Chevaliez du hépatites 2015

Hépatite CVirus & Marqueurs

Stéphane Chevaliez

Centre National de Référencedes Hépatites Virales B, C et delta

Laboratoire de Virologie & INSERM U955Hôpital Henri Mondor

Université Paris-EstCréteil

Découverte du Virus de l’Hépatite C

From New England Journal of Medicine, 1975

Hépatite C : Virus et Marqueurs

Identification du Virus de l’Hépatite C

From Science 21 April 1989


The Global Burden of HCV Infection

• Approximately 170 million people are chronically infected with HCV

• HCV is responsible for >350,000 deaths per year worldwide- 60,000 in Europe- >7,500 in the US

• Up to 85% of HCV-infected patients are unaware of their status- 50.3% in the US- 42.6% in France (i.e., 100,000 persons)

• Less than 10% of the HCV-infected population has received treatment in the US


SVR Rates in the Past 25 Years

Heim M. Nat Rev Immunol 2013;13(7):535-42.

Hépatite C : Structure et Virologie Moléculaire

2014-2015

OutlineHépatite C : Virus et Marqueurs

I. TAXONOMIE

Virus de l’Hépatite C

• Famille : Flaviviridae

• Genre : Hepacivirus

Phylogénie de la région codant la protéine NS5BAdapted from Simmonds et al., 1999; 2001.


• Famille : Flaviviridae

• Genre : Hepacivirus

• Hôte naturel : Homme

• Tropisme : Hépatocyte

Virus de l’Hépatite CHépatite C : virus et marqueurs

Identification d’Homologues du VHC chez les Non Primates

Kapoor et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108(28):11608-13; Kapoor et al., Mbio 2013;4(2):e00216-13.

Phylogénie de la région codant RdRp (7711-8550 HCV g1a) CHV: canine hepacivirusRHV: rodent hepacivirus


II. MODÈLES EXPERIMENTAUX

Les Différents Modèles d’Etude in vitro

• cDNA développés en 1997

• Réplicons subgénomiques (1999)

• Pseudoparticules rétrovirales (HCVpp) (2003)

• Système de culture permettant le production de particules virales infectieuses (HCVcc) (2005)


Les Modèles Animaux

Tawar et al., Cell Res. 2014;24(10):1153-4.


III. ORGANISATIONS STRUCTURALE & GENOMIQUE

Organisation StructuraleHépatite C : Virus et Marqueurs

Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.

Densité des Particules Circulantes

Lindenbach BD. Curr Top Microbiol Immunol 2013;369:199-218.


The “Lipidome“ of HCVcc Particles

Merz et al., J Biol Chem 2011;286(4):3018-32.

LPC: lysophosphotidylserineCE: cholestery esterChol: cholesterolPI: phosphatidylinositolPS: phosphatidylserinePE: phosphatidylethanolamineSM: shingomyelinPC: phospahtidylcholinePG: phosphatidylglycerol

Total lipid profile Phospholipid profile


Organisation StructuraleHépatite C : Virus et Marqueurs

Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700; Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.

Organisation Génomique des Flaviviridae


0 1800 3600 5400 7200 9000 10800

C 4Ap7 NS5BNS5ANS4BNS3NS2E2E15’UTR 3’UTR

Hepatitis C virus

Npr

o

C E1 E2E0 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B4Ap7

5’UTR 3’UTR

Pestivirus

C prM E NS1 2A 2B NS3 NS5NS4A 4BCap5’UTR 3’UTR

Yellow fever virus

Organisation GénomiqueHépatite C : Virus et Marqueurs

Scheel TK, Rice CM. Nat Med 2013;19(7):837-49.

Structure de l’IRESHépatite C : Virus et Marqueurs

“Pseudoknot domain“

Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.

Crystal Structure of the Full HCV IRES


Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.

MicroRNA (miR)-122 et Infection VHCHépatite C : Virus et Marqueurs

• Expression abondante et spécifique du foie

• Interaction avec la région 5’NC du génome viral

– 2 sites au niveau du domaine I

• Favorise la stabilité de l’ARNm viral

miR-122 : Cible Thérapeutique ?Hépatite C : Virus et Marqueurs

Janssen et al., N Engl J Med. 2013;368(18):1685-94.

Efficacité Antivirale du Miravirsen

Janssen et al., N Engl J Med 2013;368(18):1685-94.


Pros & Cons des Antagonistes de miR-122

• Activité pangénotypique• Barrière à la résistance élevée (HTA)

• Administration parentérale• Faible taux de miR-122 dans les hépatocytes a

été associé au développement d’HCC

Tsai et al., J Clin Invest 2012;122(8):2884-97; Wilson et al., Curr Opin Virol 2014;7C:11-18.


IV. LES DIFFÉRENTES PROTÉINES VIRALES

Protéines du VHC

Bartenschlager et al., Nature Reviews Microbiology 2013; 11, 482–496.

