokim powinowactwem w kierunku łączenia białek.

PROtOKÓŁ UnIeRUCHAMIAnIA AntygenÓW nA POWIeRZCHnI DOŁKÓW

Zanotuj następnie, co zostało dodane do każdego dołka (kontrole, próbki krwi i nazwy 1

badanych antygenów).

11

Przygotuj roztwór płuczący (PBS-Tween 0,05%).

Uwaga: Roztwór płuczący zawiera PBS (buforowaną sól fi zjologiczną), która umożliwia utrzymanie przeciwciał w stabilnym środowisku pomagającym w zachowaniu ich struktury. Bufor Tween-20 jest detergentem pomagającym usunąć białka, które mogły się utworzyć w sposób niespecyfi czny, i przylega do fragmentów dołków, które nie są opłaszczone antygenem i w ten sposób zmniejsza szum tła.

Odmierz 200 ml wody destylowanej do probówki za pomocą pipety Pasteura. Korzystając z lejka, dodaj 200 ml wody destylowanej do butelki.

Po rozpuszczeniu się tabletki wyciągnij mieszadeł-ko magnetyczne i za pomocą plastikowej pipety Pasteura dodaj 100 μl buforu Tween-20.

Przełóż mieszadełko magnetyczne do butelki i rozpuść w wodzie 1 tabletkę PBS, stosując mieszadło magnetyczne.

Dobrze wymieszaj, odwracając butelkę kilka razy.

A

C

B

D

3

Odmierz 200 ml wody destylowanej do

A

Odmierz 200 ml wody destylowanej do Odmierz 200 ml wody destylowanej do Przełóż mieszadełko magnetyczne do butelki

B

Po rozpuszczeniu się tabletki wyciągnij mieszadeł-Po rozpuszczeniu się tabletki wyciągnij mieszadeł-ko magnetyczne i za pomocą plastikowej pipety ko magnetyczne i za pomocą plastikowej pipety

C

Po rozpuszczeniu się tabletki wyciągnij mieszadeł-ko magnetyczne i za pomocą plastikowej pipety ko magnetyczne i za pomocą plastikowej pipety

Dobrze wymieszaj, odwracając butelkę kilka razy.

D

12

Przepłucz w celu usunięcia nadmiaru antygenu niezwiązanego z płytką. W tym celu za pomocą plastikowej pipety Pasteura napełnij dołki roztworem płuczącym.

Pozostaw do inkubacji na 5 minut w temperaturze pokojowej.

Odrzuć roztwór płuczący, odwracając płytkę nad bibułą chłonną.

Usuń pozostałości antygenu, odwracając płytkę nad bibułą chłonną.

Powtórz ponownie krok 7 i 8.

4

7

5

8

6

9

Za pomocą mikropipety dodaj badane antygeny do odpowiednich dołków (50 μl na dołek). Ważne jest, aby dodając antygeny, stosować czyste końcówki, dzięki czemu zapobiega się kontaminacji.

4Za pomocą mikropipety dodaj badane antygeny do odpowiednich dołków (50 μl na dołek). Ważne jest, aby dodając antygeny, stosować czyste końcówki, dzięki czemu zapobiega się kontaminacji.

Usuń pozostałości antygenu, odwracając płytkę nad bibułą chłonną.

Odrzuć roztwór płuczący, odwracając płytkę nad bibułą chłonną.

Przepłucz w celu usunięcia nadmiaru antygenu

7

Powtórz ponownie krok 7 i 8.Odrzuć roztwór płuczący, odwracając płytkę

5

13

Na tym etapie należy najpierw przygotować surowicę pacjentów, aby umożliwić przeprowadzenie analizy pod kątem obecności przeciwciał przeciwko związkom bę-dącym kandydatami na szczepionkę. Przeciwciała, które chcemy przeanalizować, będziemy nazywać prze-ciwciałami pierwszorzędowymi. Następnie dodamy przeciwciało drugorzędowe oznakowane enzymem o

nazwie peroksydaza. Ponieważ do każdego przeciwcia-ła pierwszorzędowego może się przyłączyć więcej niż jedno przeciwciało drugorzędowe, natężenie koloru uzyskiwane w etapie trzecim będzie większe. Dzięki temu metoda będzie się charakteryzować większą czułością.

2 Utworzenie kompleksów antygen-przeciwciała

PROtOKÓŁ tWORZenIA KOMPLeKSÓW Antygen-PRZeCIWCIAŁA

Za pomocą mikropipety dodaj kontrole pozytywne i negatywne do odpowiednich dołków (50 μl na dołek).Kontrola pozytywna (C+) zawiera mieszankę surowic pobranych od osób zamieszkałych na obszarach endemicznych występowania malarii, które wykazują odporność na chorobę. Kontrola negatywna (C-) zawiera mieszankę surowic pobranych od osób, które nigdy nie były narażone na malarię

Za pomocą mikropipety dodaj poszczególne próbki surowicy pobrane od 4 osób pochodzących z obszarów endemicznych występowania malarii do odpowiednich dołków (50 μl na dołek).

