LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Kamis, 12 Maret 2015

Kelompok II

Senin, Pukul 10.00 – 13.00 WIB

Nama NPM

R.A Siti Nur Azizah 260110130013

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

( Sani ) ( Casuarina )

PEWARNAAN TAHAN ASAM

I. Tujuan

Mengamati dua kelompok bakteri, yaitu bakteri tahan asam dan bakteri

tak tahan asam, dengan menggunakan prosedur pewarnaan tahan asam

pewarnaan (Ziehl-Neelsen). Memahami setiap langkah dan reaksi-

reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

II. Prinsip

a. Pewarnaan tahan asam atau disebut juga pewarnaan ziehl Neelsen

merupakan teknik pewarnaan yang digunakan untuk mewarnai

bakteri golongan Mycrobacterium ( M. tuberculosis/ M. leprae )

dan Actinomycetes.

b. Penetrasi zat warna merupakan mekanisme masuknya zat warna ke

dalam dinding sel atau membrane sel, yang disebut juga sebagai

difusi zat.

c. Impermeabilitas dinding sel bakteri tahan asam memiliki sifat

impermeable terhadap zat pewarna atau bahan kimia lainnya

karena susunan dinding selnya yang terdiri dari lemak dengan

arabinogalaktan dan peptidiglogikan di bawahnya.

d. Pewarnaan dengan pemanasan pada dinding sel bakteri bertujuan

untuk memuaikan dinding sel sehingga zat pewarna dapat masuk,

pada pemanasan ini tidak terlalu panas karena akan menyebabkan

dinding sel bakteri rusak.

III. Teori Dasar

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur

dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang

hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel

bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati

bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan

metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk

mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel

bakteri melalui serangkaian pengecatan (Mastra, Nyoman, dkk. 2014).

Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya

sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan

biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri

ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan

zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Bakteri

tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu

berantai karbon (C) yang panjangnya 8 – 95 dan memiliki dinding sel

yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid

yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang

termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose,

Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis,

dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri

patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat

tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA).

Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan.

Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan

kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya.

Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat

mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci

dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat

berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena

larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol

fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat

warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%.

Pada pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat

mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang

dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah

pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu

pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan.

Fungsi pemanasan untuk melebarkan pori-pori lemak BTA

sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu BTA dicuci dengan larutan

pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak mudah

dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup

pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna

merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol

fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah

penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan

asam akan berwarna biru (Lay, 1994).

Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan

mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan

sensitivitas yang tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom.

Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan

lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x

sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak

ada yaitu mikroskop fluorescens (Martin.,2013).

Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang lurus atau sedikit

melengkung, tidak berspora dan tidak berkapsul. Bakteri ini berukuran

lebar 0,3 – 0,6 mm dan panjang 1 – 4 mm. Dinding M. tuberculosis sangat

kompleks, terdiri dari lapisan lemak cukup tinggi (60%) (Rinda, 2014 ).

Penyusun utama dinding sel M. tuberculosis ialah asam mikolat, lilin

kompleks (complex-waxes), trehalosa dimikolat yang disebut cord factor,

dan mycobacterial sulfolipids yang berperan dalam virulensi. Asam

mikolat merupakan asam lemak berantai panjang (C60 – C90) yang

dihubungkan dengan arabinogalaktan oleh ikatan glikolipid dan dengan

peptidoglikan oleh jembatan fosfodiester. Unsur lain yang terdapat pada

dinding sel bakteri tersebut adalah polisakarida seperti arabinogalaktan

dan arabinomanan. Struktur dinding sel yang kompleks tersebut

menyebabkan bakteri M. tuberculosisbersifat tahan asam, yaitu apabila

sekali diwarnai akan tetap tahan terhadap upaya penghilangan zat warna

tersebut dengan larutan asam – alcohol (Pearce Evelyn.,2009 )

Di samping ciri-ciri ini, kadar resap pewarna pada sel yang tahan

asam adalah rendah dibandingkan dengan sel tak tahan asam. Ciri-ciri ini

disebabkan oleh perbedaan komposisi kimia (secara kuantitatif dan

kualitatif) bakteria tahan asam dan bakteria tak tahan asam. Mikobakteria

yang tahan asam mempunyai karbohidrat, alkohol dan asam lemak (seperti

asam mikolik) yang tersendiri. Oleh yang demikian, dalam tata cara ini

object glass perlu dipanaskan sehingga uap keluar karena, dalam hal ini,

pemanasan digunakan untuk terlaksananya pewarnaan dalam jangka waktu

yang optimal (Syahrurachman, dkk, 1994 ).

