Antikanser Terapi için

Hedef;

Protein Fosfataz 2A

M.Sc. Hilal ŞAHİNİÜ.CTF. Tıbbi Biyoloji AD-2013

Hücre sağkalımını; büyümeyi sağlayan faktörlerle ve

bununla birlikte DNA hasarı, oksidatif stres ve yaşlanmaya

karşı cevap oluşturarak yapar.

Bu cevap; hücre senesensini ve apoptozu uyararak

kontrolsüz çoğalmayı engelleyen sinyal iletimleri ile hücre

homeostazını sağlanmasıyla olur.

Bu esnada hücre-hücre ve hücre-mikroçevre etkileşimi

korunur.

Giriş;

Kanser hücreleri;

tümör baskılayıcı gen fonksiyonlarının kaybı,

kontrolsüz proto-onkogen ekspresyonları veya

aktiviteleri ile karakterizedir.

En yaygın onkogenler; Protein kinazlar (örn SRC, ABL1)

olup downstream kinazları (örn; RAF’ın RAS aktivasyonu),

transkripsiyon faktörlerini (örn c-MYC, RUNX1, HOX) ve

antiapoptotik genleri (örn BCL2) aktive ederler.

Giriş;

Tümör baskılayıcı genler;

proto-onkogenlerin aktivitesini, hücre büyümesini

sınırlayarak ve apoptozu ya da DNA onarımını (örn

TP53,

Rb1, Apc, Atm) uyararak dengelerler.

Pek çok kanserde uyarıcı sinyaller; serin, treonin ve

tirozin fosforilasyonunu içerir.

Protein fosforilasyonu, hücre proliferasyonu ve

farklılaşması gibi olayları kontrol eden sinyal iletim

sistemlerinin temel sürecidir.

Kinazlar ve fosfatazlar hücrenin protein fosfatlanması

durumunu yönetirler , bu da hücre bölünmesi ve

büyümesi gibi temel biyolojik olayları düzenler.

Hücrenin fosforilasyon basamağında dengenin bir tarafında

bulunan defosforilasyon reaksiyonunu yöneten enzimler,

substrat proteinleri olarak etkisini gösterdikleri

aminoasitlere göre;

• serin/treonin fosfatazlar ve

• tirozin fosfatazlar olarak gruplanmakta

Memeli hücrelerinin serin/treonin protein fosfataz katalitik

subuniteleri 4 formdan oluşmaktadır;

protein fosfataz 1 (PP1), protein fosfataz 2A (PP2A), protein

fosfataz 2B (PP2B, kalsinörin) ve protein fosfataz 2C (PP2C).

Normal hücrelerde fosforegülasyon protein kinaz

ve fosfatazlar ile kontrol edilir.

Bu dengenin bozulması hücrelerin kendi kendini

sınırlayan sinyallerden kaçmasına neden olur.

Sonuç olarak; malignant transformasyon ortaya

çıkar.

Kinaz Güdümlü Malignensi

Protein kinazın kontrolsüz aktivitesiyle oluşan

malignensiye en iyi tanımlanmış örnek KML’ dir

t(9;22)(q34;q11) ile karakterizedir.

KML; Normal miyeloid

hücrelerin birikiminin

gözlemlendiği

miyeloproliferatif bir

hastalıktır.

KML’de klinik olarak 2 faz gözlenir;

1) uzun süreli kronik faz (CML-CP, ortalama 5 yıl)

BCR-ABL1 ekspresyonu hücre sağkalımının artması ve farklılaşabilen

hematopoetik progenitör hücrelerin büyümesi için yeterlidir.

BCR-ABL1 kemik iliği mikroçevresinden bağımsız olarak

proliferasyon ve sağkalımı sağlayan kompleks sinyal yolakları

(örn;Ras/Raf/Mapk, PI3K/Akt, Stat5) yoluyla onkojenik aktivite ortaya

koyarlar.

2) miyeloid veya lenfoid özellikli ölümcül blast krizi (CML-BC, ortalama 6

ay)

Ek genetik ve genomik aberasyonlar, artmış BCR-ABL1 aktivitesi ile

karakterize

KML-CP’ de BCR-ABL1’ in kinaz aktivitesinin rolünden

ötürü tedavide tirozin kinaz inhibitörleri kullanılır.

