Upload
khoirilliana12
View
55
Download
5
Embed Size (px)
Citation preview
Elektroforesis protein dan Gel
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu
medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung
pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat
digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi
molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau
autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang
digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang
banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang
dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE =
poly-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.
Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan
komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam
suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke
elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis
untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya.
Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis natif,
protein dipisahkan dalam bentuk aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk
molekul tersebut. Satu lagi bentuk elektroforesis yang selalu digunakan bagi
pemisahan protein ialah elektroforesis penyahaslian. Elektroforesis gel
poliakrilamid (PAGE) dengan suatu detergen anion, sodium dodesil sulfat (SDS)
digunakan untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein dilarutkan
didalam suatu larutan penimbal yang mengandungi SDS dan agen penurun,
merkaptoetanol atau ditiotreitol, untuk menceraikan protein menjadi subunit dan
menurunkan ikatan disulfat (Rajah 1). Protein bergabung dengan SDS lalu bercas
negartif, dan dipisahkan hanya berdasarkan saiz.
Tatakerja:
Sebuah pembekal kuasa dan radas elektroforesis mengandungi matrik gel
poliakrilamid dan dua takungan (reservoir) larutan penimbal adalah diperlukan
ubtuk menjalankan satu pemisahan. Contoh gel keping dan unit elektroforesis
ditunjukkan didalam Rajah 2. Sumber kuasa digunakan untuk menwujudkan
medan elektrik dengan menyediakan suatu sumber arus, voltan atau kuasa yang
konstan. Penimbal elektrod mengawal pH bagi mengekalkan cas yang sesuai pada
protein dan menkonduksikan arus melalui gel poliakrilamid. Sistem penimbal
yang biasa digunakan termasuklah penimbal anionik tris-(hidroksimetil)amino
metan dengan gel pelerai (desolving gel) pada pH 8.8 dan penimbal asetat yang
kationik pada pH 4.3.
Matrik gel poliakrilamid terbentuk melalui pempolimeran akrilamid dengan
sedikit (selalunya 5% atau kurang) reagen pempaut silang (cross-linking) N.N’-
metilen-bisakrilamid dengan kehadiran satu mangkin, tetrametiletilendiamin
(TEMED) dan sumber radikal bebas, amonium persulfat seperti ditunjukkan
didalam Rajah 3. Gel boleh disediakan didalam makmal atau dibeli siap diacu
(pre-cast).
Matrik gel tak selanjar (discontinuous) selalunya digunakan untuk memperbaikki
peleraian (resolution) protein didalam campuran yang kompleks. Matrik tak
selanjar terdiri dari satu gel penimbun (stacking gel) dengan saiz liang yang besar
(selalunya 3-4% akrilamid) dan satu gel pelerai (resolving gel) yang mempunyai
saiz liang yang kecil. Gel penimbun, seperti yang dimaksudkan dengan namanya,
digunakan untuk menimbunkan atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang
sempit sebelum protein itu memasukki gel pelerai (Rajah 4).
Pada pH 6.8, satu kecerunan voltan terbentuk diantara ion klorid (cas negatif
tinggi) dan glisin (cas negatif rendah) didalam penimbal elektrod yang bertujuan
menimbunkan protein menjadi jalur-jalur sempit diantara ion-ion. Migrasi
kedalam gel pelarian (running gel) yang mempunyai pH berlainan (pH 8.9)
mengganggu kecerunan voltan ini lalu membenarkan pemisahan protein menjadi
jalur-jalur yang diskrit.
Saiz liang gel pelarian dipilih berdasarkan berat molekul protein yang hendak
dipisahkan dan boleh diubah dengan cara menukar kepekatan akrilamid didalam
larutan. Protein selalunya boleh dipisahkan pada gel pelarian yang mengandungi 4
ke 15 peratus akrilamid. Kepekatan akrilamid 15 peratus selalunya digunakan
untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul dibawah 50,000.