Assembly module Replication module


Réseaux d’InteractionsHépatite C : Virus et Marqueurs

Park et al, BMC Bioinformatics 2010, 11(Suppl 1): S23.

Protéine de Capside

• Forme mature formée de ~177 amino acides (21-kDa)

• Capacité de lier les lipides et l’ARN

• Structure tridimensionnelle non résolue

– Conformation en hélices alpha (~ 50%)

– Constituée de 2 domaines (D1 & D2)


Protéine de CapsideHépatite C : Virus et Marqueurs

Boulant et al, J Virol 2005, 79(17): 11353-11365.

Domaine d’interaction avec l’ARN viral Domaine d’interaction avec LD

Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.

VHC G1b

Glycoprotéine E2

Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.

• Protéine de fusion classe II– Hétérodimères avec E1


Kong et al,Science. 2013 Nov 29;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.


Topologie de la Protéine E2 : Domaine “Ig-like“

Structure de E2

Purple and red: Ig ß sandwichBlue: CD81 receptor binding loop

Kong et al,Science 2013;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.


Glycoprotéine E2

Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.

• Protéine de fusion classe II– Hétérodimères avec E1

• Interaction avec récepteurs membranaires– CD81– SRB-I


Étape Précoce : Entrée du VHCHépatite C : Virus et Marqueurs

Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700.

E2 : Trois Domaines Variables

• E2 contient 3 domaines très variables– HVR1– VR2– VR3

• Délétion HVR1 est non létale mais augmente la sensibilité du virus aux anticorps neutralisants


Variabilité du VHC

Magiorkinis et al., PLoS Med. 2009;6(12):e1000198.


HVR1

Région HVR1 (27 amino-acides) 80% de divergence nucléotidique entre génotypes Epitope majeur de neutralisation

Timm et al., World J Gastroenterol 2007; 13(36)4808-4817.


Transmission du VHCHépatite C : Virus et Marqueurs

6a_332b_JFH1Patient 1 (7/04)

5a_SA131b_HVR3812

S5 (7/05)Patient 3 (7/05)Patient 3 (9/05)Patient 2 (7/04)Patient 2 (9/04)Patient 3 (7/04)S4 (6/05)S3 (6/05)S2 (6/05)Patient 3 (01/05)S1 (6/05)

1a_HCT27X52a_Q2B

3a_CB1a_HCT18X5

Patient 61b_AWV2C33

Patient 8Patient 4

Patient 74a_ED43

0.2

100

Surfaces inertes

Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.

Patients VHC chroniquesSéroconversion VHC

Analyse Phylogénique

Région HVR1 (81 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot


Protéine p7Hépatite C : Virus et Marqueurs

• Viroporine dont la

structure 3D a été

récemment déterminée par

ME

• Rôle(s) in vivo ?

• Cible thérapeutique

potentielle

Luik et al., Proc Natl Acad Sci 2009, 4;106(31): 12712-6; Griffin S, Proc Natl Acad Sci 2009, 106(31): 12567-68.

Rôle in vivo ?Hépatite C : Virus et Marqueurs

Scheel TK, Rice CM. Nat Med 2013;19(7):837-49.

Activité Antivirale du BIT225Hépatite C : Virus et Marqueurs

• IC50 de 314 nM dans le modèle du BVDV

• Activité synergique

Luscombe et al., Antiviral Res 2010;86(2):144-53.

Activité Antivirale in vivo• Phase II

- Patients VHC (G1a, G1b, G3)- Patients VIH (inhibiteur de Vpu)- Patients coinfectés

• Activité antivirale chez les patients G1 naïfs de traitement- 200 à 400 mg en combinaison avec SOC pendant 4

semaines suivi de la bithérapie pendant 44 semaines

Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.


Taux de Réponses Virologiques

• Futurs développements– Génotypes 1 & 3– 3 mois de traitement en association à pegIFN/RBV– Evaluation de l’efficacité en association à d’autres

DAA

Treatment EVR (%) SVR % (n/N)

200 mg BIT225+ pegIFN/RBV 88 88

400 mg BIT225+ pegIFN/RBV 86 100 (7/7)

pegIFN/RBV 63 75 (6/8)

Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.

Hépatite C : Structure et Virologie Moléculaire

Protéine NS2Hépatite C : Virus et Marqueurs

• NS2 (région N-ter)– Rôle dans l’organisation

de la formation des

nucléocapsides

• NS2pro (région C-ter)

Jirasko et al., PLoS pathog 2010;6(12): e1001233; Ivo et al., Nature 2006, 442: 831-835.

Protéine NS3-4AHépatite C : Virus et Marqueurs

Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.

Inhibition de la Production d’IFN par NS3


Rehermann B., J Clin Invest 2009;119(7):1745-54.

Cycle Viral du VHC & Cibles des DAAsHépatite C : Virus et Marqueurs

Lange et al., EMBO Mol Med 2014;6(1):4-15.

Protéase NS3Hépatite C : Virus et Marqueurs

Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.

TelaprevirHépatite C : Virus et Marqueurs

Kieffer et al. Hepatology 2007;46:631-639.

