ISOLASI DAN SKRINING FITOKIMIA ISOFLAVON

DARI EKSTRAK METANOL BIJI KEDELAI (Glycine max)

Untuk Memenuhi Sebagian Tugas Mata Kuliah Fitofarmasi

yang dibina oleh Ayu Ristamaya Yusuf., A.Md., S.T

OLEH :

RAHAYU WAHYU NINGSIH 12.091

AKADEMI FARMASI PUTRA INDONESIA MALANGOktober 2013

I. PENDAHULUAN

Tanaman merupakan sumber kekayaan alam yang memiliki peran penting disetiap aspek

kehidupan manusia terutama di bidang kesehatan. Keberagaman tanaman yang tersedia di alam

menjadikan tanaman memiliki manfaat dan khasiat yang beragam pula. Disetiap bagian tanaman

dari akar, daun, batang, bunga, dan biji memiliki kandungan senyawa-senyawa kimia yang

berbeda. Senyawa yang ada dalam tanaman itulah yang memiliki khasiat obat.

Salah satu tanaman yang bisa digunakan sebagai obat adalah kedelai (Glysin max). Bagian

tanaman kedelai yang memiliki kandungan senyawa kimia bermanfaat terbanyak adalah pada

bagian bijinya. Biji kedelai mengandung senyawa-senyawa antioksidan diantaranya adalah

vitamin E, vitamin A, provitamin A, vitamin C dan senyawa flavonoid golongan isoflavon,

genistein dan daidzein. Senyawa antioksidan terutama dari golongan isoflavon yang memiliki

aktivitas sebagai penangkal radikal bebas dan pencegahan penyakit kanker.

Konsumsi pangan yang mengandung antioksidan tinggi perlu ditingkatkan untuk

mengurangi jumlah penderita penyakit degeneratif seperti kanker. Isoflavon dalam biji kedelai

merupakan suatu metabolit sekunder yang berperan sebagai antioksidan alami yang mampu

memberikan perlindungan dan menjaga kesehatan tubuh, serta mencegah timbulnya berbagai

penyakit. Antioksidan yang terdapat dalam tubuh harus terdapat dalam jumlah yang memadai.

Oleh karena itu, jika terjadi peningkatan radikal bebas dalam tubuh, dibutuhkan antioksidan

dalam jumlah yang lebih banyak untuk meminimalisasi dan menetralisasi efek radikal bebas.

Kedelai sebagai sumber antioksidan isoflavon telah dijadikan sebagai primadona karena

mudah diperoleh dalam makanan sehari-hari dan merupakan komoditas yang populer di

masyarakat. Berbagai produk olahan kedelai telah banyak dimanfaatkan masyarakat untuk

mencukupi kebutuhan gizi sebagai bahan makanan. Karena begitu pentingnya fungsi tanaman

ini, serta dugaan terhadap adanya senyawa golongan flavonoid yang dikandung, maka pada

penelitian ini dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa golongan flavonoid dari biji kedelai

(Glycine max).

Serangkaian isolasi dimulai dari preparasi simplisia, ekstraksi flavonoid biji kedelai

dengan metanol, selanjutnya dipartisi menggunakan HCl dan n-heksan, hingga akhirnya

didapatkan isolat isoflavon. Identifikasi dan pengujian dilakukan dengan skrining fitokimia dan

kromatografi lapis tipis (KLT).

Setelah didapatkan isolat isoflavon, bisa dibuat menjadi bentuk sedian kapsul isoflavon.

Kapsul isoflavon ini memiliki khasiat sebagai suplemen makanan tepatnya sebagai antioksidan.

Antioksidan ini berperan sebagai penangkal radikal bebas yang bisa mencegah berbagai

penyakit.

II. TUJUAN

Untuk mengeksplorasi senyawa isoflavon dari kacang kedelai agar lebih bermanfaat sebagai

antioksidan.

