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SCREENING DE FUNGOS RIZOSFÉRICOS COM CAPACIDADE DE DEGRADAÇÃO DO HERBICIDA ATRAZINA

SCREENING OF FUNGI RHIZOSPHERE WITH CAPACITY HERBIC IDE DEGRADATION ATRAZINE

ÉDEM WAYNE DE SOUZA ALVES1; JOSÉ FÁBIO FRANÇA ORLANDA2

RESUMO A atrazine (2-cloro-4-etilamina-6-isopropilamina-striazina) é um herbicida da classe dos triazínicos, usada intensivamente no controle de ervas daninhas, apresenta baixa biodegradabilidade e elevado potencial de contaminação ambiental. A ação de alguns microrganismos contribui para degradação e perda da atividade biológica desse herbicida no solo, podendo reduzir, dessa forma, o risco de impactos negativos. O objetivo deste trabalho foi selecionar fungos de solos rizosféricos em diferentes culturas com potencial de degradação do herbicida atrazina. Os resultados mostraram que das vinte linhagens testadas, dez pertencentes aos gêneros Aspergillus e Syncephalastrum foram selecionadas com potencial de degradação do herbicida. Desse modo, as linhagens isoladas de cultura de amendoim (AM 01), mandioca (MA 01, MA 02, MA 03, MA 04, MA 05 e MA 06) e milho (MI 01, MI 02 e MI 03) apresentaram crescimento considerado ótimo ou satisfatório, em meio com atrazina como única fonte de carbono na concentração de 10,0 µg mL-1 de atrazina. A linhagem MA 06 identificada como Aspergillus niger apresentou melhor adaptação frente a altas concentrações, sendo a única capaz de apresentar crescimento satisfatório na concentração de 100,0 µg mL-

1 de atrazina. No entanto, para que estas linhagens sejam consideradas como ferramenta para desintoxificação ambiental é necessário que estudos posteriores sejam conduzidos, no sentido de monitoramento da viabilidade celular dos fungos no ambiente, sua competitividade e capacidade degradativa, além dos possíveis impactos para a microbiota nativa pela sua introdução. Palavras-chave: atrazina, fungos, degradação. ABSTRACT The atrazine (2-chloro-4-ethylamino-6-isopropylamino-striazina) is a class of triazine herbicide, used extensively in the control of weeds, has low biodegradability and high potential for environmental contamination. The action of some microorganisms contributes to degradation and loss of biological activity of this herbicide in the soil, diminishing, thus, the risk of negative impacts. The aim of this work was to select the rhizosphere soil fungi in different crops with potential for degradation of atrazine. The results showed that of the twenty strains tested ten belonging to the genera Aspergillus and Syncephalastrum were selected potential degradation of the herbicide. Thus, the strains isolated from peanut crop (AM 01), cassava (MA 01, MA 02, MA 03, MA 04, MA 05 and MA 06) and maize (MI 01 , MI 02 and MI 03) grew regarded excellent or satisfactory in medium with atrazine as the sole carbon source at a concentration of 10.0 µg mL-1 of atrazine. The MA 06 strain identified as Aspergillus niger showed better adaptation against high concentrations, being the only one able to provide satisfactory growth at a concentration of 100.0 µg mL-1 atrazine. However, for these strains are considered as a tool for environmental detoxification is necessary that further studies be conducted in order to monitor the cell viability of fungi in the environment, competitiveness and degradative capacity, and the potential impacts to native microbiota for their introduction. Keywords: atrazine, fungi, degradation.

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1. INTRODUÇÃO Os herbicidas constituem um dos

grupos mais representativos de poluentes no meio ambiente, devido ao seu uso intensivo na agricultura em quantidades elevadas para a obtenção de alta produtividade em grandes áreas de cultivo (DELLAMATRICE et al., 2012; INOUE et al., 2011; CHOUDHORY et al., 2008).

Uma classe de herbicidas muito utilizadas em diferentes tipos de cultura são as s-triazinas.

A atrazina (2-cloro-4-etilamina-6-isopropilamina-s-triazina) é um herbicida da classe dos triazínicos, mais utilizados mundialmente, embora já tenha sido proibida sua utilização em alguns países (ARIAS-ESTÉVEZ et al., 2008). A molécula é formada por um anel aromático hexamétrico simétrico constituído alternadamente por três átomos de carbono e três átomos de nitrogênio, possuindo um cloro na posição 2 do anel aromático, o que faz com que seja ainda classificada como uma clorotriazina, como pode ser observado na Figura 01 (BAIRD, 2002).

