Calidad Sanitaria de la carne molida de res

PUE.BT1007.3 Laboratorio de Microbiología 16 de mayo de 2014 (Ene 14 Gpo 3) 4to semestre

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Tecnológico de

Monterrey

Campus Puebla

Calidad sanitaria de carne molida de

res que se expende en un

supermercado del Área

Metropolitana de Puebla.

Laura Angélica López Hernández, A01230516

Xanat Vaitiare Ferreyro Davis, A01099405

Directores de Proyecto:

Dra. Mónica Rosales Pérez y Mtro. Omar Morales

Vázquez

Resumen

La regulación de las normas sanitarias para la disminución

de las enfermedades gastrointestinales está a cargo de la

Secretaria de Salud. Para confirmar que los supermercados

siguen estas normas, se tomaron dos muestras de un

supermercado del Área Metropolitana de Puebla. La cuenta

de microorganismos mesófilos aerobios se realizó mediante

la técnica de Miles & Misra. Se identificó la presencia de

Escherichia coli y Shigella sp en la carne de res

empaquetada en el establecimiento y se obtuvo una carga

bacteriológica 15 veces mayor que la presente en la carne

pre-empaquetada. Se concluyó que la calidad sanitaria de la

carne molida de res expendida en el supermercado se

encuentra dentro de lo establecido por la NOM-034-SSA1-

1993. Se busca determinar la presencia y cantidad de

microorganismos mesófilos aerobios, Salmonella sp.,

Shigella sp., Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli

presentes en carne molida de res que se expende en el Área

Metropolitana de Puebla.

Palabras clave: carne de res, calidad sanitaria, Puebla,

carga bacteriológica, Escherichia coli, Shigella,

Salmonella.


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INTRODUCCIÓN

Todos los alimentos poseen la capacidad

de ser portadores de microorganismos

capaces de afectar la salud del consumidor.

La carne de res, en especial la molida, es

un producto que posee la facilidad para

adquirir microorganismos, ya sean

patógenos o inocuos, debido a la cantidad

de procesos a la que es sometida: al

momento de sacrificar al animal en el

rastro, la cantidad de microorganismos

presentes en el medio ambiente en el que

habita el animal, los utensilios que se

utilizan para manipular la carne y su

procesado para la venta al público.

Entre los microorganismos que es posible

encontrar en la carne de res, destacan los

siguientes:

Escherichia coli: Pertenece al grupo de

coliformes fecales. Es un bacilo aerobio

facultativo fermentador de lactosa. Existen

varios grupos de E. coli que son patógenos,

entre los cuales destacan: E. coli

enterotoxigénica (ETEC), E. coli

enteroinvasiva (EIEC), E. coli

enteropátógena (EPEC), E. coli

enteroagregativa (EAgEC), E. coli

enterohemorrágica (EHEC).

Microorganismo relacionado con

intoxicación alimentaria debido al mal

cocido de la carne de res.

Salmonella sp.: Actualmente se le conoce

como S. typhimurium. Bacilo Gram

positivo, anaerobio facultativo,

perteneciente a las enterobacterias.

Además no posee esporas, puede ser móvil

o inmóvil, no fermenta lactosa y su fuente

de carbono es el citrato. Bacteria

transferida a la carne de res debido a la

manipulación inadecuada durante los

procesos a los que es sometida.

Shigella sp.: Bacteria Gram negativa.

Pertenece a las enterobacterias. Asimismo,

es inmóvil, no posee esporas y no fermenta

lactosa. Se encuentra de manera poco

común en animales, mientras que es

fácilmente localizarla en agua

contaminada. Se le asocia con

enfermedades del tipo tifoidea y se

transmite de igual manera que la

Salmonella spp., esto es, debido a una

manipulación inadecuada de los

alimentos.

A pesar de que la mayoría de los

microorganismos se encuentran en la carne

debido a su mala manipulación o que no se

cocinan de la manera correcta, existen

otros factores que favorecen la

proliferación de éstos: “Si a esto añadimos

un abuso de la temperatura de

almacenamiento por parte del consumidor,

se pudiera favorecer la proliferación de los


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géneros bacterianos presentes y por

consecuencia la descomposición del

alimento” (Rojas, G. 2000).