III. TINJAUAN PUSTAKA

3.1 Kedelai

Kedelai merupakan tanaman semusim dengan tinggi berkisar 10–200 cm, berupa semak

rendah, tegak, berdaun lebat, dapat bercabang sedikit atau banyak tergantung kultivar. Tanaman

ini tumbuh baik pada tanah dengan pH 4.5 dan daerah pertumbuhannya tidak lebih dari 500 m di

atas pemukaan laut. Nama botani kedelai yang dibudidayakan adalah Glycine max (Gambar 1),

dengan klasifikasi sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Divisio : Spermatophyta

Classis : Dicotylodenae

Ordo : Rosales

Familia : Papilionaceae

Genus : Glycine

Species : Glycine max (L.) Merill

Kedelai sebagai bahan makanan mempunyai nilai gizi yang cukup tinggi dan merupakan sumber

protein, lemak, vitamin, mineral, dan serat yang paling baik. Kandungan protein kedelai sekitar

30–50% (b/b), tetapi kadar karbohidratnya hanya sekitar 22–29% (b/b). Kadar lemaknya antara

16–20% (b/b), sedangkan kadar total gula sekitar 7.97% (b/b) (Liu 1997). Hasil utama dari

kedelai adalah bijinya. Biji kedelai juga mengandung mineral-mineral kalsium, fosfor, besi, dan

klor. Bentuk biji ada yang bundar, lonjong, gepeng, dan bulat telur. Warnanya tergantung dari

varietas, ada yang hitam, kuning kehijauan, putih kekuningan, dan kuning gading.

3.2 Penggolongan Flavonoid

Flavonoid merupakan kelompok senyawa fenol terbesar yang terdapat di alam. Senyawa-

senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu, biru, dan kuning yang ditemukan dalam

tumbuh-tumbuhan. Flavonoid memiliki kerangka dasar 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin

benzena yang dihubungkan oleh rantai linear tiga karbon dan dapat dinyatakan ke dalam

konfigurasi C6-C3-C6

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita

serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak, umumnya dalam

tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida. (Harborne, 1996)

Pada flavonoida O-glikosida, satu gugus hidroksil flavonoid (atau lebih) terikat pada satu

gula (lebih) dengan ikatan yang tahan asam. Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat

dan gula lain yang sering juga terdapat adalah galaktosa, ramnosa, silosa, arabinosa, dan

rutinosa. Waktu yang diperlukan untuk memutuskan suatu gula dari suatu flavonoid O-glukosida

dengan hidrolisis asam ditentukan oleh sifat gula tersebut.

Pada flavonoid C-glikosida, gula terikat pada atom karbon flavonoid dan dalam hal ini gula

tersebut terikat langsung pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam.

Gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti

flavonoid, misalnya pada orientin. (Markham, 1988) Menurut Robinson (1995), flavonoid dapat

dikelompokkan berdasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu :

1. Flavonol

Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon flavonol

yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan

antiimflamasi. Flavonol lain yang terdapat di alam bebas kebanyakan merupakan variasi struktur

sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana basa dioksidasi oleh udara tetapi tidak

begitu cepat sehingga penggunaan basa pada pengerjaannya masih dapat dilakukan.

2. Flavon

Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3-

hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi warnanya.

Flavon terdapat juga sebagai glikosidanya lebih sedikit daripada jenis glikosida pada flavonol.

Flavon yang paling umum dijumpai adalah apigenin dan luteolin. Luteolin merupakan zat warna

yang pertama kali dipakai di Eropa. Jenis yang paling umum adalah 7-glukosida dan terdapat

juga flavon yang terikat pada gula melalui ikatan karbon-karbon. Contohnya luteolin 8-C-

glikosida. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoid.

3. Isoflavon

Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan sebagai fitoaleksin

yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai pertahanan terhadap serangan

penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna manapun.

Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar

UV bila diuapi amonia, tetapi kebanyakan yang lain tampak sebagai bercak lembayung yang

pudar dengan amonia berubah menjadi coklat.

4. Flavanon

Flavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga.

Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk; dua

glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan

jeruk.

5. Flavanonol

Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika

dibandingkan dengan flavonoid lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena

konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.

6. Katekin

Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu. Senyawa

ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak kental Uncaria gambir dan daun teh kering

yang mengandung kira-kira 30% senyawa ini. Katekin berkhasiat sebagai antioksidan.

7. Leukoantosianidin

Leukoantosianidin merupakan senyawa tan warna, terutama terdapat pada tumbuhan

berkayu. Senyawa ini jarang terdapat sebagai glikosida, contohnya melaksidin, apiferol.

8. Antosianin

Antosianin merupakan pewarna yang paling penting dan paling tersebar luas dalam

tumbuhan. Pigmen yang berwarna kuat dan larut dalam air ini adalah penyebab hampir semua

warna merah jambu, merah marak , ungu, dan biru dalam daun, bunga, dan buah pada tumbuhan

tinggi. Secara kimia semua antosianin merupakan turunan suatu struktur aromatik tunggal yaitu

sianidin, dan semuanya terbentuk dari pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan

gugus hidroksil atau dengan metilasi atau glikosilasi.

9. Khalkon

Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat kuat dengan sinar UV bila

dikromatografi kertas. Aglikon flavon dapat dibedakan dari glikosidanya, karena hanya pigmen

dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas dalam pengembang air.

(Harborne, 1996)

10. Auron

Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita. Dalam

larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromatografi kertas berupa

bercak kuning, dengan sinar ultraviolet warna kuning kuat berubah menjadi merah jingga bila

diberi uap amonia. (Robinson, 1995)

3.3 Ekstraksi Senyawa Flavonoid

Ekstraksi dapat dilakukan dengn metoda maserasi, sokletasi, dan perkolasi. Sebelum

ekstraksi dilakukan, biasanya serbuk tumbuhan dikeringkan lalu dihaluskan dengan derajat

kehalusan tertentu, kemudian diekstraksi dengan salah satu cara di atas. Ekstraksi dengan metoda

sokletasi dapat dilakukan secara bertingkat dengan berbagai pelarut berdasarkan kepolarannya,

misalnya n-heksana, Eter, Benzena, Kloroform, Etil asetat, Etanol, Metanol, dan Air.

Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap senyawa

yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak yang pekat biasanya pelarut ekstrak

diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator. (Harborne, 1996)

3.4 Isoflavon

Isoflavon termasuk dalam golongan flavonoid yang merupakan senyawa polifenolik. Stuktur

kimia dasar dari isoflavon hampir sama seperti flavon, yaitu terdiri dari 2 cincin benzen (A dan

B) dan terikat pada cincin C piran heterosiklik, tetapi orientasi cincin B nya berbeda. Pada

flavon, cincin B diikat oleh karbon nomor 2 cincin tengah C, sedangkan isoflavon diikat oleh

karbon nomor 3 (Schmidl dan Labuza, 2000).

Pada umumnya, senyawa isoflavon banyak ditemukan pada tanaman kacang- kacangan atau

leguminosa (Zubik dan Meydani, 2003). Isoflavon pada kedelai terdapat dalam empat bentuk,

yaitu

1. Bentuk aglikon (non gula) : genistein, daidzein, dan glycitein;

2. Bentuk glikosida : daidzin, genistin dan glisitin;

3. Bentuk asetilglikosida : 6”-O-asetil daidzin, 6”-O- asetil genistin, 6”-O-asetil glisitin;

4. Bentuk malonilglikosida : 6”-O-malonil daidzin, 6”-O-malonil genistin, 6”-O- malonil

glisitin.