İmatinib mesilat (ilk geliştirilen TKI)

İmatinib direnci var ise;

Dasatinib ve nilotinib (2. jenerasyon TKI) Ponatinib (3. jenerasyon TKI)

Tümör Baskılayıcı Fosfatazlar

Sinyal yolaklarının aşırı aktivasyonuna neden olan anormal

fosforilasyonlar neoplastik transformasyon ile bağlantılıdır.

Negatif düzenlenmede ise protein fosfatazların kilit rolü

mevcuttur.

Çeşitli tümör baskılayıcı fosfatazların fonksiyonlarını

kaybetmeleri birçok kanser tipinde tespit edilmiştir.

ÖRN PTEN…

Glioblastoma, prostat ve meme kanseri, endometrial neoplaziler ve hematolojik malinitelerde inaktiftir.

PTEN’in fonksiyonu apoptozu uyarmak veya hücre büyümesini, adezyonu ve/veya migrasyonu engellemektir.

PP2A (Protein Phosfatase 2A)

Hücre döngüsü ve apoptozun düzenlenmesinde önemli rolü

vardır,

PP2A aktivitesinin engellenmesi veya bazı fonksiyonel alt

birimlerinin kaybı neoplastik transformasyon için karakteristik.

PTPN6 (SHP-1) (tirozin fosfataz)

miyeloid ve lenfoid malinitelerde tümör baskılayıcı

Kanser hücrelerinin anormal büyümesi, çeşitli

onkojenik tirozin kinazların PTPN6 ekspresyonu

üzerindeki engelleyici etkisine bağlıdır.

PP2A ve PTPN6 birbiriyle ilişkilidir

PTPN6 aktivitesinin, Ph (+) lösemilerde, PP2A

ile uyarılmış BCR-ABL1 inaktivasyonu ve

degradasyonu için gerekli olduğu bulunmuştur .

PP2A Yapısı ve Düzenlenmesi

Önemli bir hücresel serin- treonin fosfataz Çekirdek yapısı dimerik holoenzim

Yapısal A alt birimi (65kDa, PP2AA veya PR65, α ve β izoformları)

Katalitik C alt birimi (36kDa, PP2AC, α ve β izoformları)

A ve C alt birimleri her zaman ekspresse edilir

Bazen de hücre altı düzeyde lokalizasyonu ve substrat

spesifliğini belirleyen düzenleyici B alt birimi ile

ilişkilidirler

20 farklı düzenleyici alt birim tanımlanmıştır. Dolayısıyla 75 farklı PP2A holoenziminin varlığı olasıdır.

B düzenleyici alt biriminin 4 bağlantısız ailesi vardır;

1. PP2AB( B 55 veya PR 55)

2. PP2AB’ (B 56 veya PR 61)

3. PP2AB’’ (B 72 veya PR 72; B 130 veya PR 130; PR 48 ve G5 PR)

4. PP2AB’’’ (PR 93 ve PR 110)

Fosfataz aktivatörü PTPA, PP2A’ nın

AC dimeriyle etkileşir ve PP2A’ nın

inaktif formdan aktif forma geçmesini

sağlar

Perrotti D, Neviani P-2013

Bazı PP2A B alt üniteleri doku ve gelişim basamağına spesifiktir

Örneğin;

B56α ve B56γ : kalp ve iskelet kasında yüksek eks.

B56β : beyin

B55β, B55γ ve B56γ: nöral farklılaşma sırasında

B56γ : akciğer büyümesi ve gelişiminde ile ilişkili

PP2A’ nın trimerik bileşimine bağlı olarak hücre altı

düzeyde bölümlere ayrılması çeşitli hücresel olayların

düzenlenmesinde önemlidir.

Sitoplazmik PP2A hücre büyümesi ve sağkalımı kontrol

ederken,

Nükleustaki PP2A mitokondriyal membranda apoptozu

uyarır, kromozom stabilitesini ve kromatid ayrımını

etkiler.