IV. Alat bahan

4,1 Bahan :

- Aquadest

- Asam Alkohol

- Karbol Fuksin

- Metilen Blue

- Minyak Emersi

- Suspensi bakteri Mycrobacterium tuberculosis

4.2 Alat :

No. Nama Alat Gambar Alat

1. Bak pewarna

2. Botol semprot

3. Cawan petri

4. Kaca preparat

5. Kapas

6. Kertas saring

7. Mikroskop

8. Pembakar spiritus

9. Pipet tetes

10. Ose

1.

Rak tabung

V. Prosedur

Disediakan kaca obyek yang bersih dan dibuat olesan dari suspensi

bakteri, digenangi olesan bakteri dengan pewama karbol fuksin selama

5 menit, sambil dipanaskan di atas penangas air. Jaga jangan sampai

terlalu panas, mendidih atau kering. dibuang zat wama yang berlebih,

lalu dibilas dengan air suling. dibilas dengan zat pemucat alkohol-asam

selama 15 detik atau sampai latar belakang olesan berwarna merah

muda pucat. digenangi olesan dengan pewarna tandingan biru metilen

selama 2 menit, dibuang zat warna yang berlebih, dibilas dengan air

suling, lalu dikeringkan dengan kertas saring. diteteskan sedikit

minyak imersi pada preparat, lalu diperiksa di bawah mikroskop.

dimulai dengan obyektif berkekuatan terendah 10X, lalu diganti

dengan lensa obyektif berkekuatan 100X. diamati dan digambarkan

hasilnya. Bakteri tahan asam (ZN + ) akan berwarna merah dan bakteri

tidak tahan asam (ZN -) akan berwarna biru.

VI. Data Pengamatan

Perlakuan Hasil

Ditambahkan karbol fuchsin

sambil dipanaskan, dibilas dengan

air dan keringkan.

Ditambah asam alcohol,dibilas

dengan air dan keringkan.

Ditambah metilen blue, dibilas

dengan air dan keringkan

Ditambah minyak emersi

VII. Pembahasan

Pada praktikum ini dilakukan teknis aseptis, hal ini bertujuan untuk

mencegah atau meminimaliskan adanya kontaminasi mikroorganisme

baik pada sampel atau praktikan sendiri. Pada praktikum kali ini

dilakukan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasi dan

mengamati bakteri yang bersifat tahan asam, bakteri ini disebut tahan

asam karena akan mempertahankan zat warna perimer ketika

ditambahkan larutan asam, bakteri ini memiliki rantai karbon 8-95 dan

dinding selnya terdiri dari lapisan lilin, asam lemak mikolat, dan lipid

sampai 60 % dari berat dinding selnya, sehingga dengan tebalnya

kadar lipid pada dinding sel menyebabkan bakteri ini sulit untuk

dilakukan dengan pewarnaan biasa dan perlu perwarnaan khusus.

Pada praktikum ini menggunakan pewarnaan ziehl neelsen untuk

identifikasi dan pengamatan bakteri tahan asam, karena metode ini

merupakan salah satu metode pengujian bakteri tahan asam yang

cukup sederhana dan memiliki spesipisitas dan sensitivitas yang cukup

tinggi. Pada praktiknya hal yang pertama dilakukan adalah pengolesan

sampel pada kaca preparat secar aseptis dalam hal ini sampel yang

digunakan merupakan Mycrobacterium tuberculosis, dengan

mengambil kaca preparat yang terendam dalam etanol kemudian

dikeringkan dengan kapas sampai benar-benar kering, perendaman

kaca preparat ini bertujuan untuk membunuh bakteri dari praktikum

sebelumnya yang masih melekat pada permukaan kaca preparat.

