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Cultivos fúngicos y Respuesta inmunitaria frente a Hongos patógenos.
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Universidad Nacional ExperimentalFrancisco de Miranda
Área: Ciencias de la SaludUnidad Curricular: Microbiología II
Profesor: Licdo. Jesus A. Nuñez P. Biólogo. MSc.
Santa Ana de Coro, mayo 2014
E-mail: [email protected]
PRACTICA NÚMERO 1: CULTIVOS FÚNGICOS
carbohidratoscarbohidratos
Proteínas Proteínas Lípidos Lípidos
Aminoácidos Aminoácidos
Su finalidad Su finalidad
Medios de Medios de aislamientoaislamiento
Medios Medios selectivosselectivos
selectivos selectivos diferencialesdiferenciales
Utilizados para elUtilizados para elaislamiento de levaislamiento de lev
agotamientoagotamiento
Permiten la recuperación Permiten la recuperación de un hongo en especificode un hongo en especifico
con inhibición de otrocon inhibición de otro
Adición de ciloheximidaAdición de ciloheximidainhibe al inhibe al Aspergillus Aspergillus (hongo contaminante)(hongo contaminante)
Son aquellos conSon aquellos conadición de un indicadoradición de un indicador
Los medios utilizados en Micología contiene nutrientes suficientes para Los medios utilizados en Micología contiene nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de hongos .asegurar el desarrollo de hongos .
pH ligeramente acido facilita crecimiento de hongos e inhibe a otros M.O.pH ligeramente acido facilita crecimiento de hongos e inhibe a otros M.O.
ENTRE LOS MEDIOS MAS USADOS EN ENTRE LOS MEDIOS MAS USADOS EN MICOLOGIA TENEMOS:MICOLOGIA TENEMOS:
ENTRE LOS MEDIOS MAS USADOS EN ENTRE LOS MEDIOS MAS USADOS EN MICOLOGIA TENEMOS:MICOLOGIA TENEMOS:
MEDIO MEDIO SABOURAUD SABOURAUD
DEXTROSADEXTROSA
MEDIO MEDIO SABOURAUD SABOURAUD
DEXTROSADEXTROSA
Contiene 2% de glucosaContiene 2% de glucosa
Ligeramente acidoLigeramente acido
Mantiene una amplia variedad de hongosMantiene una amplia variedad de hongos
No es un medio ideal para estudiar la No es un medio ideal para estudiar la esporulación esporulación
Indistintamente se utiliza en placas o tubos y se Indistintamente se utiliza en placas o tubos y se les puede incorporar antibióticos (gentamicina y les puede incorporar antibióticos (gentamicina y
cloranfenicol)cloranfenicol)
Contiene 2% de glucosaContiene 2% de glucosa
Ligeramente acidoLigeramente acido
Mantiene una amplia variedad de hongosMantiene una amplia variedad de hongos
No es un medio ideal para estudiar la No es un medio ideal para estudiar la esporulación esporulación
Indistintamente se utiliza en placas o tubos y se Indistintamente se utiliza en placas o tubos y se les puede incorporar antibióticos (gentamicina y les puede incorporar antibióticos (gentamicina y
cloranfenicol)cloranfenicol)
AGAR AGAR LACTRIMEL DE LACTRIMEL DE
BORELLI BORELLI
Se emplea para la producción de Se emplea para la producción de pigmentos y la esporulación de la pigmentos y la esporulación de la
mayoría de los dermatofitos mayoría de los dermatofitos
Contiene: harina de trigo, leche Contiene: harina de trigo, leche descremada en polvo, miel y ATB. descremada en polvo, miel y ATB.
Pueden cultivarse en tubos o Pueden cultivarse en tubos o placas. Placas mayor superficie pero placas. Placas mayor superficie pero
mayor riesgo de contaminación.mayor riesgo de contaminación.
CONSIDERACIONES CONSIDERACIONES
Si la muestra procede de zonas presuntamente
contaminadas
RECOMENDABLERECOMENDABLE colocar en mediosbásicos sustancias inhibitorias
Manipular los tubos y placas con
BIOSEGURIDAD?
