Hibridación

Hibridación in situ

Tomás García-Caballero

BASES MOLECULARES DEL CÁNCERXàtiva 2009

HIBRIDACIÓN IN SITU

I. Concepto

II. Ácidos Nucleicos

III. Sondas

IV. Hibridación in situ

V. Sistemas de Detección

VI. HIS en Diagnóstico

Concepto

Técnica histológica que permite la detección in situ

de ácidos nucleicos

mediante el empleo de sondas.

Concepto

INMUNOHISTOQUÍMICA HIBRIDACIÓN in situ

MM

Anticuerpos Sondas

Detectan proteínas Detectan ácidos nucleicos

Concepto

IHQ e HIS son técnicas complementarias

IHQ +

HIS +IHQ +

HIS -

Concepto

IHQ –

HIS +


Concepto


I. Concepto


III. Sondas




Ácidos Nucleicos

Concepto

Tipos

ADN (Ácido Desoxirribonucleico)

ARN (Ácido Ribonucleico)

ARNr (Ribosómico)

ARNt (Transferencia)

ARNm (Mensajero)

Ácidos Nucleicos

Estructura de los Ácidos Nucleicos

Están constituidos por unidades elementales denominadas

NUCLEÓTIDOS

Composición de los nucleótidos

Azúcar

Grupo Fosfato

Base Nitrogenada

Ácidos Nucleicos


Nucleótidos

CH2P OO

OH

OH

O

OHOH

Ácido Fosfórico + Azúcar + Base Nitrogenada

Ácidos Nucleicos


Azúcar

O

CHHC

CH2

CHHC

OHOH

OH

HO

1’

2’3’

4’

5’O

CHHC

CH2

CHHC

HOH

OH

HO

1’

2’3’

4’

5’

Ribosa (ARN) Desoxirribosa (ADN)

Ácidos Nucleicos


Grupo Fosfato

CH3 O

OH

CH2P OO

O

O-

O

OHO

(H3PO4)

P OHO

OH

OH

1’

2’3’

4’

5’

1’

2’3’

4’

5’

Ácidos Nucleicos


Bases Nitrogenadas

Pirimidínicas

Citosina C

Uracilo (ARN) U

Timina T

Púricas

Adenina

Guanina

A

G

Ácidos Nucleicos


Púricas Pirimidínicas

CitosinaC

Uracilo (ARN)U

Timina (ADN)TAdenina A

Guanina G

Puentes de Hidrógeno

Unión entre bases Nitrogenadas

Ácidos Nucleicos


Sentido cadenas: 5´ 3´

CH3 O

OH

CH2P OO

O

O-

O

OHO

1’

1’

3’

5’

5’

3’

Ácidos Nucleicos


Cadenas antiparalelas

3’

5’ CH2P OO

O

O-

O

H

CH2P OO

O

O-

O

HO

CH2 PO O

O

O-

O

H

CH2 PO O

O

O-

O

H O

3’

5’

TTAA

CC

GG

Ácidos Nucleicos


Secuencia de Nucleótidos

CCGGTT

AAAA GG CCTT

AA

CCTTAA GGAA TT CCGG

TT

3’5’

5’ TAAgTCgCA 3’

5’3’

I. Concepto


III. Sondas




Sondas

Secuencia de nucleótidos

complementaria

de la secuencia diana a estudio

MM

Sondas

Sondas antisentido y sentido

• SONDA ANTISENTIDO (Antisense): Secuencia de nucleótidos

complementaria de la secuencia diana

• SONDA SENTIDO (Sense, control negativo): Secuencia de nucleótidos

idéntica a la secuencia diana, por lo que no puede hibridarse con ella

Secuencia diana

Sonda antisentido T A A g gT C C A3’ 5’

A T T C CA g g T5’ 3’

A C g C AT g A T5’ 3’

A T T C CA g g T5’ 3’Sonda sentido

Sondas

Tipos de Sondas

• Sondas bicatenarias (ADN)

• Sondas monocatenariasNúmero de hebras

• Sondas de ARN (Ribosondas)

• Sondas de ADNNaturaleza

• ARN

• Oligonucleótidos

Sondas

Tipos de Sondas

Sondas Bicatenarias

MM

MM

• Permiten la detección de ambas hebras del ADN

Sondas

Tipos de Sondas

Sondas Monocatenarias

• En ADN, permiten la detección de una de las hebras

MM

• En ARN, es complementaria a su secuencia

Sondas

Marcadores

Son moléculas que se incorporan a un nucleótido

para permitir la detección de la sonda.