Figura 01. Estrutura molecular do herbicida atrazina.

Esse herbicida seletivo é indicado para o controle de plantas invasoras anuais dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas nas culturas de milho (Zea mays), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) e sorgo (Sorghum bicolor), com aplicação em pré ou pós-emergência (COMPÊNDIO DE DEFENSIVOS AGRÍCOLAS, 2005; SANCHES et al., 2003).

O mecanismo de ação ocorre através de inibição da fotossíntese, pela interrupção

da reação de Hill, promovendo o bloqueio o transporte de elétrons. As plantas sensíveis a esse herbicida sofrem de clorose, que é o amarelamento das folhas, acarretando assim a necrose dos tecidos (UETA, 2001).

A atrazina é uma base fraca, com características polares (YEN et al., 2003), sofrendo reações de degradação no meio ambiente, formando classes de metabólitos diversos. Essas reações ocorrem em diversos estágios de degradação, promovendo a desaminação, desalquilação (SANCHES et al., 2003) e descloração.

O tempo de meia vida da atrazina em solo pode variar de 2 meses a 6 anos, dependendo das condições do meio apresentando vários metabólitos, que possuem diferentes graus de toxicidade vida, sendo os mais comuns a hidroxiatrazina e a dietilatrazina.

Devido à sua ampla utilização e persistência no ambiente, a atrazina e seus metabólitos são frequentemente encontrados em águas superficiais e subterrâneas (ARIAS-ESTÉVEZ et al., 2008).

A disponibilidade da atrazina e de seus metabólitos para os corpos hídricos, plantas e microrganismos está diretamente relacionada à sua sorção (ARIAS-ESTÉVEZ et al., 2008). Esse fenômeno controla a atividade das moléculas de pesticidas em solução sendo determinante nos processos de degradação (CORREIA et al., 2007), persistência, transporte e lixiviação (CORREIA & LANGENBACH, 2006) e eficiência agronômica (FERRI et al., 2002).

Uma alternativa para a remoção desses compostos do ambiente é pela utilização de microrganismos rizosféricos com a habilidade de biotransformar ou degradar pesticidas a partir de um ecossistema especial tem se mostrado crescente (BERG e SMALLA, 2009; OLIVEIRA et al., 2008; MELO e AZEVEDO, 2008).

Dentre os microrganismos que estão presentes em solos rizosférios, temos os

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fungos. Os fungos possuem grande variedade e habilidade para degradar materiais naturais ou não complexos e persistentes no solo. Além da excelente bioatividade e do crescimento morfológico, os fungos possuem também capacidade de se desenvolver sob condições ambientais de estresse como meio com baixos valores de pH, pobres em nutriente e com baixa atividade de água, o que favorece o seu crescimento diante de outros microrganismos (ATAGANA et al., 2006; MOLLEA et al., 2005).

Portanto, os fungos representam uma alternativa bastante atrativa e promissora para aplicação na biorremediação.

Com isso, o presente trabalho teve como objetivo selecionar e identificar linhagens fúngicas capazes de crescimento em meio de cultivo contaminadas com atrazina em condições de laboratório. MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos no

Laboratório de Biotecnologia Ambiental (LABITEC) do Departamento de Química e Biologia, Universidade Estadual do Maranhão, Campus de Imperatriz, onde foi realizado o isolamento, seleção e identificação de linhagens fúngicas isoladas de solos rizosféricos com possível capacidade de biodegradação do herbicida atrazina em meio aquoso. Linhagens fúngicas

Para a realização dos testes de degradação biológica foram selecionadas vinte linhagens fúngicas preservadas na micoteca do Laboratório de Biotecnologia Ambiental (LABITEC).

Estas linhagens foram isoladas de amostras de solo coletadas na região próxima as raízes (rizosfera), na profundidade de 0 a 5 cm (horizonte A), das culturas de mandioca, milho e amendoim, sendo denominadas de acordo com a Tabela 01.

Tabela 01. Código das linhagens fúngicas e o tipo de cultura de cada solo rizosférico.