PP2A’nın önemli görevleri vardır;

Her bir PP2A kompleksi, katalitik (C) alt ünitenin C

terminal kuyruğunun spesifik posttranslasyonel

modifikasyonları ile sıkı ve eksiksiz olarak düzenlenir.

Örn; PP2A’ nın kuaterner yapısı PP2AC’nın Tyr307 ve Thr304 fosforilasyonu

ile ayarlanabilmekte

Tyr307’nin fosforilasyonu B55 içeren PP2A kompleksinin formasyonunu

önler ve PP2Ac ile B56 alt ünitesinin etkileşimini inhibe eder.

Benzer olarak Thr304’ ün fosforilasyonu B55 alt ünitesini inhibe eder.

Her iki fosforilasyon da PP2A inaktivasyonuna neden olur.

Çeşitli faktörler PP2A kompleksine bağlanarak fosfataz

aktivitesine etki ederler

Örneğin; Viral proteinler PP2A’ yı inhibe edebilirler .

Kanserde aşırı ekspresse olduğu bilinen bazı PP2A endojen

inhibitörleri PP2A aktivitesini baskılayabilir .

PP2A’ nın Fizyolojik Fonksiyonları

Normal hücre bölünmesinde: G1-S geçişini kontrol eder

B56γ3 içeren PP2A kompleksi nükleusta birikir, metilasyon

seviyesi fazlar arası değişiklik gösterir

B55α içeren PP2A defosforilasyon yoluyla MPF’ü, ayrıca Cdk

aktive edici kinaz (CAK) ve Wee1 kinazı inhibe ederek G2’ den

M fazına geçişi engeller

B55α içeren PP2A kompleksi ayrıca mitotik ayrılmayı,

kromatin dekondenzasyonu, mitoz sonrası nüklear zar

oluşumunu ve golgiyi kontrol eder

Protein Fosfataz tip 2A haloenzimlerinin, Multipl Siklin bağımlı Kinaz ve defosfatlayan katlatmış proteinler tarafından hücre siklusu aşamalarının negatif ve pozitif düzenlenmesi (2012)

PP2A ayrıca hücre proliferasyonunu ve sağkalımı negatif

yönde düzenleyebilir

PP2A kompleksi MEK1 ve ERK ailesi kinazları defosforile edip

inaktive ederek, transkripsiyon faktörlerinin fonksiyon ve

stabilitesini azaltarak mitojenik ve antiapoptotik sinyalleri

inhibe eder.

Benzer olarak PP2A doğrudan veya dolaylı olarak EIF4E’ yi

defosforile ederek MCL1 ve c-MYC gibi onkogenlerin

translasyonunu baskılar.

AKT defosforilasyonu PI3K/AKT

Antiapoptotik BCL2 inaktivasyonu yolağı neg. düz.

Proapoptotik faktör BAD ve BIM akt. PP2A

proapoptotik akt.

PP2A bağımlı AKT inaktivasyonu ve BAD defosforilasyonu sonucu

aktive olan PP2A mitokondriyal membrana transloke olur, BCL2’ ye

bağlanarak inhibe eder.

PP2A BCL2’ nin BH4 domainine doğrudan bağlanarak onu Ser70’ den defosforile eder

Sonuç olarak BCL2-P53 etkileşimi artar ve BCL2’ nin antiapoptotik fonksiyonu engellenir.

PP2A’ nın Tümör Baskılayıcı rolü:

WNT sinyal yolağı: embriyonik gelişim, hücre büyümesi, kök

hücre sağkalımı ve kendi kendini yenilemesi

Bu yolakta β-katenin downstream etkileyicidir

PP2A’ nın bu yolak üzerinde pozitif ve negatif etkisi olduğu gösterilmiştir

Negatif düzenleme PP2A inhibisyonu sonrası β-katenin bağımlı transkripsiyonun artışıdır

Pozitif düzenleme ise B56γ-PP2A kompleksinin β-katenini destabilize etmesidir

WNT sinyal yolağına etkisi:

Perr

ott

i D

, N

evia

ni P-

20

13

PP2A ve Kanser

PP2A alt ünitelerindeki değişiklik veya fosfataz aktivitesinin kaybı kanser gelişimi ve neoplastik olmayan hastalıklar ile ilişkilidir