Isoflavon utama pada kedelai terdiri dari genistein (4’,5’7-tryhydroxyisoflavone) dan

daidzein (4’,7-dihydroxyisoflavone), serta turunan β-glikosida, gensitin dan daidzin. Ditemukan

juga sejumlah kecil senyawa isoflavon lainnya seperti glycitein (7,4’-dihydroxy-6-methoxy-

isoflavone) dan glikosidanya (Wang dan Murphy, 1994). Secara alami, isoflavon pada kedelai

hampir seluruhnya terdapat dalam bentuk β-glikosida (glikon). Bentuk glikosida

dipertahankan oleh tanaman sebagai bentuk inaktif sehingga dibutuhkan sebagai antioksidan.

Menurut Naim et al . (1974), sebanyak 99 % isoflavon pada kedelai terdapat dalam bentuk

glikosida, terdiri dari 64 % genistin, 23 % daidzin dan 13 % glisitin. Komposisi ini biasanya

terdapat pada makanan olahan kedelai yang tidak difermentasi seperti susu kedelai, tofu, tepung

kedelai, konsentrat protein kedelai dan isolat protein kedelai. Pada makanan olahan kedelai yang

mengalami proses fermentasi seperti miso dan tempe, isoflavon dalam bentuk bebas (aglikon)

lebih dominan (Coward et al., 1998).

Sebagian besar isoflavon dalam kedelai atau produk olahan kedelai terdapat dalam bentuk

glikosida seperti genistin, daidzin dan glisitin yang berkonjugasi dengan mengikat satu molekul

gula. Ketika produk kedelai dikonsumsi, bentuk glikosida isoflavon didegradasi menjadi

senyawa aglikon dalam bentuk bebas yang dihasilkan oleh pelepasan glukosa dari glikosida.

Proses degradasi glikosida menjadi aglikon seperti genistein, daidzein dan glisitein dikatalis oleh

enzim glukosidase dalam usus halus. Isoflavon dalam bentuk aglikon lebih mudah diserap oleh

usus halus sebagai bagian dari misel yang dibentuk oleh empedu. Sirkulasi isoflavon dalam

darah bersifat kompleks, karena sebagian larut lemak dan sebagian berikatan dengan protein

dengan kekuatan yang lemah. Isoflavon kemungkinan didistribusikan melalui darah ke hati, atau

didaur ulang sebagai bagian dari cairan empedu dan sirkulasi enterohepatik. Ekskresi akhir

isoflavon terjadi pada feses dan urin (Schmidl dan Labuza, 2000).

3.5 Metode Isolasi Senyawa Flavonoid oleh Harborne

Dalam metoda ini, daun yang segar dimaserasi dengan MeOH, lalu disaring. Ekstrak MeOH

dipekatkan dengan rotari evaporator. Lalu ekstrak pekat yang dihasilkan, diasamkan dengan

H2SO4 2M, didiamkan, lalu diesktraksi dengan Kloroform. Lapisan Kloroform diambil, lalu

diuapkan, sehingga dihasilkan ekstrak polar pertengahan (Terpenoida atau senyawa Fenol).

(Harborne, 1996)

3.6 Kromatografi lapis tipis

Kromatografi Lapis Tipis pada plat berlapis yang berukuran lebih besar, biasanya 5x20 cm,

10x20 cm, atau 20x20 cm. Biasanya memerlukan waktu pengembangan 30 menit sampai satu

jam. Pada hakikatnya KLT melibatkan dua fase yaitu fase diam atau sifat lapisan, dan fase gerak

atau campuran pelarut pengembang. Fase diam dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai

permukaan penyerap atau penyangga untuk lapisan zat cair. Fase gerak dapat berupa hampir

segala macam pelarut atau campuran pelarut. (Sudjadi, 1986).

Pemisahan senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis seperti senyawa organik alam dan

senyawa organik sintetik dapat dilakukan dalam beberapa menit dengan alat yang harganya tidak

terlalu mahal. Jumlah cuplikan beberapa mikrogram atau sebanyak 5 g dapat ditangani.