Telaprevir Dosing Telaprevir Dosing

0

2

4

6

8

0

2

4

6

8

Log 10

HCV

RN

A (I

U/m

L)

Log 10

HCV

RN

A (I

U/m

L)

HCV RNA (>100 IU/mL)Wild typeT54AV36A/M

R155K/T36/155A156V/T36/156

Days Days

Patient 1002Patient 1018

LODLOD

1 14 1 14

Schinazi et al., Liver Int 2014;34 Suppl 1:69-78.

Caractéristiques des IP

DAA

PI 1st generation

PI 2nd generation

NS5A Inh. 1st generation

NS5A Inh. 2nd generation

NS5Bnucleos(t)ide

inh.

NS5B non nucleos(t)ide

inh.

Efficacy

Resistance profile

Pangenotypic efficacy

Adverse events

Drug-drug interaction

Good profile Average profile least favorable profile


Telaprevir Approved First generation

Boceprevir Approved First generation

Simeprevir Approved Second wave

Faldaprevir (BI1335) Phase 3 Second wave

Asunaprevir Phase 3 Second wave

ABT450/r Phase 3 Second wave

Sovaprevir Clinical hold Second wave

Vedroprevir Phase 2 Second wave

IDX-320 Phase 2 Second wave

Vaniprevir Phase 3 (Japan) Second wave

Danoprevir Phase 2 Second wave

MK-5172 Phase 3 Second generation

ACH-2684 Phase 2 Second generation

Inhibiteurs de Protéase

Pawlotsky JM., Gastroenterology 2014;146(5):1176-92.


• Protéine essentielle à la formation des complexes de réplication

• Phosphoprotéine régulée par PI4KIII alpha (enzyme localisé au niveau du RE)– P56 et p58 (forme hyperphosphoryléee)

• Formée de 3 domaines

• Cible d’inhibiteurs spécifiques

Protéine NS5AHépatite C : Virus et Marqueurs

Reiss et al., PLoS Pathog. 2013 May;9(5):e1003359.

Protéine NS5AHépatite C : Virus et Marqueurs

RNA binding groove

Tellinghuisen et al., Nature 2005;435(7040):374-9.

Cycle Viral du VHC & Cibles des DAAsHépatite C : virus et marqueurs

Lange et al., EMBO Mol Med 2014;6(1):4-15.


Caractéristiques des anti-NS5A

DAA

PI 1st generation

PI 2nd generation



NS5Bnucleos(t)ide

inh.


inh.

Efficacy

Resistance profile


Adverse events




Daclatasvir Phase 3 First generation

Ledipasvir (GS-5885) Phase 3 First generation

Ombitasvir (ABT-267) Phase 3 First generation

ACH-2928 Phase 2 First generation

PPI-668 Phase 2 First generation

GSK 2336805 Phase 2 First generation

BMS 824393 Phase 2 First generation

Samatasvir Phase 2 First generation

AD4025 Phase 1b ?

MK-8742 Phase 2 Second generation

ACH-3102 Phase 2 Second generation

GS-5816 Phase 2 Second generation

Inhibiteurs de NS5A

Link et al,. J Med Chem. 2014;57(5):2033-46; Degoey et al., J Med Chem 2014;57(5):2047-57; Ivachtchenko et al., J Med Chem 2014 Sep 9. Pawlotsky JM., Gastroenterology 2014;146(5):1176-92.


Mécanismes d’Action des anti-NS5AHépatite C : Virus et Marqueurs

Eyre NS, Beard MR. Gastroenterology. 2014;147(5):959-62.

Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999, 7: 1417-1426.

Protéine NS5B: RdRpHépatite C : Virus et Marqueurs

Réplication

– Modèle du poliovirus. Virus à ARN monocaténaire de polarité positive

De Clercq., Nature Review Drug Discovery 2007; 6: 1001-18.

Réplication ViraleHépatite C : Virus et Marqueurs

Variabilité Génétique

• Erreurs au cours de la réplication– Fréquentes

. 10-4-10-5 mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC

– Spontanées– Au hasard

• Absence d’activité exonucléasique 3’⇒5’ ("proofreading")– Accumulation de mutations

• A l’origine de : – La diversification des types et des sous-types– La distribution en quasi-espèces


Diversification des Génotypes

Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.


4

1

5a

3

2

6

7a

Distribution des Génotypes

Manns and von Hahn., Nat Rev Drug Discov 2013;12(8):595-610.

Hépatite C : Virus et Structure

Répartition des Génotypes en France

61%9%

19%

9% 2%

Génotype 1 (n=961)

Génotype 5 (n=29)

Génotype 4 (n=144)

Génotype 2 (n=137)

Génotype 3 (n=293)

Génotypes6 (n=10)

0,6%

Brouard et al., J Hepatol 2009, 50(Supl. 1): S148 (abstract 390).


Distribution en Quasi-espèceHépatite C : Virus et Marqueurs

Domingo E., Cell 1978, 13 (4):735-744.