PP2A’nın yapısal karmaşası, fonksiyonu, düzenlenmesi, tümör baskılayıcı fonksiyonu yüksek oranda hücresel durumuna, farklı B alt ünitelerinin ve diğer bağlanma partnerlerinin ekspresyonlarına bağlıdır

PP2A’ nın düzenleyici B alt ünitesi:

kanser gelişimi ve metastaz

Melanomada B56α ve B56γ eks.larının azalması

(c-MYC aşırı eks ile ilişkili)

AML’ de B55α eks inhibe edilmesi

(artan AKT fosforilasyonu ile ilişkili)

Lüminal B meme kanserinde B55α’ nın delesyonu

PP2A’ nın A alt ünitesi (PR65):

%15 primer akciğer tümörü PR65β

%6 akciğer tümörü türevli hücre serileri mutasyonu

%15 primer kolorektal karsinoma

%13 meme kanseri

%29 hepatoselüler karsinoma Aşırı transkript

Meme, over, serviks, mide,

mesane karsinoma, melanoma PR65β lokusunun (11q23) heterozigozite kaybı

PR65β’ nın gen delesyonu veya alternatif splicingi agresif

B-KLL’ de azalmış PP2A aktivitesi ile ilişkili.

%9,1 tip 1 over tümörleri

PR65α modifikasyonu

%6,7 tip 1 uterin karsinoma

%19,2 tip 2 uterin karsinoma

%43 primer glioma

Hayvan modellerinde PR65α’ daki nokta mutasyonu

veya delesyonun akciğer kanseri riskini arttırdığı

PP2A ile etkileşen diğer faktörler:

CIP2A: PP2A ile etkileşerek aktivitesini inhibe eder

Hepatoselüler karsinoma, meme kanseri, baş-boyun

skuamöz hücre karsinoma, kolorektal kanser, seröz over

kanseri, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri,

prostat kanseri, KML ve AML’ de aşırı ekspresse edilir

ve kötü prognoza işaret eder

SET (I2PP2A) : İnhibitör fonksiyonu var

t(6;9)’ da nükleoporin NU214 (CAN) ile füzyon geni oluşturarak akut farklılaşmamış non-lenfosit lösemiye sebep olur

BCR-ABL1 pozitif lösemilerde aşırı ekspressedir

Aşırı eks. AML, primer B-KLL hücrelerinde ve B- hücre non-Hodgkin lenfoma hücre serilerinde kötü prognozludur

SET nuklear onkogeni insan natural killer hücrelerinde

tümör baskılayıcı NDKA’ nın Dnaz aktivitesini baskılar,

AP-1 aktivitesini arttırır, MAPK sinyal yolağını aktive

eder, granzim B ve interferon-γ üretimini düzenler

NK hücre aktivasyonu artan SET eks. ve PP2A

aktivitesinin inhibisyonu ile ilişkilidir

SET BP1 (SET binding protein);

SET düzenleyicisi Nükleoporin ile füzyon oluşturur

(NUP98 t(11;18)(p15;q12)’ ye sahip T-ALL pediatrik olgular)

SETBP1 %27,6 AML’ de aşırı eks. (kötü prognoz)

SETBP1 SET’ i proteaz yıkımından korur.

SET proteinin artmasını, PP2A inhibitör kompleksi olan SETBP1-SET-PP2A‘ nın formasyonunu sağlar.

KML’ de PP2A’ nın Etkisi

PP2A aktivitesinin baskılanmasının KML patogenezinde

önemi büyüktür.

PP2A aktivitesi KML-CP’ de azalır, KML-BC’ de ise ancak

ölçülebilir duruma gelir.

SET seviyesi BCR-ABL1 kinaz ve eks. bağımlı olarak KML

progresyonu süresince artar.

PP2A aktivitesinin SET down-düzenlenmesi veya PP2A aşırı

eks. yoluyla uyarılması sonucu MAPK, STAT5, JAK2 ve AKT

defosforilasyonu, c-MYC eks. azalma, proapoptotik BAD’ın

artışı ve RB’nın hipofosforilasyonu gözlenir.