Crecimiento de hongos Crecimiento de hongos patógenos patógenos
Condiciones de incubación
Hongos miceliales (Temp. Amb) y Levaduras (2-4 dias)
Características Macroscópicas
Características Microscópicas
TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN
COLOR
TAMAÑO DE LA COLONIA
ASPECTO
HONGO FILAMENTOSO / LEVADURIFORME
Aterciopelada, algodonosa, pulverulenta /cremosa
HIFASSEPTADASASEPTADASPRODUCCIÓNTAMAÑODISPOSICIÓN DE LAS CONIDIAS
HONGO FILAMENTOSO / LEVADURIFORME
OBSERVACIÓN DE BLASTOCONIDIAS, SEUDOHIFAS Y CLAMIDOSPORAS
Preparación en fresco
Que se necesita?Que se necesita?
Un cultivo con colonia aislada
Asa de siembra Azul de Lactofenol Porta y cubreobjetos
Esterilizo el asa de siembra frente al mechero
Selecciono la colonia (superficie)
Coloco en portaobjetos
Coloco cubreobjetos
Observo 40X.
BLASTOCONIDIAS, SEUDOHIFAS Y CLAMIDOSPORAS
PRUEBAS DIAGNÓSTICAS DE LABORATORIO
Citología
Cultivo
Examen microscópico
Pruebas cutáneas
MECANISMOS DE DEFENSA FRENTE A
HONGOS PATOGENOS
INMUNIDAD
Protección contra enfermedad, específicamente infecciosa.
Capacidad del organismo para combatir de forma específica la
enfermedad infecciosa.
Sustancias extrañas (Ag)M. O.ProteínasPolisacáridos
SISTEMA INMUNITARIOFormado por células y
moléculas responsables de la inmunidad.
RESPUESTA INMUNE
Consecuencia fisiológica o patológica.
Barrera cutáneaMocoCilios respiratoriosAcido gástrico Antagonismo bacterianoLágrimas Reacción inflamatoriaSistema de complementoFagocitos.
TIPOS DE RESPUESTA INMUNITARIA
Acción de los linfocitos T (CD4+) Citoquinas:
(IL-1…..10),TNF, IFN
Acción de los linfocitos B Anticuerpos
(Inmunoglobulinas)
INMUNIDAD NATURAL(Inespecífica)
INMUNIDAD ADQUIRIDA(Especifica)
MECANISMOS DE RESISTENCIA NATURAL A HONGOS PATÓGENOS
Barreras físicas, mecánicas y químicas
Transferrina/Metaloproteina
DEFENSA QUÍMICA
Histoplasma capsulatum Candida albicans Cryptococcus neoformans
Mecanismos de resistencia celular
EVASIÓN DE BARRERAS MECÁNICAS, FÍSICAS Y QUÍMICAS
Defensas celulares comienzan a actuar
Leucocitos polimorfonucleares (PMNL) Macrófagos
Monocitos
FAGOCÍTICAS PROFESIONALES
CÉLULAS EFECTORAS NO FAGOCÍTICAS
Asesinas naturales (NK)
TNF, IL2
RESPUESTA INMUNITARIA
CD4+
IL-12: IL-4
1 . Capacidad de Adherencia a los tejidos (adhesinas)
2 . Penetración y multiplicación en los tejidos: Enzimas Proteolíticas: Proteasas, Lipasas, Fosfolipasas. Tropismo Celular. Capacidad de Multiplicarse a 37 ºC (dimorfismo)
FACTORES DEPENDIENTES DEL HONGO
Agente Enfermedad Factor de virulencia EfectoAspergillus sp. Aspergilosis hidrofobinas Inhibición de la fagocitosis
Aspergillus sp. Aspergilosis pulmonar GliotoxinaAlteran el movimiento ciliar y lesionan el epitelio de vías respiratorias altas.
Dermatofitos Tiñas Queratinasas Destrucción del estrato córneoDermatofitos Ides Toxinas Hipersensibilidad
Cryptococcus Criptococosis CápsulaInhibición de respuesta inmune (impide migración de células de la inmunidad y propiedades antifagocíticas)
Cryptococcus Criptococosis Producción de melanina Anti-oxidante, resistencia a anfotericina B
Sporothrix spp.Esporotricosis linfangítica
Producción de melanina Inhibe la fagocitosis por macrófagos.
Mucorales Mucormicosis Ceto-reductasaDegradan los cuerpos cetónicos presentes en sangre, favoreciendo el crecimiento y diseminación del hongo.
Malassezia spp.Pitiriasis versicolor hipocrómica
Ácidos dicarboxílicos
Inhibición de la tirosinasa y de la producción de melanina conllevando una menor protección contra los rayos UV y el establecimiento de agentes microbianos dañinos.