Kelebihan KLT yang lain ialah pemakaian jumlah pelarut dan jumlah cuplikan yang sedikit.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu metode pemisahan yang cukup sederhana

yaitu dengan menggunakan plat kaca yang dilapisi silika gel dengan menggunakan pelarut

tertentu. (Gritter,1991).

Nilai utama Kromatografi Lapis Tipis pada penelitian senyawa flavonoid ialah sebagai cara

analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit. Menurut Markham, Kromatografi Lapis

Tipis terutama berguna untuk tujuan berikut:

a. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom

b. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom

c. Identifikasi flavonoid secara ko-kromatografi.

d. Isolasi flavonoid murni skala kecil

e. Penyerap dan pengembang yang digunakan umumnya sama dengan penyerap dan

pengembang pada kromatografi kolom dan kromatografi kertas. (Markham, 1988).

Fase diam yang digunakan pada KLT adalah silika gel GF254 dan sebagai fase gerak

digunakan n- heksana, kloroform, etil asetat dan n-butanol. Bejana kromatografi sebelum

digunakan untuk elusi, terlebih dahulu dijenuhkan dengan fase geraknya. Sedikit fraksi positif

flavonoid yaitu fraksi n-heksana dilarutkan dengan pelarutnya (eluen yang akan dipakai)

kemudian ditotolkan pada plat kromatografi lapis tipis dengan menggunakan pipa kapiler.

Setelah kering lalu dimasukkan dalam bejana. Bila fase gerak telah mencapai batas yang

ditentukan, plat diangkat, dan dikeringkan di udara terbuka. Sebagai penampak noda digunakan

asam sulfat. Noda yang terbentuk diamati dengan lampu UV 254 nm dan 366 nm kemudian

dihitung Rf-nya.

3.7 Harga Rf (Retension Factor)

Mengidentifikasi noda-noda dalam lapisan tipis lazim menggunakan harga Rf yang

diidentifikasikan sebagai perbandingan antara jarak perambatan suatu zat dengan jarak

perambatan pelarut yang dihitung dari titik penotolan pelarut zat. Jarak yang ditempuh oleh tiap

bercak dari titik penotolan diukur dari pusat bercak. Untuk mengidentifikasi suatu senyawa,

maka harga Rf senyawa tersebut dapat dibandingkan dengan harga Rf senyawa pembanding.

penotolan titik daripelarut perambatanJarak

penotolan titik daribercak perambatanJarak Rf

(Sastrohamidjojo, 1991).

3.8 Uji Fitokimia

Uji Fitokimia Pemeriksaan golongan flavonoid dapat dilakukan dengan uji warna yaitu :

1. Test Wilstatter

Beberapa mililiter sampel dalam alkohol ditambahkan 2-4 tetes larutan HCl dan 2-3 potong

kecil logam Mg. Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi orange.

2. Test dengan NaOH 10%

Beberapa mililiter sampel dalam alkohol ditambahkan 2-4 tetes larutan NaOH 10%.

Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi kuning muda.

3. Test dengan H2SO4 (pekat)

Beberapa mililiter sampel dalam alkohol ditambahkan 2-4 tetes larutan H2SO4 (pekat).

Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi merah tua.

IV. KERANGKA KONSEP

Kacang KedelaiKandungan :Kand.tertinggi : Isoflavon (Genistein & daizdein)Kand.Lain : Fitosterol,asam fitat, assam lemak, dll.