Quasi-espèces

• Décrites pour la première fois en 1978 par Domingo et coll– Bactériophage Qβ

• Evolution Darwinienne– Génération de mutants compétition

avantages aux variants les plus “fit“

Domingo et al., Cell 1978;13(4):735-44; Domingo et al., Microbiol Mol Biol Rev 2012;76(2):159-216.


“Last but not Least“Hépatite C : Virus et Marqueurs

Consequence of Genetic Bottleneck

Domingo et al., Microbiol Mol Biol Rev 2012;76(2):159-216.


Inhibitors of RdRp

Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA

Site A (Thumb/fingertips)

Site B (Thumb)

Site C (Palm)

Site ActifSite D (Palm)

AA

BBCC

DD

EE


Caractéristiques des anti-NS5B


DAA

PI 1st generation

PI 2nd generation



NS5Bnucleos(t)ide

inh.


inh.

Efficacy

Resistance profile


Adverse events




Sofosbuvir Approved Nuc

VX-135 Partial clinical hold Nuc

Deleobuvir Phase 2 NNuc

BMS-791325 Phase 2 NNuc

TMC-647055 Phase 2 NNuc

Lomibuvir Phase 2 NNuc

GS-9669 Phase 2 NNuc

ABT-333 Phase 3 NNuc

ABT-072 Phase 2 NNuc

Setrobuvir Phase 2 NNuc

Inhibiteurs de NS5B

Pawlotsky et al., Seminars in Liver Disease, in press.


0

1

2

3

4

5

6

7

-15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Days

HCV

RN

A (L

og IU

/mL)

TMA + + + + - - - - - - - - + +

LOQ (20 IU/mL)

MK-0608 at 1mg.kg-1 orally

- 4,6 - 4,1

wt S282R/T/I wt S282

Activité Antivirale du MK-0608Hépatite C : Virus et Marqueurs

Efficacité de la Combinaison Paritaprevir/r (ABT-450/r), Ombitasvir (ABT-267) et Dasabuvir (ABT-333) ±RBV

Population Treatment groups SVR12 rates (n/N)

PEARL-IIG1b

Treatment-exp.AbbVie regimen+RBV 12 wks

AbbVie regimen 12 wks97% (85/88)

100% (91/91)

PEARL-IIIG1b

Treatment-naïveAbbVie regimen+RBV 12 wks

AbbVie regimen 12 wks99% (209/210)99% (207/209)

PEARL-IVG1a

Treatment-naïveAbbVie regimen+RBV 12 wks

AbbVie regimen 12 wks97% (97/100)

90% (185/205)

TURQUOISE-IIG1

Treatment-naïve & -exp. with cirrhosis

AbbVie regimen+RBV 12 wksAbbVie regimen 24 wks

92% (191/208)96% (165/172)

SAPPHIRE-IG1

Treatment-naïveAbbVie regimen+RBV 12 wks 96% (455/473)

SAPPHIRE-IIG1

Treatment-exp.AbbVie regimen+RBV 12 wks 96% (286/297)

Andreone et al., Gastroenterology 2014 May 9; Ferenci et al., N Engl J Med 2014 May 22;370(21):1983-92; Poordad et al., N Engl J Med 2014;370(21):1973-82; Feld et al., N Engl J Med 2014;370(17):1594-603; Zeuzem et al., N Engl J Med 2014;370(17):1604-14.


Efficacité du SOF-LDV (FDC) ±RBV

Population Treatment groups SVR12 rates (n/N)

ION-1G1

Treatment-naive

SOF+LDV 12 wksSOF+LDV+RBV 12 wks


99% (211/214)97% (211/217)98% (212/217)99% (215/217)

ION-2G1

Treatment experienced



94% (102/109)96% (107/111)99% (108/109)99% (110/111)

ION-3G1

Treatment-naive

SSOF+LDV 8 wksSOF+LDV+RBV 8 wks

SOF+LDV 12 wks

94% (202/215)93% (201/216)95% (206/216)

Afdhal et al., N Engl J Med 2014;370(20):1889-98; Afdhal et al., N Engl J Med 2014;370(16):1483-93; Kowdley et al. N Engl J Med 2014;370(20):1879-88.


V. CYCLE VIRAL

Cycle Viral

deLemos & Chung., Trends Mol Med 2014;20(6):315-21.


HCV Entry

Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.


Réplication du VHC

• Mécanismes moléculaires encore mal connus

• Localisation cytoplasmique au sein de complexes de réplication (membranous web)– NS4B, NS5A, NS34A et NS5B (RdRp)– Association étroite avec des facteurs cellulaires


"Membranous Web"

Paul et al., J Virol 2013;87(19):10612-27.


Modèle de Réplication du VHC

• Selon modèle des virus à ARN ss polarité positive (exemple du PV)

Ding., Nature Reviews Immunolog, 2010; 10: 632-644.


Assemblage & Sécrétion du VHC

Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.