Linhagens Fúngicas

Solo Rizosférico

MA 01 Cultura de mandioca MA 02 Cultura de mandioca MA 03 Cultura de mandioca MA 04 Cultura de mandioca MA 05 Cultura de mandioca MA 06 Cultura de mandioca MA 07 Cultura de mandioca MA 08 Cultura de mandioca MA 09 Cultura de mandioca MI 01 Cultura de milho MI 02 Cultura de milho MI 03 Cultura de milho MI 04 Cultura de milho MI 05 Cultura de milho MI 06 Cultura de milho AM 01 Cultura de amendoim AM 02 Cultura de amendoim AM 03 Cultura de amendoim AM 04 Cultura de amendoim AM 05 Cultura de amendoim

Seleção de fungos potencialmente aptos para a degradação do herbicida atrazina

A seleção de fungos com potencial de

degradação do herbicida atrazina foi realizada da através da inoculação em triplicata das linhagens fúngicas em meio de cultura Katayama proposto por Silva, Melo e Oliveira (2004), utilizando a atrazina em diferentes concentrações (0, 10, 20, 50 e 100 µg mL-1). As placas de Petri foram vedadas com ParafilmTM e incubadas a 28 ºC por quatorze dias.

As linhagens fúngicas que apresentaram melhor crescimento em meio com atrazina como única fonte de carbono, consideradas potenciais degradadoras, foram selecionadas para os ensaios de degradação. Crescimento micelial das linhagens selecionadas em meio suplementado com atrazina em várias concentrações

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As linhagens fúngicas selecionadas foram plaqueadas em triplicata através de uma inoculação pontual no centro de cada placa de Petri contendo o meio de cultura Potato Dextrose Agar (BDA), suplementado com diferentes concentrações de atrazina vedadas com ParafilmTM e incubadas durante 7 dias a 28 ºC. O desenvolvimento das colônias foi avaliado nos três primeiros dias registrando-se, nessas datas, o diâmetro da colônia, em cada placa.

As taxas médias de crescimento micelial foram calculadas em cada linhagem, nos meios com as diferentes concentrações de atrazina. Foram calculadas taxas de crescimento relativas nas várias concentrações, expressando a taxa de crescimento em cada concentração, como fração da respectiva taxa de crescimento no meio sem atrazina.

A inibição máxima do crescimento em cada linhagem foi estimada dividindo-se a variação entre a taxa de crescimento mínima e a taxa de crescimento na concentração zero, pela taxa de crescimento na concentração zero.

Dessa forma, as taxas de crescimento relativo e inibição máxima foram calculadas de acordo com as equações (1) e (2):

Tr =

��

��� x 100 (Equação

01) Ti =

�� ���

�� x 100 (Equação 02)

Onde: Tr = Taxa de crescimento relativo Ti = Taxa de inibição máxima Tz3 = Taxa de crescimento na concentração (0 µg mL-1) após o 3º dia Tz1 = Taxa de crescimento na concentração (0 µg mL-1) após o 1ºdia Tt = Taxa de crescimento mínimo com atrazina (µg mL-1) Identificação das linhagens fúngicas

A identificação dos fungos selecionados foi realizada empregando observação do

meio de cultura BDA, após o período de incubação de 7 dias em placas de Petri. As colônias foram observadas em lupa eletrônica para observação das características macromorfológicas (cor, aspecto, textura da colônia, superfície, pigmento difusível no meio de cultura, etc.) e do tipo e local das estruturas esporulantes, além da velocidade de crescimento (lenta, moderada ou rápida).

Para o exame microscópico foram preparadas lâminas em água e coradas com azul de metileno com pequenos pedaços das colônias, levando parte do micélio e das estruturas de frutificação, para observação das características micromorfológicas como a forma e cor da hifa, tipo de micélio (septado ou não); estrutura da colônia (tamanho, cor e textura), tipo e arranjo de esporos, estrutura (tamanho, cor e textura) do conidióforo e conídios/ esporângios e esporangióforos e estruturas de resistência (clamidósporos) ou estruturas contendo esporos como clestotécio.

Esses dados foram comparados à chave de classificação dada por Barnett e Hunter (1972). Dessa forma, a identificação das linhagens foi confirmada por sua caracterização morfológica e pela comparação com descrições da espécie disponíveis na literatura.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Das vinte linhagens selecionadas, apenas dez foram avaliadas quanto à capacidade de crescimento em presença de atrazina na concentração de 10,0 µg mL-1, como mostra a Tabela 02. As linhagens selecionadas foram isoladas de solo com cultura de amendoim (AM 01), mandioca (MA 01, MA 02, MA 03, MA 04, MA 05 e MA 06) e milho (MI 01, MI 02 e MI 03)

Tabela 02. Crescimento de linhagens fúngicas em meio líquido suplementado com atrazina na concentração de 10,0 µg mL-1, após 14 dias de incubação.