MM

Sondas

Marcadores

Tipos de marcadores

• Antigénicos

• Fluorescentes

• Inmunohistoquímica

• Visualización directa (FISH)

Sondas

Marcadores

Marcadores antigénicos

• Incorporan moléculas antigénicas acopladas a la base nitrogenada

• Los más usadas son: Biotina, Digoxigenina y Fluoresceína (FITC)

CH2 O

OHOH

P OO

OH

OH

PO

OH

OH

PO

OH

OH

MM

Sondas

Marcadores

Marcadores fluorescentes

• Incorporan fluorocromos acoplados a la base nitrogenada

• Los más usadas son: Fluoresceína, Rodamina, Texas red

CH2 O

OHOH

P OO

OH

OH

PO

OH

OH

PO

OH

OH

MM

I. Concepto


III. Sondas





Procesamiento de las muestras

Fijación

Permite preservar los ácidos nucleicos y la morfología tisular

DNasas ¡RNasas!

Degradación de ácidos

nucleicos diana

FIJACIÓNFIJACIÓN



Fijador

FORMOL TAMPONADO 10%, pH 7.4, durante 24 horas

Procesado rutinario de inclusión en parafina

Evitar mezclas fijadoras que contengan Hg o ácidos

Bouin

Zenker

B5

!

Hibridación in situProcesamiento de las muestras

Secciones

Secciones de 5 µm en portaobjetos tratados

• Limpieza con alcohol (microtomo, baño, ...)

• Esterilización en autoclave (pinzas, ...)

Precauciones con las RNasas exógenas (condiciones de esterilidad):

• Uso de agua destilada en el baño para recoger las secciones

• Portaobjetos de caja recién abierta

!



Secado de las secciones durante

1 Noche a 50-55 ºC

Almacenamiento de las secciones desecadas a –20ºC

Si no se realiza la HIS en

los días siguientes

Precauciones con las RNasas!


Etapas

• Pretratamiento

• Desparafinado e hidratación

• Deshidratación

• Desnaturalización

• Hibridación


Desparafinado e Hidratación

Se realizará de igual manera que la IHQ

Llevar la hidratación hasta Agua Destilada Estéril



Pretratamientos

Calor


10 min, 95-99ºC

Baño María

Microondas


Pretratamientos

Medios Enzimáticos


Enzimas proteolíticas

PEPSINA (10 min TA / 5 min 37ºC )

PROTEINASA K (1 min TA)


Deshidratación y secado


Evita la dilución de la sonda

La deshidratación se realiza con alcoholes de graduación creciente

OH 70º OH 96º OH 100º

El secado lo podemos realizar

Al aire / campana

En placa térmica a 45-50ºC


Desnaturalización

Permite la separación de las dos hebras de ADN para que

pueda ser detectada la secuencia a estudio

Sólo es necesaria cuando se pretenda detectar ADN y/o

cuando la sonda sea bicatenaria


Desnaturalización

95ºC durante 5’


Hibridación

La sonda se unirá a la secuencia diana

bajo unas condiciones determinadas

MM


Hibridación

Condiciones de hibridación

[Na+]Temperatura

MM

MM MM


Hibridación

Temperatura de hibridación

37ºC / 45ºC noche

Temperatura a la cual la sonda se hibridará con su diana


Lavados de rigor (astringency)

Permiten aumentar la especificidad de la reacción

eliminando las uniones inespecíficas de la sonda

con secuencias parcialmente homólogas

SSC 2X SSC 1X SSC 0,5X

SSC: Tampón citrato salino

Se realizan los lavados a 72ºC, 65ºC, 42ºC, 37ºC

I. Concepto


III. Sondas




Sistemas de Detección

• Biotina • Estreptavidina

• Fluorocromos• Ac. anti-fluorocromo

• Fluorescencia (FISH)

• Digoxigenina • Ac. anti-digoxigenina


Sondas biotinadas

BB

1. Detección mediante Estreptavidina unida a la enzima

(Fosfatasa alcalina o Peroxidasa)

EZ

EZ

E

Diana

2. Revelado con el cromógeno de la enzima

(NBT/BCIP o DAB)


Sondas biotinadas

EA-Peroxidasa DABEA-Fosfatasa Alcalina NBT/BCIP

Virus JC


Amplificación con tiramidas

BB

E

P P

1. Detección de sonda biotinada con Estreptavidina-Peroxidasa



BB

E

P P

TT

BB

TT

BB

2. Tiramida-biotina oxidada por la peroxidasa se une a residuos

tirosina de proteínas próximas

TT

BB

TT

BB



BB

E

P P

TT

BB

E

P P

TT

BB

E

P P

TT

BB

E

P P

TT

BB

E

P P3. Detección de la biotina de las tiramidas con más Estreptavidina-

peroxidasa

4. Revelado con DAB



Técnica convencional Amplificación con tiramidas

HPV



Caski (600 copias HPV16)