Hépatite CStratégie Diagnostique & Suivi

Virologique

Stéphane Chevaliez

Centre National de Référencedes Hépatites Virales B, C et delta

Laboratoire de Virologie & INSERM U955Hôpital Henri Mondor

Université Paris-EstCréteil

Marqueurs indirects

Anticorps anti-VHC totaux

Marqueurs directs

Ag de capside (AgC)

ARN VHC

Génotype VHC

Profil de résistance

Marqueurs VirologiquesStratégie diagnostique & suivi virologique

Tests Sérologiques

• Détection of des anticorps anti-VHC par EIA de 3ème génération

• Tests “Combo”– Détection simultanée de l’AgC et des anticorps anti-VHC

• TROD (test rapide d’orientation diagnostique)

• Détection et quantification de l’antigène de capside (AgC)

Stratégie diagnostique & suivi virologique

Détection des Anticorps Anti-VHC

• Diagnostic de l’infection par le VHC– Trousses commerciales– Faciles à utiliser, automatisées– A l’aide d’un test de 3ème génération

. ADVIA Centaur (Siemens)

. VITROS ECi (Ortho-Clinical Diagnostic)

. AXSYM HCV 3.0 (Abbott)

. Cobas Elecsys Modular HCV (Roche)

. INNOTEST HCV Ab IV (Innogenetics)

. Monolisa anti-HCV Plus version 2 (Bio-Rad)


Test “Combo“ (AgC/Anti-VHC)

• Diagnostic de l’infection par le VHC– Trousses commerciales (2 trousues disponibles)– Faciles à utiliser– Non automatisées– Diminution de la fenêtre sérologique d’environ

20-30 jours– Moins sensibles que les tests de 3ème génération

pour la détection des anticorps anti-VHC


Tests rapides Disposant d’un Marquage CE/IVD ou OMS pour la Détection des Ab anti-VHC

Oraquick® HCV

Toyo® HCV

Labmen® HCV

Multisure HCV

Signal HCV v2.0

HCV TriDot 4th

Manufacturer Orasure Turklab Turklab MP Diagnostics

Span Diagnostics

J Mitra & Co

Specimen type

oral fluid,whole blood, serum, plasma

whole blood, serum, plasma



serum, plasma

serum, plasma

Volume required (µL)

40 (oral fluid)20

30 10 25 100One drop (35 µL)

Time to read (min)

20 15 15 15 10 3


Tests rapides “en cours de Marquage CE/IVD“ pour la Détection des Ab anti-VHC

Assure® HCVFirst Response®

HCV

Manufacturer MP DiagnosticsPremier Medical Corporation Ltd

Specimen typewhole blood, serum, plasma

whole blood,serum, plasma

Volume required (µL) 50 One drop (35 µL)

Time to read (min) 15 20


Performances des Tests rapides pour la Détection des Ab anti-VHC

Spécificité Sensibilité VPP VPN

Sang total capillaire

OraQuick® HCV Rapid Ab Test

100% 99,4% 100% 98,4%

TOYO® anti-HCV test 98,2% 96,2% 99,0% 93,1%

Labmen® HCV test 100% 62,7% 100% 49,6%

Liquide craviculaire


100% 98,2% 100% 96,6%

Chevaliez S, et al., article soumis.


Performances des Tests rapides pour la Détection des Ab anti-VHC

Spécificité Sensibilité VPP VPN

Sang total veineux


100 98,7 100 98,1

Assure® anti-HCV 100 94,9 100 93,0

First Response HCV 100 96,2 100 94,6

Multisure HCV 100 96,2 100 94,6

Chevaliez S, et al., unpublished results.


Antigène de Capside : un Marqueur de la Réplication

0 2 4 6 80

2

4

6

8

HCVRNAlevelm2000 (LogIU/mL)

HCV

coreAglevel(Logfmol/L)

r=0.89;p<0.0001

0 2 4 6 80

2

4

6

8

HCVRNAlevel CAP/CTM v2.0 (LogIU/mL)

HCV

coreAglevel(Logfmol/L)

r=0.88;p<0.0001

Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.


Antigène de Capside en Fonction des Génotypes

Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.


Quantification de l’AgC à partir de Sang Total Déposé sur DBS


0 2 4 60

2

4

6

Core antigen level in serum withthe Architect HCV Ag assay (Log fmol/L)

Co

re a

nti

ge

n le

ve

l in

wh

ole

blo

od

fro

m D

BS

wit

h t

he

Arc

hit

ec

t H

CV

Ag

as

sa

y (

Lo

g f

mo

l/L)

r=0.56; p<0.0001

0 1 2 3 40

1

2

3

4

Mean of HCV core antigen level in serum and whole blood from DBS (Log fmol/L)

Dif

fre

nc

e b

etw

ee

n s

eru

m a

nd

wh

ole

blo

od

fro

m D

BS

(L

og

fm

ol/L

)

2.46

1.66

3.26

0 2 4 60

2

4

6

Core antigen level in serum withthe Architect HCV Ag assay (Log fmol/L)