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Fungos Concentração (10 ,0 µg

mL -1) MA 01 +

MA 02 + +

MA 03 +

MA 04 + +

MA 05 ++

MA 06 + +

MA 07 - -

MA 08 + -

MA 09 - -

MI 01 +

MI 02 +

MI 03 + +

MI 04 + -

MI 05 + -

MI 06 - -

AM 01 +

AM 02 - -

AM 03 + -

AM 04 - -

AM 05 - -

*-- Crescimento ruim (10 mm); + - Crescimento razoável (40 mm); + Crescimento satisfatório (60 mm); ++ Ótimo crescimento (80 mm)

Crescimento micelial das linhagens selecionadas em meio suplementado com atrazina em várias concentrações

As dez linhagens selecionadas foram submetidas a análises para verificar o grau de adaptabilidade em função do tempo na presença do meio BDA suplementado com atrazina nas concentrações de 0, 10, 20, 50 e 100,0 µg mL-1. O desenvolvimento das colônias foi avaliado nos três primeiros dias registrando-se, nessas datas, o diâmetro da colônia, em cada placa de Petri.

A Figura 01 mostra o crescimento micelial dos fungos MA 02, MA 06, MI 01 e MI 03 no 2º dia de incubação em meio BDA com atrazina na concentração de 20,0 µg mL-1, esse crescimento demonstra a rápida adaptabilidade dessas linhagens na presença de atrazina.

Figura 02. Diâmetros das colônias das linhagens fúngicas MA 06 (A), MI 03 (B), MI 01 (C) e MA 02 (D) em meio BDA com atrazina na concentração de 20,0 µg mL-1. Crescimento médio

A média dos resultados relativos ao crescimento em cada placa é demonstrada no Gráfico 01.

Gráfico 01. Crescimento médio (expresso em mm) de linhagens fúngicas em meio BDA suplementado com atrazina nas concentrações (0, 10, 20, 50 e 100,0 µg mL-1), após 3 dias de incubação.

De acordo com o Gráfico 01, o nível de

crescimento fúngico variou de acordo com a concentração de atrazina. De uma forma geral, à medida que se aumenta a concentração de atrazina, as linhagens fúngicas apresentam maior dificuldade em

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1100

2

4

6

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10

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26

28

Cre

scim

ento

Méd

io (

mm

)

Concentração (µg mL-1)

AM01 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 MA06 MI01 MI02 MI03

(A) (B)

(C) (D)

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utilizar o herbicida. Isso indica que mesmo as linhagens possuem um limite de exposição ao herbicida, e caso este seja ultrapassado o limite de absorção pode se tornar tóxico aos microrganismos presentes.

Isto se evidencia ao considerar a média de crescimento da linhagem MA 01, sendo que esta linhagem apresentou crescimento razoável até a concentração de 20,0 µg mL-1 (9,33 mm), sofrendo um grande decréscimo na concentração de 50,0 µg mL-1 (1,40 mm) e inibição total do crescimento na concentração de 100,0 µg mL-1.

Assim, as quatro linhagens que demonstraram o melhor crescimento médio em presença de atrazina após três dias foram MA 06, MA 05, MI 02 e MA02 (Gráfico 01).

Crescimento relativo

A taxa de crescimento relativo

demonstra a porcentagem de crescimento de cada linhagem fúngica, considerando apenas a atrazina como fonte de carbono independentemente do meio de cultura utilizado na análise (BDA), como mostra o Gráfico 02.

Gráfico 02. Taxa de crescimento relativo (expressa em %) de linhagens fúngicas em meio BDA suplementado com atrazina nas concentrações (0, 10, 20, 50 e 100,0 µg mL-1), após 3 dias de incubação.

Os resultados demonstrados no Gráfico 02 mostram que as taxas de crescimento

relativo para cada linhagem confirmam que para os fungos analisados, a concentração de 20,0 µg mL-1 é mais favorável para seu crescimento. Com exceção da linhagem MA 05 que apresentou melhor crescimento na concentração de 10,0 µg mL-1.

De acordo com as quatro maiores taxas se referem respectivamente às linhagens MA 02 (339,96 %), MA 06 (319,91 %), MI 03 (319,50 %) e MA 03 (275,08 %).

Inibição máxima

A taxa de inibição máxima demonstra em porcentagem o quanto o atrazina inibiu o crescimento de cada linhagem após 24 horas de exposição ao herbicida. Pois compara quantitativamente o crescimento nas primeiras 24 horas em meio sem atrazina e o crescimento nas quatro concentrações depois das primeiras 24 horas. Os resultados obtidos são demonstrados no Gráfico 03.