ISOFLAVONAktivitas :Sebagai antikanker dan antioksidan

Golongan Flavonoid

> 35% Genistein dan daizdein dlm bentuk glikosida

Sifat polar, larut air

TEKNIK PEMISAHAN

Maserasi Bertingkat

Maserasi Tahap 1MeOH:H2O (9:1)

Maserasi Tahap 2MeOH:H2O (1:1)

Rotary Vacuum Evaporator

Ekstrak Kental

ISOLASI ISOFLAVON

Isolat + etil asetat

Rotary Vacuum Evaporator

+ etilasetat (corong pisah)

+ n-hexane + HCl (p) (dihidrolisis)

(dlm Corong pisah)

IDENTIFIKASI ISOFLAVON

UJI KLT

1. Eluen

Etil asetat : asam format: as.asetat glasial : air

(100:11:11: 27)

2. Pereaksi Penampak :

Difenil boriloksinetilamina LP

3. Bercak sinar 365 nm :

Berpendar kuning intensif, hijau dan jingga

SKRINING FITOKIMIA

1. Test Wilstatter : ekstrak + alkohol + HCl +

pita Mg ( kuning tua → orange)

2. Test dengan NaOH 10% : ekstrak + alkohol

+NaOH 10%. (kuning tua → kuning muda.

3. Test dengan H2SO4 (pekat)

ekstrak + alkohol + H2SO4 (pekat).

(kuning tua → merah tua)

Ekstraksi dan Isolasi

Kacang kedelai banyak mengandung flavonoid khususnya golongan isoflavon dibandingkan

kacang-kacangan yang lain. Secara alami, isoflavon pada kedelai hampir seluruhnya terdapat

dalam bentuk β-glikosida (glikon) misalnya genestein dan daidzein. Untuk mengekstrak

flavonoid dari kedelai, dilakukan dengan metode maserasi dua tahap dengan menggunakan

pelarut metanol. Metanol dipilih sebagai pelarut karena metanol bersifat polar, begitu juga

dengan flavonoid.

Metanol yang digunakan pada maserasi tahap pertama digunakan perbandingan

Me(OH):H2O (9:1). Perbandingan metanol yang 9 kali lebih besar dari air bertujuan untuk

memaksimalkan proses ekstraksi dan penarikan flavonoid dari serbuk kedelai. Selanjutnya,

ekstrak yang didapatkan disaring kemudian residu dimaserasi kembali dengan pelarut yang sama

tetapi perbandingan diturunkan menjadi 1:1. Perbandingan metanol diturunkan karena

kemungkinan masih ada sebagian kecil flavonoid yang belum terekstrak pada maserasi tahap

pertama.

Kedua ekstrak hasil maserasi tahap pertama dan kedua, diuapkan menggunakan rotary

vacuum evaporator. Hal ini bertujuan untuk menguapkan etanol yang melarutkan flavonoid pada

proses maserasi. Selanjutnya ekstrak kental dipartisi dengan n-hexane untuk menghilangkan zat-

zat lemak yang ada dalam ekstrak. Ekstraksi partisi menggunakan n-hexane dilakukan dengan

menggunakan corong pisah dan dilakukan berulang-ulang. Ekstrak yang diperoleh kemudian

disatukan dan disatukan.

Tahap selanjutnya adalah isolasi senyawa isoflavon dari ekstrak flavonoid yang didapatkan

sebelumnya. Isolasi senyawa golongan isoflavon dilakukan dengan cara menghidrolisis ekstrak

dengan HCl. Proses hidrolisis (penambahan HCl) pada ekstrak bertujuan untuk memecah ekstrak

menjadi glikosida dan aglikon-aglikon seperti isoflavon yang merupakan bentuk dari β-glikosida

(glikon). Tahap terakhir adalah dipartisi dengan etil asetat yang bertujuan untuk memisahkan

aglikon flavonoid dari fraksi gula-gulanya. Isolat yang didapatkan digunakan sebagai sampel

untuk uji golongan dan KLT.

Skrining Fitokimia Uji Tabung

1. Test Wilstatter

Pada uji ini, penambahan aljohol dan HCl bertujuan untuk menghidrolisis flavonoid dengan cara

memutuskan rantai aglikon yang ada, sedangkan penambahan logam Mg bertujuan untuk

menunjukkan perubahan warna yang terjadi. Berikut reaksi senyawa flavonoid dengan logam.