Co

re a

nti

ge

n le

ve

l in

wh

ole

blo

od

fro

m D

BS

wit

h t

he

Arc

hit

ect

HC

V A

g a

ss

ay

(L

og

fm

ol/L

)

r=0.56; p<0.0001

0 1 2 3 40

1

2

3

4

Mean of HCV core antigen level in serum and whole blood from DBS (Log fmol/L)

Dif

fre

nc

e b

etw

ee

n s

eru

m a

nd

wh

ole

blo

od

fro

m D

BS

(L

og

fm

ol/L

)

2.46

1.66

3.26

Quantification de l’AgC à partir de Sang Total Déposé sur DBS


0 2 4 6 80

2

4

6

8

HCV RNA level in whole bloodfrom DBS with m2000 (Log IU/mL)

HC

V c

ore

Ag

lev

el in

wh

ole

blo

od

fro

m D

BS

(L

og

fm

ol/L

) r=0.65; p<0.0001

0 2 4 6 80

2

4

6

8

HC

V c

ore

Ag

leve

l in

wh

ole

blo

od

fro

m D

BS

(L

og

fm

ol/L

)

HCV RNA level in whole bloodfrom DBS with CAP/CTM96 v2.0 (Log IU/mL)

r=0.66; p<0.0001

0 2 4 6 80

2

4

6

8

HCV RNA level in whole bloodfrom DBS with m2000 (Log IU/mL)

HC

V c

ore

Ag

lev

el in

wh

ole

blo

od

fro

m D

BS

(L

og

fm

ol/L

) r=0.65; p<0.0001

0 2 4 6 80

2

4

6

8

HC

V c

ore

Ag

leve

l in

wh

ole

blo

od

fro

m D

BS

(L

og

fm

ol/L

)HCV RNA level in whole blood

from DBS with CAP/CTM96 v2.0 (Log IU/mL)

r=0.66; p<0.0001

Intérêts Cliniques de la Quantification de l’AgC

• Diagnostic de l’infection– Trousses commerciales– Facile à utiliser, automatisé, peu coûteux (30% par

rapport à une charge virale VHC)

• Décision de traiter et suivi de l’efficacité des traitements antiviraux– Quantitatif– Alternative aux techniques de détection-quantification

de l’ARN du VHC


Performances Analytiques de la Trousse Architect (Abbott)

• Spécificité– 99,2% à 100%

• Sensibilité – 3 fmol/L (i.e ~ 500 to 3 000 UI/mL d’ARN VHC)– Tous les génotypes (excepté génotype 2)

• Intervalle de quantification– 3 à 20 000 fmol/L (≤ 7,8 Log10 UI/mL d’ARN VHC)

• Stable à 37°C pendant 96 heures

Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8; Mederacke et al., J Clin Virol 2009, 46(3): 210-5; Miedouge et al., J Clin Virol 2010, 48(1):18-21.


Trousse Architect : Monitorage des Cinétiques Virales

RVR (G1b) RVS (G1b)

Rechuteur (G1b) Non-répondeur (G1a)

Ross et al., J Clin Microbiol 2010, 48(4): 1161-8.

Core Ag

RNA


Performances de la Trousse Architect chez Différentes Populations

Mederacke et al., J Clin Virol. 2012 Feb;53(2):110-5.


Tests Moléculaires

Détermination du Génotype

Quel est le génotype du VHC ?

Détection de la résistanceDétection de la résistance

Quel type de VHC est présent ?

Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?

Tests Qualitatifs-Quantitatifs


- Identify active viral replication

- Make appropriate decisions. Shorten or extend treatment duration

. Stop treatment due to futility

Identify treatment failure and the emergence of resistance. Virological failure is associated with selection of viral

variants with reduced susceptibility to DAAs

Clinical Utility of HCV RNA Assays


Requirements for HCV RNA Assays

• Real-time-based assays with– A low lower limit of detection– A broader range of linear quantification– Identical lower limits of detection (LLOD) and

quantification (LLOQ)

• Satisfactory analytical performance, regardless of the HCV genotype


10 102 103 104 107 108

Cobas AmplicorHCV Monitor v2.0

SuperQuant

LCx HCV RNAAssay

Versant HCV RNA3.0 (bDNA)

CTM HCV test v2.0 CTM HCV test v2.0 (Roche)(Roche)

RealTiRealTimme™ HCVe™ HCV(Abbott)(Abbott)

Artus HCV QS-RGQArtus HCV QS-RGQ(Qiagen)(Qiagen)

CAP/CTM HCV test, CAP/CTM HCV test, v2.0 (Roche)v2.0 (Roche)

Versant HCV RNAVersant HCV RNA1.0 (kPCR, Siemens)1.0 (kPCR, Siemens)

105 106

Chevaliez et al., Gastroenterology 2012;142(6):1303-1313.

Intervalles de QuantificationStratégie diagnostique & suivi virologique

Quantification de l’ARN VHC (CTM v1.0)

Adapted from Chevaliez et al., Hepatology 2007;46(1): 22-31.