1 2

PROtOKÓŁ tWORZenIA KOMPLeKSÓW Antygen-PRZeCIWCIAŁA

1

PROtOKÓŁ tWORZenIA KOMPLeKSÓW Antygen-PRZeCIWCIAŁA

2

Za pomocą mikropipety dodaj kontrole Za pomocą mikropipety dodaj

ciwciałami pierwszorzędowymi. Następnie dodamy przeciwciało drugorzędowe oznakowane enzymem o

czułością.

Surowica pacjentów

Przeciwciało drugorzędowe oznakowane

enzymem

14

Pozostaw do inkubacji na 5 minut w temperaturze pokojowej.

Usuń nadmiar próbki, odwracając płytkę nad bibułą chłonną.

Przepłucz wszystkie dołki w celu usunięcia przeciwciał, które nie weszły w reakcję z antygenami i tym samym nie są swoiste. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura napełnij dołki roztworem płuczącym.

Odrzuć roztwór płuczący, odwracając płytkę nad bibułą chłonną.

Powtórz jeszcze dwukrotnie krok 5 i 6.

3 4

5 6

7 8

Pozostaw do inkubacji na 5 minut w Usuń nadmiar próbki, odwracając płytkę nad

4

6

Przepłucz wszystkie dołki w celu usunięcia

5

8

Za pomocą mikropipety dodaj przeciwciało drugorzędowe połączone z enzymem do wszystkich dołków (50 μl na dołek).

3

15

Pozostaw do inkubacji na 5 minut w temperaturze pokojowej.

Usuń nadmiar przeciwciała drugorzędowego, odwracając płytkę nad bibułą chłonną.

Przepłucz dołki, napełniając je roztworem płuczącym za pomocą plastikowej pipety Pasteura.

Odrzuć roztwór płuczący, odwracając płytkę nad bibułą chłonną.

Powtórz jeszcze trzykrotnie dwa wcześniejsze kroki.

9 10

11 12

13

Pozostaw do inkubacji na 5 minut w

9

Usuń nadmiar przeciwciała drugorzędowego, odwracając płytkę nad bibułą chłonną.

Odrzuć roztwór płuczący, odwracając płytkę nad bibułą chłonną.

11

16

Po przepłukaniu w celu eliminacji wszystkich znakowanych cząsteczek, które nie zostały związane w kompleksach antygen-przeciwciała, należy dodać subs-trat enzymu w roztworze, który ułatwi zmianę koloru.

3 Odczyt wyniku reakcji

PROtOKÓŁ ODCZytU WynIKU ReAKCJI

Za pomocą mikropipety dodaj substrat enzymu do wszystkich dołków (50 μl na dołek).

Pozostaw do inkubacji przez 5 minut. W tym czasie substrat połączy się z enzymem i w temperaturze pokojowej będzie widoczny kolor.

1 2

Za pomocą mikropipety dodaj substrat

1

Pozostaw do inkubacji przez 5 minut. W tym

PROtOKÓŁ ODCZytU WynIKU ReAKCJI

Substrat enzymu

17

Przedstaw wyniki w postaci wykresu słupkowego.In

tens

ywno

śćIn

tens

ywno

ść

Próbki

Próbki

wartość maksymalna

wartość maksymalna

wartość minimalna

wartość minimalna

C+

C+

C-

C-

M1

M1

M2

M2

M3

M3

M4

M4

3

Antygen 1

Antygen 2

18

Wyniki i wnioski

1. Który z badanych antygenów jest według Ciebie najlepszym kandydatem na szczepionkę? Czy uważasz, że badane antygeny są dobrymi kandydatami na szczepionkę? Dlaczego?

2. Kiedy wynik reakcji jest pozytywny, a kiedy jest negatywny? Dlaczego?

3. Dlaczego Twoim zdaniem stosowane są kontrole?

Zinterpretuj i przedstaw wyniki

19

6. Czy moglibyśmy zastosować próbki krwi pobrane od Twoich kolegów z klasy w celu sprawdzenia, czy nasze antygeny w laboratorium są odpowiednimi kandydatami na szczepionkę przeciwko malarii? Uzasadnij swoją odpowiedź.

5. Co by się stało, gdyby nie przeprowadzać etapów płukania przed dodaniem substratu rozwijającego?

4. Który fragment przeciwciała pierwszorzędowego jest rozpoznawany przez przeciwciało drugorzędowe: region stały czy zmienny? Uzasadnij swoją odpowiedź.