2. Test dengan NaOH 10%

Beberapa mililiter sampel dalam alkohol ditambahkan 2-4 tetes larutan NaOH 10%. Perubahan

warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi kuning muda.

3. Test dengan H2SO4 (pekat)

Beberapa mililiter sampel dalam alkohol ditambahkan 2-4 tetes larutan H2SO4 (pekat).

Perubahan warna yang terjadi diamati dari kuning tua menjadi merah tua.

Uji KLT

Pada uji KLT, digunakan eluen Etil asetat : asam format: as.asetat glasial : air dengan

perbandingan 100:11:11: 27. Dipilih eluen ini karena bahan-bahan yang ada dalam eluen tersebut

memiliki tingkat kepolaran yang berbeda.

V. METODE KERJA

4.1 Alat dan Bahan

Alat : Bahan :

1. Blender,

2. Neraca Analitik,

3. Lampu UV,

4. Seperangkat Alat Penampak Bercak

5. Kertas Saring,

6. Seperangkat Alat Gelas,

7. Penguap Putar Vakum (rotary vacuum

evaporator),

1. Biji kedelai segar(Glycine max)

2. Metanol (teknis dan p.a)

3. Asam Klorida pekat

4. n- heksana (p.a)

5. Natrium Hidroksida

6. Plat KLT Silika Gel GF254

7. Etil Asetat (p.a)

8. Aquades

8. Asam Sulfat pekat

9. Etanol 70%

10. NH4OH

11. H2SO4 2 M

12. Pita Mg

13. etil asetat,

14. n-butanol,

15. asam asetat,

Cara Kerja

1. Penyiapan Bahan

a. Ditimbang 1 kg biji kedelai segar

b. Biji kedelai segar dicuci bersih

c. Biji Kedelai dikeringanginkan

d. Dihaluskan biji kedelai kering menggunakan penggiling sampai menjadi serbuk

2. Ekstraksi Senyawa Flavonoid

a. Ditimbang serbuk kedelai 500 g

b. Dimasukkan kedalam bekerglass

c. Ditambahkan etanol 70% sebanyak 1L

d. Dilakukan maserasi selama 3x24 jam pada suhu kamar disertai pengadukan berkala

e. Ekstrak-etanol disaring menggunakan corong buchner

f. Filtrat disimpan, residu dimaserasi kembali menggunakan etanol 70% sebanyak 1L

g. Hasil maserasi yang kedua disaring menggunakan corong buchner

h. Filtrat maserasi kedua dikumpulkan menjadi satu dengan filtrat pertama

i. Filtrat diuapkan dengan Rotary Vacuum Evaporator sampai diperoleh ekstrak kental

3. Isolasi Senyawa Flavonoid golongan Isoflavon

a. Ekstrak kental dimasukkan kedalam tabung reaksi

b. Ditambahkan HCl pekat

c. Dipanaskan selama 2 - 3 jam

d. Ditambahkan n-hexane 10% dari vlume ekstrak

e. Ditambahkan n-hexane sebanyak 10% dari volume ekstrak kental + HCl pekat,

selanjutnya dipindahkan dengan corong pisah

f. Ditambahkan etil asetat, dikocok dan didiamkan beberapa saat sampai terlihat terpisah

sempurna

g. Isolat kemudian diuapkan dengan rotary vacuum evaporator. Isolat yang diperoleh

digunakan untuk uji fitokimia dan uji KLT

4. Uji Fitokimia Senyawa Flavonoid

Test Wilstatter

1. 1 mL sampel dalam tabung reaksi

2. Ditambah alkohol beberapa tetes

3. Ditambahkan 2-4 tetes larutan HCl

4. Ditambahkan 2-3 potong pita logam Mg.

5. Diamati perubahan warna yang terjadi

Test dengan NaOH 10%

1. 1 mL sampel dalam tabung reaksi

2. Ditambahkan beberapa mL alkohol

3. Ditambahkan 2-4 tetes larutan NaOH 10%.

4. Diamati perubahan warna yang terjadi

Test dengan H2SO4 (pekat)