Por otro lado, uno de los microorganismos

presente, en su mayoría, por el mal manejo

de las calidades sanitarias es Klebsiella

pneumoniae, cuyo diagnóstico va desde

los pulmones hasta infecciones

abdominales y en el tracto urinario. La K.

pneumoniae es un bacilo Gram negativo,

inmóvil y perteneciente a las

enterobacterias. Se localiza mayormente

en ambientes hospitalarios, sin embargo,

también se localiza en ambientes húmedos

y aerosoles contaminados.

México, como otros países, cuenta con las

Normas Oficiales Mexicanas de Salud en

las cuales se establecen reglas y

procedimientos que deben de cumplirse

con el fin de evitar o disminuir el

contenido de dichos microorganismos

patógenos en diferentes productos, ya sean

alimenticios, de belleza, entre otros.

La Secretaría de Salud es el organismo del

gobierno encargado de verificar que las

empresas fabricantes de dichos productos,

cumplan con los requerimientos y las

normas.

El presente proyecto tiene como objetivo

principal la identificación de diversos

microorganismos presentes en la carne de

res molida expedida en un supermercado

del Área Metropolitana de Puebla.

Específicamente, se identificará la

presencia de microorganismos mesófilos

aerobios, Salmonella spp, Shigella spp.,

Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli.

Para ello, se utilizarán como referencias

las Normas Oficiales Mexicanas: NOM-

092-SSA1-1994 (Método para la cuenta de

bacterias aerobias en placa), NOM-110-

SSA1-1994 (Preparación y dilución de

muestras de alimentos para su análisis

microbiológico), NOM-213-SSA1-2002

(Productos cárnicos procesados), NOM-

114-SSA1-199 (Método para la

determinación de salmonella en

alimentos), NOM-034-SSA1-1993

(Productos de la carne. Carne molida y

carne molida moldeada. Envasadas)

METODOLOGÍA

Recolección de muestras. Las muestras

de carne molida de res se adquirieron al

azar de una cadena de supermercados del

Área Metropolitana de Puebla.

El primer paquete fue de albóndigas de

Res, de la marca Practi Rico, en su

presentación de 590g. Esta representó la

muestra de carne pre-empaquetada para su

venta al público.


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El segundo paquete consistió en 60g de

carne molida de res de venta a granel, la

cual es empaquetada al momento por el

personal del establecimiento.

Las muestras fueron transportadas en

hieleras, con el fin de conservar el número

de microorganismos lo más constante

posible hasta el momento de análisis, el

cual se realizó en un lapso no mayor a 1

hora desde el momento de su compra.

Medios de cultivo. Se prepararon 20

placas de agar Salmonella-Shigella (SS),

20 placas de agar Eosina y Azul de

Metileno (EMB) y 10 placas de agar Mac

Conkey, todas de la marca BD Bioxon. Se

seleccionaron estos medios por ser

selectivos para Escherichia coli,

Salmonella sp y Klebsiella pneumoniae.

Se prepararon 5 placas de agar nutritivo de

la marca BD Bioxon y 12 placas de agar

Triptona-Extracto de levadura para cuenta

estándar con las siguientes

especificaciones para un litro:

Extracto de levadura 2.5g

Triptona 5.0g

Agar 15g

Dextrosa 1g

Preparación de las muestras. Se tomaron

25g de cada muestra y se colocaron en

bolsas estériles con 225ml de agua estéril;

se sometieron a un proceso de

homogeneización en BagMixer® en 5

intervalos de 60 segundos. Una vez

homogeneizada la muestra se tomó 1 ml

para hacer diluciones seriadas hasta 10-7.

Siembra, incubación y recuento de

unidades formadoras de colonias

(UFC). Utilizando el método de Miles &

Misra se sembró por duplicado cada

dilución de cada muestra, dejando una sin

sembrar como control. Las siembras se

realizaron en agar EMB, agar SS, agar

nutritivo y agar Triptona-Extracto de

levadura. Se colocaron en una estufa de

incubación a 37°C por 48 horas.

A partir de las muestras en agar extracto de

levadura se realizó un recuento de UFC

utilizando el software Scan® 1200 para la

determinación de la carga bacteriológica

aeróbica total presente en la carne de res.

Las placas escogidas fueron aquellas que

contenían de 30 a 300 colonias.