Protein yang mempunyai berat molekul lebih besar dari 50,000 lazimnya
dipisahkan pada gel yang kepekatan akrilamidnya dibawah 7 peratus. Satu gel
kecerunan (gradient gel) dimana kepekatan akrilamis meningkat dari atas
kebawah gel selalunya digunakan untuk memisahkan satu campuran protein yang
mempunyai banjaran berat molekul yang luas.
Bagi menjalankan sesuatu pemisahan, protein didalam penimbal yang sesuai
pHnya dimuatkan disebelah atas gel penimbun. Pewarna penjejak (tracking dye)
bromofenol biru ditambahkan kedalam larutan protein. Pewarna ini molekul kecil
yang migrasi terdahulu daripada dan digunakan untuk memonitor kemajuan
sesuatu pemisahan. Selepas sesuatu larian (run) elektroforesis, jalur-jalur yang
terdapat pada gel umumnya divisualkan dengan menggunakan pewarna (stain)
protein seperti Coomassie Brilliant Blue atau pewarna timah (silver stain).
Pewarna enzim spesifik atau antibodi boleh juga digunakan untuk mengesan
sesuatu protein.
Kegunaan:
Elektroforesis selalunya digunakan untuk menentukan komposisi protein sesuatu
produk makanan. Sebagai contohnya, perbezaan yang terdapat didalam komposisi
protein dari protein pekatan kacang soya dan pekatan protein weiyang dihasilkan
melalui teknik pemisahan yang berlainan boleh dikesan. Elektroforesis boleh juga
digunakan untuk menentukan ketulenan sesuatu ekstrak protein.
SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan
untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun
protein yang bercas tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang
besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein
dengan Rm protein piawai yang diketahui berat molekulnya (Rajah 5). Piawai
protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran
berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul
protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein
tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.
2. Pemfokusan Isoelektrik (Isoelectric Focusing)
Prinsip:
Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam
kes ini, protein dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel
yang telah diwujudkan kecerunan pH menggunakan amfolit (ampholytes). Protein
difokuskan atau migrasi ke lokasi didalam kecerunan dimana pH sama dengan pI
protein tersebut (Rajah 6). Peleraian yang diperolehi adalah diantara yang paling
tertinggi untuk sebarang teknik pemisahan protein dan boleh digunakan untuk
memisahkan protein yang mempunyai pI berbeza kurang dari 0.02 unit pH.
Tatakerja:
Satu kecerunan pH diwujudkan menggunakan amfolit, iaitu polimer kecil (berat
molekul kira-kira 5000 dalton) yang mengandungi kedua-dua kumpulan bercas
positif dan negatif. Suatu campuran amfolit terdiri dari beribu-ribu polimer yang
mempamirkan satubanjaran nilai pK. Amfolit ditambahkan kedalam larutan gel
sebelum pempolimeran dijalankan. Selepas gel terbentuk dan arus dialirkan,
amfolit ini bermigrasi lalu membentuk kecerunan pH; amfolit yang bercas negatif
akan migrasi kearah anod, manakala yang bercas positif kearah katod. Campuran
amfolit boleh diperolehi yang merangkumi banjaran pH yang sempit (2-3 unit)
atau satu banjaran yang lebar (pH 3-10) dan perlulah dipilih untuk digunakan
berdasarkan ciri-ciri protein yang hendak dipisahkan.
Kegunaan:
Pemfokusan isoelektrik merupakan kaedah pilihan untuk menentukan titik
isoelektrik sesuatu protein dan sZt. Pemfokusan isoelektrik juga digunakan untuk
membedakan spesis ikan yang berhubungan rapat dengan berdasarkan corak
proteinnya.
ELEKTROFORESIS GEL
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan
oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan
berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel.
Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan.
Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula
digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning,
sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode
karakterisasi lebih lanjut.
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering
dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini
mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan
perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap
campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip
dalam elektroforesis
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked)
yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan
protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel
yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan
konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan
pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan
ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar
(lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari
ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)
pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan
kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel
ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat,
arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif
alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju
perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk
menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi
dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar
molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau
pewarna “biru Coomassie” (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan
ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah
“diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika
molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.