HPV



SiHa (1-2 copias HPV16)

HPV


Sondas antigénicas

AA

E

1. Detección mediante un anticuerpo unido a una enzima

(Fosfatasa Alcalina o Peroxidasa)

2. Revelado con el cromógeno

(NBT/BCIP o DAB)

Antígeno• Digoxigenina

• FITC

Detección por Inmunohistoquímica


Sondas antigénicas

EBV - EBER

FITC–FA NBT/BCIP


Sondas marcadas con fluorocromos

FITCFITC

Iluminación con luz de

alta frecuencia (Ultravioleta)

Emisión de

fluorescencia de

frecuencia inferior

Visualización directa de la fluorescencia (FISH)


Sondas Marcadas con Fluorocromos

HER-2/neu

Centrómero

Gen HER2

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

I. Concepto


III. Sondas



VI. Aplicaciones


Aplicaciones

• INFECCIONES VÍRICAS

HPV, EBV, CMV

• EXPRESIÓN GÉNICA EN DIAGNÓSTICO:

Indicaciones terapéuticas (HER2, EGFR, TOP2a)

Hematopatología (Translocaciones)

• EXPRESIÓN GÉNICA NORMAL:

Confirmación síntesis proteica

Expresión génica normal

IHQ HIS

Testículo – Protimosina

HIS en Diagnóstico

HPV

• Virus ADN

• Técnica más sensible que la IHQ

• Permite el tipaje:

HPV 6,11

HPV 31,33

HPV 16,18 (factor de riesgo) Cáncer de cérvix

HIS en Diagnóstico / HPV

IHQ HIS


IHQ HIS


HPV 6,11

HPV 31,33HPV 16,18


HPV 16,18


HIS-HR (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68)

HIS en Diagnóstico

EBV

• Detección de su ARNm (elevado número de copias):

EBER: Epstein Barr Earlier RNA

¡Atención RNasas!

• Asociado a

Mononucleosis infecciosa

Linfomas

Carcinoma nasofaríngeo

HIS en Diagnóstico / EBV

Mononucleosis – EBER L. Burkitt – EBER


L. Hodgkin – EBER L. Hodgkin – EBER


Carcinoma Nasofaríngeo

EBER – Px / DAB


Carcinoma Nasofaríngeo

EBER – FA / NBT-BCIP


HIS - EBER

IHQ - CK

Controles

EBERCONTROL

Sin sonda

Sonda sentido

HIS en Diagnóstico

CMV

• Virus ADN

• Infección oportunista en pacientes inmunodeprimidos

HIS en Diagnóstico / CMV

HIS - CMV

FISH

HER-2 / Carcinoma infiltrante de mama

Gen HER-2

Receptor HER-2Receptor HER-2

FISH

HercepTest

0 3+1+ 2+

FISH / HER-2

Algoritmo

Carcinoma Infiltrante

HercepTestHercepTest

00 1+1+ 2+2+ 3+3+

NegativoNegativo PositivoPositivo TrastuzumabTrastuzumab

IndeterminadoIndeterminado

HISHIS

FISH / HER-2

Cromosoma 17

Centrómero Gen HER-2

Sonda Centromérica Sonda HER-2

FISH / HER-2

Amplificado

No Amplificado

HercepTest 2+

FISH / HER-2

Casos 2+

INDICACIONES

FISH / HER-2

Casos 2+

Casos 1+/2+

INDICACIONES

FISH / HER-2

Casos 2+

Casos 1+/2+

Casos 2+/3+

INDICACIONES

ALGORITMO DE HERCEPTIN

Carcinoma Infiltrante

HercepTest

0 1+ 2+ 3+

Negativo Trastuzumab

FISH / CISH No A A

ALGORITMO DE HERCEPTIN

INMUNOHISTOQUÍMICAINMUNOHISTOQUÍMICA

Negativo (0, 1+)Negativo (0, 1+) Borderline (2+)Borderline (2+)Borderline (2+)Borderline (2+) Positivo (3+)Positivo (3+)Positivo (3+)Positivo (3+)

Hibridación “in situ”Hibridación “in situ”