La determinación de mesófilos aerobios

presentes se llevó a cabo de acuerdo a las

normas establecidas por la Secretaria de

Salud de México (NOM-092-SSA1-1994,

NOM-110-SSA1-1994, NOM-213-SSA1-

2002, NOM-034-SSA1-1993, NOM-114-

SSA1-1994).


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Identificación y aislamiento. A partir del

crecimiento bacteriano en el agar EMB, se

aislaron 3 colonias diferentes para su

posterior identificación. Cada colonia se

sembró en agar Mac Conkey, agar SS y en

agar EMB por método de estría cruzada.

Se realizó tinción de Gram para su

identificación microscópica y se sometió a

pruebas bioquímicas.

Pruebas bioquímicas. En base al

diagrama de identificación de Bergey se

utilizó agar MIO (Movilidad, Indol,

Ornitina) de la marca MCD Lab y, agar

Base Urea y agar Triple Azúcar Hierro

(TSI) de la marca BD Bioxon para la

diferenciación entre E. coli y K.

pneumoniae (Bergey, 1994). En la primera

prueba se inoculó por punción y en la

segunda y tercera por cola de ratón.

RESULTADOS

La flora predominante de la carne son las

bacterias Gram negativas, seguidas de los

enterococos Gram positivos y los

lactobacilos. La microbiota general de la

carne, es reflejo del sacrificio y el medio

ambiente durante su procesamiento (Jay,

2000).

Conteo Estándar. La determinación de

unidades formadoras de colonias totales se

realizó por cuenta estándar en agar

extracto de levadura. La carne molida de

res que es empaquetada en el

establecimiento contiene casi 15 veces

más carga bacteriológica aeróbica que la

carne que llega ya empaquetada para su

venta al público (Gráfica 1).

GRÁFICA 1. CUENTA ESTÁNDAR.

A) Recuento promedio de la carga bacteriológica

aerobia en la carne molida de res empaquetada en

el establecimiento: 6.76x104UFC/g.

B) Recuento promedio de la carga bacteriológica

aerobia en la carne molida de res pre-empaquetada:

4.6x103 UFC/g.

Presencia de carga bacteriológica

patógena. Se encontró presencia de

microorganismos en las placas de agar

EMB inoculadas con la muestra de la carne

105

65

336 1 0 0

A

55

121 2 6 0 0

B


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de res empaquetada por el personal del

establecimiento.

Se obtuvieron 3 tipos de colonias

diferentes en las placas de agar EMB.

Cada colonia, según sus características,

recibió un código de identificación. A las

colonias grandes, con centro obscuro y

halo rosa se les marcó con la clave M1; las

colonias rosas con centro color rosa claro

se les marcó con la clave R1 y a las

colonias rosas con centro rosa obscuro se

les marcó con la clave R01 (Figura 1).

FIGURA 1. COLONIAS OBTENIDAS EN AGAR

EMB.

Colonias obtenidas de la muestra de carne molida

de res empaquetada en el establecimiento en agar

EMB, previa a su identificación y aislamiento.

M1: Colonias con centro obscuro y halo rosa.

R1: Colonias rosas con centro rosa claro.

R01: Colonias rosas con centro rosa obscuro.

Dichas colonias, se aislaron en agar EMB,

SS y Mac Conkey para su siguiente

identificación.

Identificación de microorganismos. La

comparación de las colonias de los

cultivos puros en agar Mac Conkey y

EMB, así como los resultados obtenidos en

las pruebas bioquímicas, permitieron

identificar la presencia de Escherichia coli

y Shigella sp (Tabla 1 y Figura 2).

El análisis microscópico de las colonias

permitió identificarlas como bacilos Gram

negativos, ya que ambas, al ser

enterobacterias, comparten estas

características (Figura 3).

No obstante, también se realizaron pruebas

bioquímicas para corroborar los resultados

obtenidos. Las pruebas en agar TSI, MIO

y Urea fueron positivos para E. coli y

Shigella, confirmando los resultados

obtenidos en la primera prueba. Las

colonias marcadas con el código M1 y R01

fueron identificadas como E. coli y las

marcadas con el código R1 como Shigella

sp (Tabla 2).