PP2A’ yı Aktive Eden İlaçlar

Forskolin Forskolin Coleus forskohlii kökünden elde edilmiş bir diterpendir Andenilat siklazı uyarır ve PP2A aktivatörüdür Lösemi hücrelerinde büyümeyi engelleyip apoptozu indükler

1,9-dideoksiforskolin Adenilat siklazı uyarma fonksiyonu yoktur. PP2A aktivatörüdür.

FTY720

Günümüzde tekrarlamış multipl skleroz hastalarında

immuno-supressant olarak kullanılan oral sfingozin analoğudur

Tümör büyümesi ve anjiyogenez üzerinde inhibitör etkisi vardır

Yapılan in vitro çalışmalar;

FTY720’ nin multiple myeloma,Hepatosellüler, mesane,

meme ve prostat kanserlerinde kullanılabileceğini göstermiştir.

(BCL2’ yi engelleyerek apoptozu uyarması, ERK ve PI3K/AKT yolaklarını inhibe ederek mitojenik ve sağ kalım sinyallerini baskılaması ile)

KML ve Ph-pozitif B-ALL’ de FTY720’ nin uyardığı PP2A aktivitesi BCR-ABL1 inaktivasyonunu/degradasyonunu, sağkalım faktörlerinin de (JAK2, AKT, ERK1-2) inhibisyonunu sağlar.

Hematopoetik kök hücreler veya ex-vivo polisistemi vera progenitörleri ile yapılan in vitro ve hayvan çalışmalarında da FTY720’ nin terapötik potansiyeli gösterilmiştir.

AML hayvan modellerinde FTY720’ nin koloni oluşumunu azaltıp hastalığı baskıladığı gösterilmiştir.

Diğer PP2A’ yı Aktive Eden İlaçlar

Chloroethylnitrosourea(promethylating agent): PP2A metilasyon ve aktivasyonu üzerine melanoma hücrelerinde büyümeyi inhibe eder

α-Tocopheryl succinate: PP2A aktivasyonu sonrası kanser hücrelerinin apoptozunu uyarır

Vorinostat ve sorafenib: Gastrointestinal tümör hücrelerinin ölümü

Carnosic acid: AKT/IKK/NFκB sinyal yolaklarının PP2A ile düzenlenmesi üzerine prostat kanseri hücrelerinde apoptozun uyarılması

Methylprednisolone: PP2A düzenleyici alt biriminin eks. arttırarak lösemi hücrelerinde eksiksiz farklılaşmanın uyarılması

Ceramide: Prostat kanseri hücrelerinde PP2A bağımlı AKT defosforilasyonu yoluyla P27KIP1 indüklenerek apoptozun uyarılması

KML’ de PP2A aktivitesini sağlayan bu ilaçlarla tedavi sonucu

Apoptoz uyarılabilir Proliferasyon azaltılabilir

Koloni formasyonu bozulması sağlanabilir Tümörigenez inhibe edilebilir

Kaynaklar;

1. ‘Protein phosphatase 2A: a target for anticancer therapy’ Danilo Perrotti, Paolo Neviani- Lancet Oncol 2013; 14: e229–38

2. ’PP2A-Mediated Anticancer Therapy’ Weibo Chen, Zhongxia Wang, Chunping Jiang and Yitao Ding- Hindawi Publishing Corporation Gastroenterology Research and Practice Volume 2013

3. ’Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer’ Pieter J.A. Eichhorn, Menno P. Creyghton, René Bernards Biochimica et Biophysica Acta 1795 (2009) 1–15

4. ’PP2A: Unveiling a Reluctant Tumor Suppressor’ Marc Mumby- Cell 130, July 13, 2007 Elsevier Inc.

5. ‘Multiple pathways regulated by the tumor suppressor PP2A in transformation’ Jukka Westermarck and William C. Hahn Trends in Molecular Medicine (2008) Vol.14 No.4

6. ‘PP2A holoenzymes negatively and positively regulate cell cycle progression by dephosphorylating pocket proteins and multiple CDK substrates’ Alison Kurimchak, Xavier Graña-Gene 499 (2012) 1–7

Teşekkür

Ederim