Objectifs de cet exposé… • à partir de l’enseignement initial de l’année dernière• Une synthèse et une approche de la physiologie immunitaire in situ du système lymphoïde avec

– un approfondissement du concept de circulat ion des cellules– des données quantitatives, des données cinétiques

• pour comprendre les différentes fonctions de surveillance immunitaire, d’amplification, de spécificité immunologique,de mémoire immunitaire,

Il y a de la vie dans un ganglion!

PhysiologieCirculations sanguine et lymphatique• Débit sanguin: volume 5.6L, 7600L par jour

pompés par le cœur, 1mn pour le tour du corps

• Volumes cellules exclues: 3L circulant, 12L interstitiel– 20 litres environ par jour seraient filtrés au

niveau capillaire, 17L retournent dans le sang, 3L renouvelant les liquides interstitiels

Organes lymphoïdes secondaires: •Le Système immunitaire est unique!Les cellules ne sont pas confinées dans un organe, elles sont en circulation continue dans l ’organisme

•les lymphocytes non seulement quittent le sang et pénètrent dans les tissus lymphoïdes (ou non)•mais aussi recirculent vers le sang via la circulation lymphatique

Evolution des concepts• on a cru longtemps que les lymphocytes étaient des

cellules nouvellement formées en permanence• J. Gowans (1957- 1964 chez le rat)

• Or, après canulation du canal thoracique… il y a perte progressive de lymphos

• Une réinjection de cellules (marquées) corrige la lymphopénie

• Et des cellules marquées sont retrouvées dans le canal thoracique

• B. Morris (1960-1970 in vivo chez le mouton) • un seul lymphatique efférent accessible chirurgicalement

drainé dans canal thoracique – [chez l’homme, les ganglions sont en chaînes]– [une autre limite, ganglion sous-cutanés seuls étudiés]

OBJECTIFS du système lymphoïde• La circulation permet la rencontre antigènes et cellules immunocompétentes:

(1) Surveil lance immunitaireLa réponse immunitaire se passe dans les

t issus!– Coopérations cellulaires: amplification (2)– Production d’effecteurs spécifiques(3)

– Anticorps spécifiques de haute affinité,

– Cellules spécifiques

– Mémoire immunitaire (4)– Réponses primaire et secondaire

– Switch et mutations somatiques

Les organes lymphoïdes secondaires

• ANATOMIE/HISTOLOGIE– Les GANGLIONS #500! filtrent la lymphe à la

recherche d ’antigènes exogènes (lymph node)– La RATE filtre le sang (Ag endogènes)– Le MALT (système lymphoïde annexé aux

muqueuses) • transcytose des antigènes via cellules

spécialisées des interfaces épithéliales muqueuses, les cellules M des plaques de PEYER

Spleen vs Lymph Node

VASCULARISATION

• Anatomie de la vascularisation sanguine et lymphatique ( chez les vertébrés)– 6 à 12 lymphatiques afférents par ganglion récupèrent les

cellules (de toutes natures) passant à travers des tissus non lymphoïdes (peau par ex)

– Une vascularisation sanguine afférente– Un lymphatique efférent (seuls les lymphocytes sortent)

• Circulation– Au moins 2 pools de lymphocytes recirculent préférentiellement

à travers• les ganglions mésentériques • les ganglions sous cutanés

– + le pool de cellules circulant à travers les autres tissus intermédiaires

Les cellules des organes lymphoïdes secondaires

• Les Lymphocytes B et T– le terme « lymphocyte » vient de lymphatiques– centrocyte, centroblaste, plasmocyte– 65% de cellules T (CD4 45% CD8 15%), 25% de cellules B

• Les CPA, « cellules présentatrices d’antigène »– Cellules dendritiques– Cellules folliculaires dendritiques (FDC)– Macrophages

• Cellules endothéliales

– + la matrice extra-cellulaire

Combien de lymphocytes entrent … et sortent des ganglions?