Malassezia spp. Dermatitis seborréica FosfolipasasDestrucción de los ácidos grasos esenciales en la piel causando sequedad
Coccidioides spp. Coccidioidiomicosis Elastasas Destruyen las fibras elásticas de los tejidos.
Algunos ejemplos de factores de virulencia estudiados en hongos
INMUNOMODULACIÓN DE LOS MECANISMOS DE DEFENSA DEL HUÉSPED
Cápsula
Biosíntesis de MelaninaProducción de
Toxinas
Matriz extracelular cementante
FACTORES DEPENDIENTES DEL HUESPED
OTRAS:
Carencias nutricionales
Quemaduras
Traumatismos extensos
Irradiaciones
Alcoholismo
Toxicomanía
Uso de prótesis
Catéteres
Tratamientos con: antibióticos,
corticoesteroides, radioterapia,
inmunosupresores
Edades extremas
ENFERMEDADES: oncohematológicas, hepáticas, renales, diabetes,
infecciones virales
Genéticos Hormonales
Alteraciones Metabólicas
Transplantes y deficiencias
inmunes: HIV
FACTORES DE SUSCEPTIBILIDAD DEL HUESPED
Onicomicosis. Micetoma.
Queilitis
Coccidioidomicosis.
INMUNODIAGNOSTICO DE LAS MICOSIS
Hipersensi. Tipo I
Hipersensi. Tipo II
Hipersensi. TipoIII
Hipersensi. Tipo I
Hipersensi. Tipo II
Hipersensi. TipoIII
RETARDADA
Hipersensi. Tipo IV
RETARDADA
Hipersensi. Tipo IV
INMUNODIAGNOSTICO DE LAS MICOSIS
IDRIDR
INTRADERMOREACCIÓN
Reacción de hipersensibilidad retardada
CandidinaEsporotriquinaHistoplasminaParacoccidioidinaCoccidioidina0.1 cc de antígenos fúngicosVía intradermica48 h
INMUNIDAD CELULAR
Estudios EpidemiológicosOrientación Diagnóstica Seguimiento del curso de la enfermedad
INMUNIDAD CELULAR
1 1
2 2 2
3 3 3
4 4 4
5 5 5
666
1
Diagrama para Inmunodifusión Doble con sueros de referencia . 1,4: Suero control positivo para el antígeno a evaluar. 2,3,5 y 6: Suero de paciente. O antígeno a evaluar.
INMUNIDAD HUMORAL
Suero P
Ag Pb
Anti Pb
Prueba de inmunodifusión doblePrueba de inmunodifusión doble
INMUNIDAD HUMORAL
Suero Problema
Suero Control
Interpretación de las Pruebas de Inmunodiagnóstico Micológico
ESTUDIO
MICOLÓGICO
IDR IDD RESULTADO
Directo y cultivo:
POSITIVO
Positivo:
Estuvo en contacto con el hongo
Positivo:
Presenta anticuerpos precipitantes frente
a los antígenos fúngicos
Presenta la enfermedad
Directo y cultivo:
Positivo
Negativo:
No estuvo en contacto con el hongo o se
encuentra en estado anérgico
(inmunosuprimido).
Positivo:
Presenta anticuerpos frente a los
antígenos fúngicos
Presenta la enfermedad
Directo y cultivo:
Positivo
Positivo:
Estuvo en contacto con el hogo
Negativo:
No presenta anticuerpos frente a los
antígenos fúngicos
Estuvo expuesto al hongo. Presenta la
micosis puesto que se hizo la observación
microscópica del hongo y aislamiento del
mismo en el medio de cultivo
Directo y cultivo:
Negativo
Positivo:
Estuvo en contacto con el hogo
Negativo:
No presenta anticuerpos frente a los
antígenos fúngicos
Estuvo expuesto al hongo más no
presenta la enfermedad.
Directo y cultivo:
Negativo
Negativo:
No estuvo en contacto con el hongo o se
encuentra en estado anérgico
(inmunosuprimido).
Negativo:
No presenta anticuerpos frente a los
antígenos fúngicos
El paciente puede:
1.No presentar enfermedad micótica.
2.Estar inmunosuprimido y presentar
enfermedad por otro agente.
CORRELACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LA IDR E IDD EN EL INMUNODIAGNÓSTICO MICOLÓGICO.
Hasta la próxima clase y no se olviden de revisar el portal
web!!!!!