POSITIVOHER2/CEN17

>2’2

POSITIVOHER2/CEN17

>2’2

BORDERLINEHER2/CEN17

1’8-2,2

BORDERLINEHER2/CEN17

1’8-2,2

NEGATIVOHER2/CEN17

<1’8

NEGATIVOHER2/CEN17

<1’8

Recuento adicional de núcleosRecuento adicional de núcleos

BORDERLINE NO AMPLIFICADO

HER2/CEN17: 1’8-1,9

BORDERLINE NO AMPLIFICADO

HER2/CEN17: 1’8-1,9BORDERLINE AMPLIFICADO

HER2/CEN17: 2-2’2

BORDERLINE AMPLIFICADO

HER2/CEN17: 2-2’2

TRASTUZUMABTRASTUZUMAB

FISH / HER-2 - Polisomía


Centrómero del cromosoma 17

Gen Her-2

Amplificación del gen

Múltiples copias del gen debido a polisomía del cromosoma 17

CEN 17 / Núcleo ≥3


• No tiene influencia en la expresión de HER-2

Downs-Kelly E et al., Am J Surg Pathol 29:1221-1227, 2005

• No tiene efecto sobre el contenido de la proteína ni del ARNm

Dal Lago L et al., Mol Cancer Ther 5:2572-9, 2006

• En ausencia de amplificación no se asocia con sobreexpresión

Van den Bempt I et al., Curr Opin Oncol 19:552-7, 2007


• Factor principal en la sobreexpresión de casos 3+ no amplificados

Varshney D et al., Am J Clin Pathol 121:70-77, 2004

• Principal causa de respuesta a trastuzumab en casos 3+ FISH-

Hofmann M et al., J Clin Pathol 61:89-94, 2008

FISH / HER-2 - Monosomía

CEN 17 / Núcleo <1,5

FISH / HER-2 – Monosomía

• Define un grupo de pacientes con menor respuesta a trastuzumab

Risio et al., Oncol Rep 13:305-309, 2005

• En algunos casos con monosomía 17, la relación ≥ 2 es causada

por 2 copias de HER2 y una copia simple del cromosoma 17

por lo que no deben ser interpretados como amplificados

Persons DL et al, Arch Pathol Lab Med 130:325-331, 2006

CISH / HER-2

DigDig

PxPxPxPx

Px PxPxDAB

CISH / HER-2

HER-2 AmplificadoHER-2 No Amplificado

Duo-CISH / HER-2

Cinco Laboratorios europeos:

Reino Unido• School of Molecular Medical Sciences. University of Nottingham• Medical School. Birmingham University

Alemania• Johannes Gutenberg Universitätsklinikum

Suecia• Universitetssjukhuset Lund

España• Universidad de Santiago de Compostela

VALIDACIÓN

Duo-CISH / HER-2

CISH HER2

CISH CEN-17

CISHCISH

HER2CEN-17

Número de copias

dc-CISH

CEN-17HER2

dc-dc-CISHCISH

Relación

Duo-CISH / HER-2

AP P

Sonda DNA – TRTR

IndoliumFast red

Hematoxylin

Sonda PNA – FITCFITC

Medio permanenteSecado

Duo-CISH / HER-2

x40

Duo-CISH / HER-2

x100

Duo-CISH / HER-2

x100

Duo-CISH / HER-2

x100

Duo-CISH / HER-2

x100

Duo-CISH / HER-2

Duo-CISH combina las ventajas de FISH y CISH

• Evaluación objetiva ( IHC) • Contaje simultáneo de las señales de HER2 y

CEN-17 ( CISH) • Campo claro ( FISH)• Las señales en células normales y tumorales

representan un control interno positivo ubicuo que falta en IHC

VENTAJAS

Duo-CISH / HER-2

Campo claro

• El componente invasivo puede ser fácilmente identificado, reduciendo el riesgo de analizar células no tumorales o no invasivas

VENTAJAS

Duo-CISH / HER-2

Campo claro


• Facilira la discusión de casos y la formación

VENTAJAS

Duo-CISH / HER-2

Campo claro


• Facilita la discusión de casos y la formación

• Fácil evaluación del estado de HER2 en TMA

VENTAJAS

Duo-CISH / HER-2

No se requiere un microscopio especial de fluorescencia

• Economía

• No ambiente oscuro

• No aceite de inmersión (40x-60x)

FISH

dc-CISH

VENTAJAS

Duo-CISH / HER-2

Archivo

• Tiempo indefinido en el archivo general

• Reevaluación de casos

• Estudios retrospectivos

VENTAJAS

FISH / Translocaciones

Cromosoma 14 Cromosoma 18

t(14;18)

Señal de fusión


FISH normal FISH t(14;18)

IgH 14IgH 14

Bcl2 18Bcl2 18

Fusión

Translocación 14;18


Cromosoma A Cromosoma B

Cromosoma A Cromosoma B

Split t(A;B)

Señal separación (split)


Normal Translocación en Bcl2

Bcl 2Bcl 2Split

Translocación en Bcl2

Agradecimiento

¡Muchas gracias!

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