HCV

RN

A le

vel i

n CA

P/CT

M v

1.0

(Log

10 IU

/mL)

HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA(Log10 IU/mL)

8

7

6

5

4

3876543 876543

Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and bDNA (Log10IU/mL)

Diff

eren

ce b

etw

een

CAP/

CTM

v1.

0 an

d bD

NA

(Log

10 IU

I/m

L)

+1.5

+1.0

+0.5

0.0

-0.5

-1.5

-1.0

-0.15

+0.48

+1.11

Genotype 3 (n=29)

Genotype 2 (n=27)

Genotype 1 (n=29) Genotype 4 (n=30)

Genotype 6 (n=2)

Genotype 5 (n=9)


Impact de Substitutions Nucléotidiques sur la Quantification de l’ARN du VHC

Chevaliez et al., Hepatology 2009;50(5):1681.

WT G4 or WT G1A165T or G145AG145A+A165T

HCV

RN

A le

vels

(Log

10 IU

/mL)

5.76.1

6.4

4.0

6.06.7

4.3

5.96.3

<1.2

6.06.6

0

2

4

6

8

CTM v1.0 m2000RT bDNA


Quantification de l’ARN VHC G4(CAP/CTM v2.0)

HCV

RN

A le

vel i

n CA

P/CT

M v

2.0

(Log

10 IU

/mL)

HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA (Log10 IU/mL)

8

7

6

5

4

3876543 876543

Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and bDNA (Log10IU/mL)

Diff

eren

ce b

etw

een

CAP/

CTM

v1.

0 an

d bD

NA

(Log

10 IU

I/m

L)

+1.5

+1.0

+0.5

0.0

-0.5

-1.5

-1.0

+0.08

+0.35

+0.62

Genotype 4 (n=122)

Chevaliez et al., J Clin Microbiol 2013;51(4):1078-82.


Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-32.

HCV RNA Quantification(m2000, Abbott)

Genotype 3 (n=29)

Genotype 2 (n=21)

Genotype 1 (n=55) Genotype 4 (n=24)

Genotype 6 (n=3)

Genotype 5 (n=9)

876543

Mean of HCV RNA levels in m2000 and bDNA (Log10IU/mL)

Dif

fere

nce

betw

een

m20

00 a

nd b

DN

A (L

og10

IUI/

mL)

+1.5

+1.0

+0.5

0.0

-0.5

-1.5

-1.0

-0.06

+0.26

+0.58

HCV

RN

A le

vel i

n m

2000

(Log

10 IU

/mL)

HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA(Log10 IU/mL)

8

7

6

5

4

3876543


HCV RNA Level Assessment in the Era of DAA

• HCV RNA quantification should be regularly assessed before, during and after treatment

• HCV RNA quantification should be based on a real-time PCR (or TMA) assay– With results expressed in IU/mL– With identical LLOD and LLOQ, of the order of 10-15 IU/mL

• In a given patient, HCV RNA level monitoring must be performed with the same real-time assay


Europe or FDA Approval for HCV RNA Quantification Tests

• Only 2 tests are approved by the FDA and in Europe for HCV RNA quantification in clinical practice– m2000 since May 2011– New version of CAP/CTM since March 2013


Monitorage de l’Efficacité des Traitements avec DAA

Avant traitement

Au cours du traitement Après traitementFin de traitement

S2 S4 S10 S12 S24 S48 SVR12 SVR24

SOF/PR X X X

SMV/PR X X X Xa Xa

DCV/PR X X X X

SANS IFNb X X Xc Xc X XaFin de traitement en fonction si en échec d’un traitement antérieur et si oui le type de réponsebSOF+RBV; SOF+SMV±RBV; SOF+DCV±RBVcS12 ou S24 : fin de traitement selon la combinaison thérapeutique utilisée


Génotypes

Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.

4

1

5a

3

2

6

7a



• Méthodes moléculaires (genotyping)– Analyse de la séquence après séquençage direct– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des

supports solides comportant des sondes génotype spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV, Innogenetics)

– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes génotype spécifique

• Méthodes sérologiques (“serotyping”)– ELISA compétitif

Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.


Arens et al., J Clin Virol 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.

• Méthodes moléculaires (genotyping)– Analyse de la séquence après séquençage direct– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des

supports solides comportant des sondes génotype spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV, Innogenetics)

– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes génotype spécifique

• Méthodes sérologiques (“serotyping”)– ELISA compétitif



Analyse Phylogénique après Séquençage Direct

Région NS5B (286 nt)CLUSTALXDNADist (PHYLIP 3.5)Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)Neighbor-JoiningBootstraping : 1000 replicatesNJPlot