Dimana etanol ini memiliki dua mekanisme dalam membunuh bakteri

yakni dengan denaturasi protein dan pelarutan membrane lemak pada

bakteri. Setelah kaca preparat kering selanjutnya dibuat pola lingkaran

pada bagian belakang kaca preparat yang berfungsi sebagai tanda

olesan bakteri atau sampel. Kemudiaan menyalakan api spiritus untuk

melakukan fiksasi dan menjaga agar lingkungan pada proses

pemindahan sampel dari cawan petri ke kaca preparat tetap dalam

keadaan steril atau mencegah kontaminan lain masuk ke dalam sampel.

Hal pertama yang dilakukan adalah fiksasi ose terlebih dahulu untuk

mencegah adanya kontaminan yang menempel pada ose, fiksasi ose ini

dilakukan dari ujung kawat dekat batang kaca ose menuju ujung loop

ose, hal ini dilakukan agar panas yang dihantarkan merata serta jika

ose dalam keadaan basah tentu sisa larutan pada ujung loop ose akan

lebih efisien untuk dikeringkan dengan cara ini, selanjutnya ose

dibiarkan dingin di tempat yang masih dekat dengan panas spiritus hal

ini bertujuan agar ketika ose dimasukan ke dalam sampel tidak

menyebabkan bakteri yang terkandung dalam sampel mati akibat panas

dari ose. Selanjutnya mengambil sampel sebanyak satu loop ose dalam

keadaan aseptis,dan oleskan ke atas kaca preparat, dimana teknik

pengolesan sampel harus diperhatikan karena jika olesan terlalu tebal,

maka sel-sel bakteri akan bertumpuk-tumpuk sehingga sulit untuk

menentukan bentuk sel individu dan jika olesan terlalu tipis dapat

menylulitkan pengamatan secara mikroskopis. Selanjutnya dilakukan

fiksasi pada sampel, yang bertujuan untuk merekatkan sel bakteri pada

preparat objek, setelah itu sampel yang telah difiksasi digenangi denga

karbol fuksin selama 5 menit dan dilakukan pemanasan, lama waktu

yang dibutuhkan bertujuan untuk agar zat warna karbol fuksin ini

dapat berpenetrasi secara sempurna ke dalam dinding sel bakteri, dan

dimana karbol fuksin ini merupakan zat pewarna primer yang

mengandung fucsin basa dan fenol, sehingga dengan adanya fenol

pada karbol fuksin ini dapat berfungsi untuk melunakan lapisan lilin

pada dinding sel bakteri sehingga cat warna fuksin dapat masuk ke

dalam sel, hal ini tentu dibantu dengan proses pemanasan yang

mengakibatkan terbukanya pori-pori lemak yang menutupi dinding sel

bakteri sehingga fungsi fenol pada karbol fuksin dapat berjalan dengan

baik, namun pada pemanasan ini sampel harus dijaga jangan sampai

mengering atau terlalu panas karena akan menyebabkan bakteri mati

dan tidak akan dapat teridentifikasi. Selanjutnya dilakukan pencucian

dengan mengaliri aquadest pada sampel, hal ini bertujuan untuk

mencegah adanya kelebihan zat warna pada sampel, kemudian

ditambahkan asam alcohol selama 15 detik, penambahan ini

diperlukan untuk melakukan pemucatan pada bakteri yang dimana hal

ini akan menentukan bakteri tersebut tahan asam atau tidak dimana

jika bakteri bersifat tahan asam, bakteri tersebut tidak akan melepaskan

zat warna primer sebelumnya, namun jika non BTA maka bakteri akan

melepaskan zat warna primernya. Penambahan asam alcohol ini tidak

boleh dilakukan secara berlebihan karena akan menyebabkan

overdekolorization sehingga BTA dan non BTA tidak dapat

dipisahkan, namun jangan pula terlalu sedikit dalam penambahan asam

alcohol pada bakteri karena akan menyebabkan underdecolorization

yang dapat menyebabkan zat warna pada non BTA tidak seluruhnya

terlepas yang mengakibatkan terjadinya ketidak akuratan dalam proses

identifikasi dan pengamatan apda sampel. Selanjutnya dialiri aquadest