Gráfico 03. Taxa de inibição máxima (expressa em %) de linhagens fúngicas em meio BDA suplementado com atrazina nas concentrações (0, 10, 20, 50 e 100,0 µg mL-1), após 1 dia de incubação.

Os resultados obtidos no Gráfico 03

demonstram que a linhagem MA 01 foi a que sofreu maior inibição, pois a partir da concentração 50,0 µg mL-1 ela não apresentou crescimento microbiano, ou seja, o atrazina inibiu em 100% seu crescimento. Os sinais negativos indicam estimulação do crescimento.

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0

50

100

150

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300

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Tax

a de

Cre

cim

ento

Rel

ativ

o (%

)

Concentração (µg mL-1)

AM01 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 MA06 MI01 MI02 MI03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110-275

-250

-225

-200

-175

-150

-125

-100

-75

-50

-25

0

25

50

75

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125

Tax

a de

Inib

ição

Máx

ima

(%)

Tempo (horas)

AM01 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 MA06 MI01 MI02 MI03

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As linhagens que apresentaram altas taxas de inibição às linhagens MA 05 (92,11% em 100,0 µg mL-1), MI 03 (85,98% em 20,0 µg mL-1), AM 01 (79,36% em 100,0 µg mL-1), como mostra o Gráfico 03.

A linhagem MI 03 apresentou um comportamento diferente em relação às demais linhagens (Gráfico 03), pois apresentou uma alta taxa de inibição na concentração de 20,0 µg mL-1, seguida de uma grande queda de inibição na concentração de 50,0 µg mL-1, e em sequência, um aumento de inibição de crescimento na concentração de 100,0 µg mL-1.

Isto pode ter ocorrido, pois a taxa de inibição máxima considera o crescimento após o 1º dia de incubação e esta linhagem não conseguiu se adaptar ao meio com a concentração de 20,0 µg mL-1, pois no 2º e 3º dia ela demonstrou crescimento normal, inclusive igualando seu crescimento ao das outras linhagens fúngicas (Gráficos 01 e 02).

Identificação das linhagens fúngicas

Os fungos AM 01 e MA 05 foram identificados como do gênero Syncephalastrum; os fungos MA 01, MA 02, MA 03, MA 04, MA 06, MI 01, MI 02 e MI 03 como Aspergillus, como mostra a Tabela 05. Tabela 05. Identificação das linhagens fúngicas com capacidade de crescimento em meio com atrazina.

Linhagens Fúngicas

Identificação

AM 01 Syncephalastrum sp.

MA 01 Aspergillus sp.

MA 02 Aspergillus ochraceus

MA 03 Aspergillus ochraceus

MA 04 Aspergillus ochraceus

MA 05 Syncephalastrum sp.

MA 06 Aspergillus niger

MI 01 Aspergillus sp.

MI 02 Aspergillus ochraceus

MI 03 Aspergillus sp.

A linhagem MA 06, identificada como

Aspergillus niger apresentou elevada capacidade de crescimento em meios contendo 100,0 µg mL-1 de atrazina, indicando a possibilidade desses fungos serem usados em outros estudos de biorremediação em solos contaminados com pesticidas triazínicos.

CONCLUSÃO

Os resultados mostraram que das vinte linhagens testadas, dez foram selecionadas como potencialmente degradadoras do herbicida atrazina, sendo elas as seguintes: AM 01 (Syncephalastrum sp.), MA 01 (Aspergillus sp.), MA 02 (Aspergillus ochraceus), MA 03 (Aspergillus ochraceus), MA 04 (Aspergillus ochraceus), MA 05 (Syncephalastrum sp.), MA 06 (Aspergillus niger), MI 01 (Aspergillus sp.), MI 02 (Aspergillus ochraceus) e MI 03 (Aspergillus sp.).

A linhagem MA 06 (Aspergillus niger) apresentou melhor adaptação frente a altas concentrações (100,0 µg mL-1). No entanto, para que estas linhagens sejam consideradas como ferramenta para desintoxificação ambiental é necessário que estudos posteriores sejam conduzidos, no sentido de monitoramento da viabilidade celular dos fungos no ambiente, sua competitividade e capacidade degradativa, além dos possíveis impactos para a microbiota nativa pela sua introdução. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARIAS-ESTÉVEZ, M., LÓPEZ-PERIAGO, E., MARTÍNEZ-CARBALLO E., SIMAL-GÁNDARA, J., MEJUTO, J.C., GARCÍA-RÍO, L. The mobility and degradation of pesticides in soils and the pollution of groundwater resources. Agriculture,

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