5aSA132aHCJ6

Patient 496aEUHK2 3aNLZ1

Patient 624aED431hFrSSD98

1h98CM13571h98CM1521

1cHCG91cSR0311cKhaja1

1aHCV11aHCVH

1aHCJ11jQC2

1jQC891kQC68

1kQC821eM4541N

1eCAM10781eQC172

1g13821g2152

1gEG0241lM5186N1l98CM1427

1l98CM14571fFR2Patient 59

Patient 46Patient 54Patient 2

Patient 28Patient 64Patient 16Patient 36

Patient 18Patient 17Patient 8

Patient 71bHCJ4

1bHCVBK1bHCP01

Patient 401iFR16

1iQC771iQC181Patient 48Patient 60Patient 52

Patient 261dFR17

1dHC1N161dBA107

1mGUI171mGUI11

1mGUI24

0.05

5999

96

34100

72

100

98

43

Génotype 2

Génotype 4

Génotype 3

Génotype 1

Génotype 6

Génotype 2Génotype 5

Génotype 1, sous-type b

Génotype 3, sous-type a

Génotype 1, sous-type i

Génotype 1, sous-type ?

100


Versant® HCV Genotype 2.0 Assay (INNO-LiPA)


Résumé

• Détermination du génotype (sous-type) VHC– La détermination du génotype sur la seule

région 5’NC doit être proscrite– La 2nde génération de Line Probe Assay qui utilise

des sondes dirigées contre la région core en plus de la région 5’NC est la meilleure méthode permettant de distinguer les sous-types 1a et 1b

EASL CPG., J Hepatol. 2011 Aug;55(2):245-64.


Intérêt de la Détermination du Sous-Type (1a vs 1b) ?

- Différence d’efficacité de la combinaison thérapeutique

- Profils de résistance différents en cas d’échec thérapeutique

- Influence sur la décision thérapeutique


Impact du Sous-Type sur la Barrière Génétique à la Résistance aux IP

HCV-1a prototype ...PAGHAVGIFFRAAVCTRGVAKAVDFIP...HCV-1b prototype ...-S------------------------V-...

HCV-1a AGAAAA (R155K)AGAACA (R155T)

HCV-1b CGAAAA (R155K)CGAACA (R155T)


Résistance au SMV dans les Essais• 1254 patients G1 inclus dans les phases 2b/3

(C206,C208, C216, HPC3007)– 197/1254 (15,7%) étaient en échec

% patients with mutations at time of failure not achieving SVR

Emerging mutations at time of failure

Overall 91 (180/197)

GT1a* with Q80K 93 (49/53) 84% (41/49) R155K

12% (6/49) D168E

4% (2/49) Other

GT1a* without Q80K

97 (61/63) 41% (25/61) R155K

36% (22/61) R155K in combination with mutations at 80, 122 and/or 168

23 (14/61) Other

GT1b 86 (70/81) 60% (42/70) D168V

17% (12/70) D168A, E, H, T, A/V or E/V

22% (16/70) Other


Impact du Sous-Type sur la Barrière Génétique à la Résistance aux anti-NS5A


Gao et al., Nature 2010 6;465(7294):96-100.

SMV plus PegIFN/RBV: QUEST-1 − 24-48 Weeks in Treatment-naïve G1 patients

SMV group (n=261)

Placebo group (n=130)

Week 4

<25 IU/mL (RVR) 202/254 (80%) 15/127 (12%)

<25 IU/mL 230/254 (91%) 25/127 (20%)

SVR12 210/264 (80%) 65/130 (50%)

Breakthrough 24 (9%) 44 (34%)

Relapse 21/234 (9%) 18/84 (21%)

41%With Q80K

60/146

59%Without Q80K

At baseline86/146 SVR12

31/60

Jacobson et al., Lancet 2014;384(9941):403-13.


Impact du Polymorphisme Q80K sur la Réponse au SMV plus SOF ± Ribavirin

Cohorte 1 : répondeurs nuls à la bithérapie pégylée F0-F2 (N=74)

Cohorte 2 : naïfs de traitement et répondeurs nuls à la bithérapie pégylée F3-F4 (N=40)

Lawitz et al., Lancet 2014;384(9956):1756-65.

24/27 31/31 17/17 25/26 38/40 18/18


Le Génotype du VHC Détermine l’Approche du Traitement VHC

• Siméprevir uniquement chez les patients de génotypes 1 et 4– Excepté les patients de génotype 1a avec la mutation Q80K

• Importance de la ribavirine chez les patients non cirrhotiques de génotype 1a avec la combinaison “3D“ Abbvie


Intérêt de la Détermination des Profils de Résistance ?

• Pas d’intérêt à la détermination systématique avant traitement des patients naïfs de traitement et en échec d’un traitement par bithérapie pégylée car taux de RVS élevés

• Pas d’intérêt à la détermination au moment de l’échec car la plupart des patients abritent des variants résistants

Hépatite C : Résistance au traitement

Intérêt de la Détermination des Profils de Résistance ?

• Intérêt à la détermination chez les patients en échec d’un traitement contenant un ou plusieurs DAA avant retraitement– Importance des études observationnelles

longitudinales

Hépatite C : Résistance au traitement

Health & Medicine

Chevaliez du hépatites 2015