untuk menutup pori-pori bakteri sehingga tidak terjadi lagi proses

pemucatan oleh asam alcohol, dan dikeringkan dengan kertas saring

untuk menyerap kelebihan aquadest pada sampel bakteri. Kemudian

preparat sampel bakteri digenagi dengan metilen blue yang berfungsi

sebgai pewarna tandingan, dimana pewarna ini yang akan menunjukan

adanya bakteri non tahan asam, karena bakteri ini akan melepaskan

pewarna primer dan menyerap pewarna sekunder atau tandingan.

Kemudian dibilas dengan aquadest yang berfungsi untuk mencegah

adanya kelebihan zat warna pada sampel, selanjutnya dikeringkan

dengan kertas saring yang erfungsi unuk menyerap kelebihan aquadest

pada sampel, selanjutnya ditambahkan minya emersi karena cahaya

yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara

dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu

membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan

pembiasan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan

pembiasan yang mendekati garis normal adalah minyak emersi. Selain

itu, minyak emersi juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau

identik dengan kaca,sehingga dapat memfokuskan sampel bakteri pada

pengamatan mikroskop, Setelah ditambahkan minyak emersi

dilakukan pengamatan dengan menggunakan mikroskop pada

perbesaran 10 x 10 dan 10 x 100, berdasarkan hasil praktikum ini

diperoleh hasil pengamatan latar belakang berwarna biru terang dan

basil bakteri berwarna merah pucat, hal ini menunjukan adanya bakteri

tahan asam pada sampel yakni berupa Mycrobacterium tuberculosis,

bakteri ini bersifat pathogen di dalam tubuh baik pada manusia

maupun hewan, dan bersifat kronis karena mebutuhkan waktu yang

lama agar menimbulkan infeksi pada host nya, berbentuk batang

langsing, lurus atau berbentuk filament. Bakteri ini bersifat aerobik,

tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan merupakan bakteri

gram positif.

VIII. Kesimpulan dan Saran

8.1 Kesimpulan

1. pewarnaan dengan teknik ziehl neelsen merupakan peawarnaan

untuk melakukan identifikasi dan pengamatan bakteri tahan asam,

dimana pada prosesnya menggunakan karbol fuksin sebagai zat

pelunak dinding sel bakteri yang disertai pemnasan untuk memuaikan

pori-pori sel bakteri, dan penambahan asam alcohol berfungsi sebgai

zat pemucatan, serta metilen blue sebagai pewarna tandingan.

2. Perbedaan antara bakteri tahan asam ( BTA ) dan bakteri non tahan

asam adalah dilihat dari hasil akhir pewarnaan, dimana pada BTA akan

menghasilkan warna merah pucat atau warna zat primernya

ssedangkan non BTA akan memiliki warna biru atau sesuai dengan

pewarna tandingannya.

8.2 Saran

Dalam praktikum ini, diharapkan seluruh praktikan menggunakan

APD (Alat Pelindung Diri ),serta dapat meningkatkan dan ketelitian

dan keterampilan dalam melakukan identifikasi dan pengamatan

bakteri.

DAFTAR PUSTAKA

Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo

Persada.

Martin. 2013. Pewarnaan BTA. Tersedia online di :

http://majour.maranatha.edu/index.php/jurnal-kedokteran/article/view/65/pdf

[diakses pad 16-03-2015 ].

Mastra, Nyoman, dkk. 2014. Bakteriologi. Denpasar : Politektnik Kesehatan

Denpasar Jurusan Analis Kesehatan.

Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Yuliani Sri,

penerjemah; Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari: Anatomy

and Physiology for Nurses.

Rinda. 2014. Bakteri 1. Bakteri tahan Asam. Tersedia online di:

http://rindachie.weng.com/menu/labs/bakteri-5.html [ diakses pad 16-03-2015 ].

Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi.

Jakarta: UI Press.