M1 R1 R01


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Código Mac

Conkey

EMB SS

M1 Forma:

redonda

Elevación:

Cóncava

Color:

Rosa

Borde:

Entero

Forma:

redonda

Elevación:

Cóncava

Color:

Negro

metálico

Borde:

Entero

Forma:

redonda

Elevación:

Cóncava

Color: Rojo

Borde:

Entero

R1 Forma:

redonda

Elevación:

Cóncava

Color:

Incoloro,

Medio

ámbar

Borde:

redondo

_____ Forma:

redonda

Elevación:

Cóncava

Color: Rojo

Borde:

Entero

Crecimiento:

Leve

R01 Forma:

redonda

Elevación:

Cóncava

Color:

Rosa

Borde:

Entero

Forma:

redonda

Elevación:

Cóncava

Color:

Verde

metálico

Borde:

Entero

Forma:

redonda

Elevación:

Cóncava

Color: Rojo

Borde:

Entero

TABLA 1. MORFOLOGÍA COLONIAL

Características de las colonias obtenidas del

aislamiento de microorganismos presentes en la

carne de res empaquetada en el establecimiento.

Las colonias negro o verde metálico son

características de E. coli en agar EMB. Las colonias

incoloras en agar Mac Conkey y el cambio del

color del medio de incoloro a ámbar son

características de Shigella sp.

Figura 2. Morfología colonial de E. coli y

Shigella sp.

Lado izquierdo: Agar EMB con colonias obscuras

con brillo metálico características de E. coli.

Lado derecho: Agar Mac Conkey de incoloro a

ámbar con colonias incoloras características de

Shigella sp.

__________________________________________________

FIGURA 3. MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA.

Al pertenecer al orden Enterobacteriales y a la

única familia Enterobacteriaceae, comparten la

característica de ser bacterias Gram negativas, y en

su mayoría bacilos. En las fotos superiores, se

observa la misma morfología bacilar y tinción

Gram negativa de las 3 colonias diferentes.

M1 R1

R01

E. coli Shigella sp


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Prueba M1 R1 R01

MIO

Movilidad + - +

Indol*

Ornitina + - +

Urea - - -

TSI

Pico/Fondo A/A K/A A/A

Producción de gas - - -

Producción de ácido

sulfhídrico

- - -

TABLA 2. PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Resultados de las pruebas bioquímicas realizadas

a las 3 colonias encontradas para la confirmación

de la identificación de E. coli y Shigella sp.

A/A: ácido-ácido

K/A: alcalino-ácido

* Las pruebas de Indol no se realizaron debido a

la falta del Reactivo de Kovac. Sin embargo lo

que se esperaría de los resultados es que fueran

positivos para E. coli y mixtas, positivo y

negativo, para Shigella sp.

DISCUSIÓN

La carne es un alimento susceptible a la

contaminación ya que su alto contenido de

agua y nutrientes favorece el crecimiento

de microorganismos patógenos causantes

de enfermedades gastrointestinales. Para

evitar que los alimentos contaminados

lleguen a manos de la población, la

Secretaría de Salud dispone de ciertas

normas de seguridad y manejo de

alimentos para evitar las grandes pérdidas

sociales y económicas debidas a la

inadecuada manipulación de los productos

alimenticios.

La Norma Oficial Mexicana NOM-034-

SSA1-1993, Bienes y servicios. Productos

de la carne. Carne molida y carne molida

moldeada. Envasadas. Especificaciones

Sanitarias (Secretaría de Salud, 1995)

especifica que Salmonella spp en 30g debe

estar ausente. A partir de esto, podemos

concluir que ambas muestras cumplen con

la especificación de la ausencia de

Salmonella spp, sin embargo, la norma

específica que el límite máximo de

mesófilos aerobios para la carne molida es

de 5x106 UFC/g.

La carga bacteriológica aeróbica

encontrada en la carne que llega al punto

de venta ya empaquetada presenta un

número bastante inferior al límite

establecido de microrganismos mesófilos

aerobios lo cual es debido a su correcta

congelación y a los aditivos agregados

para inhibir el crecimiento microbiano.

La carne que es manipulada en el

establecimiento para su empaquetamiento

y venta, presenta casi 15 veces más

microorganismos que la pre-empaquetada,

sin embargo no se sale de la norma.


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El aumento considerable de UFC/g

aumenta considerablemente la

probabilidad de encontrar

microorganismos patógenos,

disminuyendo la calidad sanitaria de la

carne e incrementando el riesgo de padecer

enfermedades gastrointestinales, que

dependiendo del grupo etario y nivel

socioeconómico, pueden representar

grandes pérdidas sociales y económicas

para el Sistema de Salud Pública.