• un ganglion de 1 gramme = 2 109 cellules• entrée sanguine: 108 cellules par heure (1/10000 du débit

cardiaque)– 1/4 pénètre dans le tissu via les HEV (25x106 cellules/heure)

• entrée lymphatique: (10 lymphatiques = 10x106 cellules/heure)– 90% lymphocytes, 10% macrophage-like ou dendritiques– venant de tissus non-lymphoïdes où recirculent des

lymphocytes• sortie lymphatique: 30x106 cellules/heure

– 100% lymphocytes (5% fabriqués in situ, 10% de la lymphe afférente, 85% du sang afférent)

• sortie sanguine ???

dans les tissus lymphoïdes• 5 1011 cellules par jour, <2% dans le sang

(30minutes)• Pool modifié 10-50 fois par jour

HEV

• High Endothelial Venules ou veinules post-capillaires – Une morphologie distincte chez l ’homme, – L’expression de récepteurs cellulaires (adressines

vasculaires PNAd (ganglion), MAdCAM1 (muqueuses))

• difficiles à cultiver in vitro

• in vitro assays,• importantes pour la spécificité d ’organe de la migration

lymphoïde (greffes de ganglions gardant leur spécificité!)– CD22 lectin homing receptor for mucosal HEVs

Que doivent faire les cellules dans les organes lymphoïdes secondaires?• Entrer dans les ganglions

– Via les lymphatiques– Depuis le sang, via les HEV – Où? dans les zones paracorticales

• Traverser les tissus extravasculaires– y rencontrer d’autres cellules, – proliférer, – être sélectionnées, – se différencier, – mourir …

• Sortir dans la lymphe efférente

TNF, TGFβ, IL-1IL-1, IL-6, TNFGM-CSF, G-

CSF,M-CSFIL-1

IL-1

IL-8

Fibroblastes

LymphocyteT activé

Prolifération clonale : cellules T effectrices et mémoire

Prolifération clonale : plasmocytes et cellules B mémoire

Lymphocyte T

cytotoxique (CTL)

Cellule NK

Eosinophiles

Hématopoïèse

Cellules endothéliales

Neutrophiles

Lymphocyte B

Lymphocyte T

CPA

LymphocyteB activé

IL-3, IL-6IL-7, GM-CSF

IL-3, IL5

IL-2, IFNγIL-4, IL-5, IL-10

IL-6

Hypothalamus

TNF, TGFβ, IL-1

Ganglion: les antigènes

• Captation 90% Ag• Zone T interfolliculaire: peu d ’antigène sauf dans

les cellules dendritiques– Les cellules T voient les Ag processés

• Follicules lymphoïdes: plein d ’antigène après injection sur FDC

– Les cellules B voient les Ag intacts

Quelles interactions permettent le positionnement des cellules dans le ganglion?

• Des interactions cellulaires• Les cellules dendritiques expriment DC-CK1 pour attirer les

cellules T naïves CD45RA+, et les B CD38- • Des cellules stromales

• Un gradient de molécules solubles • IFN-αλπηα, gammaTNF-αλπηα

• Des chimiomokines spécifiques• SLC interfolliculaire pour les lymphocytes T• SDF-1 pour B et T• CCL21 pour T

• Des interactions avec la matrice extracellulaire (collagène, Fn, Ln…)

Les centres germinatifs:

• un environnement unique où

• des Lymphocytes B• sont activés, • prolifèrent,

– bénéficient d ’une expansion clonale

– (hyper)mutent leurs immunoglobulines

– subissent un processus de sélection drastique, basé sur leur affinité pour l ’antigène

• se différencient… en plasmocytes • et meurent++

Le centre germinatif

• Zone sombre (proche zone T): cellules en prolifération– Mutation somatique des centroblastes en prolifération

• Zone claire: cellules en sélection– Sélection des centrocytes de haute affinité par liaison aux

complexes Ag-AC sur les cellules dendritiques folliculaires– Si faible affinité: apoptose

• Pour les survivants– Commutation de classe ou Switch (M,D… G, A, E)– Maturation