7. Czy uważasz, że w trakcie tego doświadczenia wykazano, że wybrany związek będący kandydatem spowoduje wywołanie odpowiedzi immunologicznej? Czy byłoby konieczne przeprowadzenie innego typu doświadczenia, aby ocenić, czy może również wywołać inny typ odpowiedzi?

20

nAZWAPBS Tween-20CHK IGY, bagged (= ANTYGEN)RB ANTI-CHK, bagged (= OSOCZE)GAR-HRP, bagged (= PRZECIWCIAŁO DRUGORZĘDOWE)SUBSTRAT ROZWIJAJĄCY

BĄDŹ POInFORMOWAnyZobacz, gdzie znajdują się środki zapewniające bezpie-czeństwo w laboratorium lub miejsce przeznaczone do przeprowadzania doświadczeń (gaśnice, prysznice lub łazienki, wyjścia awaryjne, itp.). Przed przeprowa-dzeniem doświadczenia dokładnie przeczytaj instruk-cje. Nie zapomnij przeczytać etykiet bezpieczeństwa odczynników i aparatury.

nOŚ ODPOWIeDnIĄ ODZIeŻRękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.

OgÓLne ZASADyNie wolno palić, jeść ani pić w laboratorium ani w miejscu przeznaczonym na przeprowadzenie doświad-czenia.Przed opuszczeniem laboratorium należy umyć ręce. Należy pracować systematycznie, starannie i bez pośpiechu. Jeżeli którykolwiek z produktów upadnie, należy go niezwłocznie podnieść. Miejsce pracy należy zawsze pozostawiać w czystości i porządku. Nigdy nie należy stosować sprzętu ani urządzenia, jeżeli nie poznano dokładnie sposobu jego działania.

PRACA Ze SZKŁeMW trakcie pracy ze szkłem należy chronić ręce. Nie należy stosować popękanych elementów szklanych.

ZWIĄZKI CHeMICZneNie wolno stosować żadnych odczynników w butelkach nieopatrzonych etykietą. Związków chemicznych nie wolno wąchać, wdychać, kosztować ani dotykać. Nigdy nie należy pipetować ustami.

W czasie pracy ze związkami toksycznymi lub żrącymi należy nosić rękawice i często myć ręce. Nie wolno zbliżać pojemników z odczynnikami do płomienia. Nie wolno podgrzewać palnych cieczy. Butelki należy prze-nosić trzymając je za dno, a nie za szyjkę.

USUWAnIe POZOStAŁOŚCIDo specjalnych i odpowiednio oznakowanych pojem-ników należy wyrzucać popękane elementy szklane, a także toksyczne, szkodliwe lub niekorzystne dla środowiska naturalnego odczynniki oraz pozostałości materiału biologicznego. Nigdy nie wolno wyrzucać stałych pozostałości do zlewu.

W razie wypadku należy niezwłocznie powiadomić opiekuna. Pamiętaj: w razie wszelkiej wątpliwości skon-sultuj się z opiekunem.

ŚRODKI OStROŻnOŚCI OBOWIĄZUJĄCe W RAMACH tyCH WARSZtAtÓW W czasie tego doświadczenia będziesz pracować z od-czynnikami, którymi należy się posługiwać z zachowaniem środków ostrożności charakterystycznych dla pracy z produktami chemicznymi. Poniżej wymieniono wyłącznie produkty powodujące następujące zagrożenie:

• PBS: toksyczny w przypadku spożycia, wdychania i kon-taktu ze skórą.

• tween 20: toksyczny w przypadku spożycia, wdychania i kon-taktu ze skórą. Drażniący.

nUMeR KAtALOgOWyP4417-50TABP1379-100ML1662406EDU1662407EDU1662408EDU1662402EDU

FIRMASigmaSigmaBioRadBioRadBioRadBioRad

Środki ostrożności i bezpieczeństwa

numery katalogowe odczynników

Aneks I

Aneks II

toksyczny w przypadku spożycia, wdychania i kon-  

toksyczny w przypadku spożycia, wdychania i kon-      

OBOWIĄZKOWE

NOSZENIE OKULARÓW

OBOWIĄZKOWE NOSZENIE FARTUCHA LABORATORYJNEGO

OBOWIĄZKOWE

NOSZENIE RĘKAWIC

Badacze, którzy pomagali w opracowaniu treści: Laura Puyol, badaczka w centrum CRESIB, ISGlobal.

Niniejsza praca posiada licencję Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Kopię licencji przedstawiono na stronie http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/

OPRACOWANO PRZEZ

Kontynuuj badania w Xplore Health!