En un estudio de tesis similar (Rojas,

2000), no se encontró presencia de

Shigella sp en el 100% de las muestras, y

E. coli estuvo presente en el 76% de las

muestras. Además el recuento de

mesófilos aerobios fue alto, aunque sólo

dos muestras de 88 sobrepasaron el límite

establecido por la Secretaría de Salud. Por

lo tanto, concluimos que la presencia de

Shigella sp es debido a una contaminación

previa al empaquetado por el inadecuado

aseo ya sea de las instalaciones o del

personal que está en contacto con la carne.

Por otra parte, podría ser que el número

inicial de microorganismos se

incrementara durante su proceso ya que,

alimentos como la carne molida pueden

contaminarse rápidamente durante su

elaboración por la microbiota basal de la

piel y pelos (Jackson, Acuff, & Dickson,

1997), así como la contaminación cruzada

por los aparatos que se utilizan para su

procesamiento, corte, empaque y la

manipulación suplementaria que requiera.

Además, debemos recordar que tanto la

carne como los jugos cárnicos expulsados

durante su procesamiento son medios ricos

que favorecen la proliferación de las

bacterias (Banwart, 1982).

CONCLUSIONES

Se concluyó que la calidad sanitaria de la

carne molida de res expendida en el

supermercado, tanto pre-empaquetada

como la que es empaquetada en el punto

de venta, se encuentra dentro de las

regulaciones sanitarias establecidas por la

NOM-034-SSA1-1993.

Se cumplió parcialmente el objetivo de la

investigación pues se logró determinar la

presencia y cantidad de microorganismos

mesófilos aerobios, Shigella sp y

Escherichia coli presentes en carne molida

de res que se expende en el Área

Metropolitana de Puebla, pero no se

encontró la presencia de Klebsiella

pneumoniae y Salmonella spp.

La ausencia de Klebsiella podría ser

explicada por la añadidura de bacterias

ácido lácticas como Lactobacillus

acidophilus y Staphylococcus carnosus,


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las cuales inhiben el crecimiento de

bacterias como Pseudomonas

aureuginosa, Yersinia enterocolitica,

Proteus vulgaris, entre otras (Jurado

Gámez, Montalvo Rodríguez, Ramírez

Toro, & Bolívar, 2011).

La importancia de este proyecto en el área

de la Biotecnología radica en que la

determinación de la presencia de

enterobacterias patógenas en los alimentos

de mayor consumo humano es un

indicador de salud pública, pues las

enfermedades diarreicas agudas

prevalecen en el 11.0% de los niños

menores de 5 años (Secretaría de Salud ,

2012) pudiendo terminar en muerte por

deshidratación.

Como Biotecnólogos comprometidos con

la sociedad, es nuestra responsabilidad

utilizar nuestros conocimientos y destrezas

para elaborar soluciones a estas

problemáticas, de una manera económica,

viable y sustentable.

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de los Alimentos. España, España: Ed.

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Jay, J. (2000). Microorganisms in foods. En

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sanitarias. Métodos de prueba. Recuperado el

2014, de


13ssa102.html


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ANEXO

Diagrama General de trabajo Muestra de 25

gramos de carne de res molida

Agregar 225 ml de agua estéril

en una bolsa esteril

Homogeneizar en BagMixer® por 5 intervalos de 1

minuto

Realizar 7 diluciones seriadas en

relación 1:10

Sembrar en Agar Triptona extracto de Levadura por

Miles & Misra en duplicado

Incubar a 37 °C por 48 horas

Conteo de UFC y reporte de resultados

Objetivo: Presencia de

mesófilos aerobios

Sembrar en Agar EMB por Miles

& Misra en duplicado


Aislamiento de colonias en

medio SS, Mac Conkey y EMB.

Reporte de resultados

Objetivo: Presencia de E. coli, Shigella y

Klebsiella

Pruebas bioquímicas en

medio MIO, Agar Base Urea y Agar Triple Azúcar Hierro


Objetivo: Presencia de E. coli, Shigella y

Klebsiella

Sembrar en Agar SS por Miles &

Misra en duplicado



Objetivo: Presencia de Salmonella

Sembrar en Agar Nuritivo por

Miles & Misra en duplicado



Objetivo: Control