1. 1mL sampel dalam tabung reaksi

2. Ditambahkan beberapa mL alkohol

3. Ditambahkan 2-4 tetes larutan H2SO4 (pekat).

4. Diamati perubahan warna yang terjadi

5. Uji KLT

a. Pembuatan Eluen dan Penjenuhan Chamber

1. Dimasukkan aquadest pada chamber untuk mengetahui perkiraan batas eluen, lalu beri

tanda (kalibrasi)

2. Chamber dikeringkan

4. Dibuat eluen etil asetat : asam format : asam asetat glasial : air dengan perbandingan

( 100:11:11:27) sebanyak volume aquades yang digunakan kalibrasi

5. Dimasukkan kedalam chamber

6. Diletakkan kertas saring hingga menyentuh dasar eluen

7. Chamber ditutup dengan gelas arloji

8. Chamber dibiarkan sampai jenuh, ditandai dengan bagian luar kertas saring basah oleh

eluen

b. Penyiapan Plat

1. Diambil plat Silica GF254 lalu dipotong 15cm x 5 cm

2. Ditentukan jarak batas bawah dan batas atas

3. Plat dioven pada suhu 110 C ± selama 15 menit

c. Pereaksi Penampak (difenilboriloksinetilamina LP)

1. Pereaksi penampak digunakan larutan difenilboriloksinetilamina LP

2. Dimasukkan kedalam botol penyemprot

d. Penotolan sampel

1. Dinyalakan spiritus

2. Diletakkan pipa kapiler diatas api bunsen sambil diputar-putar

3. Diangkat pipa kapiler dari atas api dan ditarik kedua ujung pipa kapiler

4. Dipatahkan bagian tengah pipa kapiler menjadi dua bagian

5. Diambil sampel menggunakan ujung pipa kapiler yang sidah dipatahkan

6. Ditotolkan pada titik penotolan ( dibuat lebih dari satu titik dengan jarak tertentu)

7. Diulangi penotolan pada titik yang sama berulang-ulang, selanjutnya

dikeringanginkan

8. Dimasukkan plat kedalam chamber yang berisi eluen

9. Chamber ditutup dengan gelas arloji

10. Dibiarkan sampai eluen berada pada batas atas yang telah dibuat

15 cm

5 cm

1,5

cm1,

5 cm Batas Eluen

Titik penotolan

Batas atas eluen

e. Pengamatan Bercak Noda

1. Diambil plat dari chamber

2. Diamati adanya bercak noda pada sinar biasa (ditandai menggunakan pensil)

3. Diamati adanya bercak noda pada Sinar UV 365 nm (ditandai menggunakan pensil)

4. Dihitung nilai Rf dengan rumus:

DAFTAR PUSTAKA

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ISOFLAVON DARI KACANG KEDELAI

(Glycine max) , I. A. R. Astiti Asih , Juirusan Kimia FMIPA Universitas Udayana,

ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methode .

ISOFLAVON KEDELAI DAN POTENSINYA SEBAGAI PENANGKAP

RADIKAL BEBAS [Soybean Isoflavone and Its Potentially as Scavenger Free Radicals] ,.Sussi

Astuti 1) 1) Staf Pengajar Jurusan Teknologi Industri Pertanian Fakultas Pertanian Universitas

Lampung Jl. Prof. Soemantri Brojonegoro No. 1 Bandar Lampung,

Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid . Padmawinata K, penerjemah. Bandung:

Penerbit ITB. Terjemahan dari: Techniques of Flavonoid Identification

Harborne JB.1987. Metode Fitokimia . Padmawinata K, Soediro I, penerjemah; Niksolihin S,

editor. Bandung