• en cel lules mémoire et en plasmocytes

Composition cellulaire des centres germinatifs

• Les cellules foll iculaires dendrit iques définissent le lieu de formation des centres germinatifs

• Elles secrètent BLC, une CXC chémokine attirant des cellules CXCR5+

• Quelques cellules T spécifiques de l’antigène• Une majorité de cellules B spécifiques de l’antigène, avec

un phénotype évoluant de la zone sombre à la zone claire

• D’abord B matures: IgM+, IgD+, CD23+• Puis perdent leurs IgD • Deviennent bcl2low, PNA+, CD24+, CD23dim• Enfin réexpriment RAG

antigène antigène

latence latence

IgM IgM

IgG

IgG

Evolution des centres germinatifs• Réponse primaire

– Activation de petits lymphocytes B (recirculants) • (G0-G1… Ag et T dépendant)

– J 2-4: Follicules primaires (blastes B Ag-spécifiques dans le réseau de FDC), d ’abord polyclonal

– J 4 : pic de prolifération +++, cycles de 6-7h– J 4-6: « compartimentalisation » en centroblastes et

centrocytes – J 7-14: formation continue de centrocytes (plateau)– Puis diminution rapide de l ’activité proliférative

• Réponse secondaire– pic à J2– prolifération plus réduite paradoxalement

Différenciation et Apoptose• Centroblastes:

– début d’hypermutation des sites de liaison à l’Ag• Centrocytes:

– sélection positive basée sur leur affinité pour l ’Ag sur les cellules folliculaires dendritiques

• signaux de survie ICAM-1, VCAM-1, CD23 sur les FDC • vs LFA-1, VLA-4, CD21 sur les B

– Devenir des centrocytes survivants:• Précurseurs de plasmocytes (réponse secondaire) • Cellules B mémoire (lieu de résidence?)

• Retour zone sombre

Applications expérimentales et cliniques• Expérimental

– Local lymph node assay (LLNA)• Sensibilisation cutanée

– Popliteal lymph node assay (PLNA)• Injection sous-cutanée

• Clinique: hyperplasies foll iculaires– Défense anti-infectieuse– Hypersensibilités– Autoimmunité

Physiologie et Pathologies

• Physiologie– Défenses anti-infectieuses

– Défenses anti-tumorales

• Pathologies• Allergies• Autoimmunité• +• Envahissement ganglionnaire métastatique (TNM)• Prolifération de cellules immunocompétentes (B, T,

NK, DCs…)

Mouvements cellulaires « live »In vivo imaging

• SCIENCE May 2002 http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/296/5574/1869

– Lymphocyte motility is vital for trafficking within lymphoid organs and for initiating contact with antigen-presenting cells. Visualization of these processes has previously been limited to in vitro systems. We describe the use of two-photon laser microscopy to image the dynamic behavior of individual living lymphocytes deep within intact lymph nodes. In their native environment, T cel ls achieved peak velocities of more than 25 micrometers per minute, displaying a moti l i ty coefficient that is five to six t imes that of B cel ls. Antigenic chal lenge changed T cell trajectories from random walks to "swarms" and stable clusters.

– Two-photon microscopy analysis of leukocyte trafficking and motility.

– Okada T. Semin Immunopathol. 2010 Sep;32(3):215-25.

Une video sur WEHI-TV, Un site plein d’images, une video à Stanford

• WEHI = Walter & Eliza Hall Insitute of Medical Research Parkville, La Trobe, Melbourne depuis 1915– Fighting infection with clonal selection (4’43)

• Burnet FM Nobel Prize 1960• Miller J (rôle du thymus en 1961)

– http://www.wehi.edu.au/education/wehitv/the_immune_system/• Art Anderson (IL-8) Anatomy and Physiology of

Lymph Nodes (http://artnscience.us/)• Video of innate immune reaction in LN

– http://scopeblog.stanford.edu/2013/01/16/video-of-innate-immune-reaction-in-the-lymph-node/