Hay un ADN en mi quesadilla

http://www.ei.udelar.edu.uy

Conjunto de acciones, medidas y procedimientos técnicos que permite identificar y registrar cada producto

desde su nacimiento hasta el final de la cadena de comercialización.

Trazabilidad

D. Posik, 2012

¿Qué es la Trazabilidad Alimentaria?

‘‘Es la habilidad para trazar y seguir un animal, un alimento o un ingrediente a través de todos las etapas de producción y distribución’’ [Regulación Europea (ER) 178/2002].

“Se define como la capacidad de establecer la historia de los procesos de origen de un producto, su uso y procedencia mediante referencia a un registro escrito’’ (Normas ISO 8402).

D. Posik, 2012

Por qué la Trazabilidad Alimentaria?

Protección al consumidorCumplimiento de normas legalesFraudes AlimentariosCompetencia deslealSeguridad alimentariaCambios socio-económicosDesarrollo de nuevas normas

Seguridad alimentaria

Priones: BSE (Bovine spongiform encephalopathy)

Virus: influenza aviar

Contaminación bacteriana E. coli 0157:H7 Salmonela Listeria Clostridium

Contaminantes medioambientales:

dioxinas, fenoles, PCBs , metales, etc.

Organismos genéticamente modificados (OGMs)

D. Posik, 2012

Cambios socio-económicos

demanda de productos de calidadbuena higiene alimentariarechazo al consumo de OGMsglobalización del mercadomayor demanda de productos orgánicosreducción en las características organolépticas

(gusto, terneza)mayor preocupación por sistemas eco-sustentablesdificultad del consumidor de controlar los procesos

de procesamiento de alimentosD. Posik, 2012

Control de calidad

Legal y comercial

Trazabilidad

Genética

Biología Molecular Zootecnia y

fitotecnia

Informática

Tecnología de los alimentos

Leyes

Algunas áreas de trazabilidadAlgunas áreas de trazabilidad

D. Posik, 2012

Trazabilidad convencional

Diferentes métodos de identificación han sido utilizados: caravanas, bolos ruminales, documentación de cada animal, código de barras, packaging, etc. El sistema debe estar asociado a una gran base de datos precisa, accesible y mantenida por un largo período de tiempo.

D. Posik, 2012

Métodos Analíticos Convencionales (no basados en el ADN)• Espectroscopías• Espectroscopía IR (infra–rojo) - Fourier

transform IR (FTIR) | Mid-infrared IR (MIR) | Near-infrared IR (NIR)-

• Espectroscopía NMR - Low resolution NMR & High resolution NMR (e.g., site specific natural isotope fractionation (SNIF)-

• Técnicas Espectrofotométricas (UV, IR)• Espectroscopías Atómicas• Espectroscopía de Absorción Atómica

(AAS)• Espectroscopía de Emisión Atómica (AES)

Métodos Analíticos

• Espectrometría de Masas • Espectrometría de masas isotópica (IRMS)• Espectrometría de masas inductivamente

acoplada de plasma (ICP-MS)• Espectrometría de masas de reacción de

transferencia de protones (PTR-MS)• Espectrometría de masas acoplada a

cromatografía en fase gaseosa (GC-MS)

An overview of analytical methods for determiningthe geographical origin of food products.

D.M.A.M. Luykx, S.M. van Ruth / Food Chemistry 107 (2008) 897–911

•Espectrometría de masas isotópica (IRMS)

D. Posik, 2012

Trazabilidad Geográfica

Identificar el origen geográfico de un producto a través del estudio de ‘‘track elements’’ (componentes volátiles, flora microbiana, isótopos estables y espectroscopia infrarroja).

D. Posik, 2012

Medición de la relación de isótopos estables mediante un espectrómetro de relación de masa isotópica (IRMS)

D. Posik, 2012

D. Posik, 2012

Métodos Analíticos

• Separaciones• Métodos Cromatográficos (GC, LC, TLC,

HPLC) - High performance liquid chromatography (HPLC) | Gas chromatography (GC) | Capillary electrophoresis (CE)

Métodos Analíticos Convencionales (no basados en el ADN)

• Otros

• Métodos enzimáticos• Inmunoensayos enzimáticos

Métodos Analíticos No - Convencionales (basados en el ADN)

Se basa en la identificación de los organismos y

sus productos a través del estudio del ADN.

Es inalterable a lo largo de la vida del organismo.

Esta presente en todas las células.

Es estable a los diferentes tratamientos (de

procesamientos) de los alimentos.

La aplicación de las innovaciones tanto genéticas como bioinformáticas enlos análisis de la trazabilidad puede abordarse desde dos perspectivas:

(1)Trazabilidad de un alimento desde su origen, muy utilizada en el caso de productos decalidad con denominación de origen, la identificación del animal vivo y el control de genealogías.

(2) Autentificación de una especie, variedad o del origen geográfico de un alimento.

ANTECEDENTES

• El análisis por PCR permite hallar e identificar remanentes de ADN en matrices complejas como lo son los alimentos procesados.

• Esto permite identificar las distintas especies vegetales o animales, declaradas o no, que forman parte de un producto alimenticio cuya composición escapa a la sensibilidad de nuestros sentidos.

• La robustez de esta técnica radica en que si bien la cocción, el pH y la presencia de agentes químicos pueden degradar el ADN y alterar la estructura, ninguno de estos procesos puede alterar la secuencia de bases nitrogenadas, la cual en ciertas regiones génicas hace única a cada especie.

Marcadores Genéticos

Cualquier característica física o molecular heredada que difiere entre individuos y es fácilmente detectable en el laboratorio como potencial marcador genético.

Los marcadores para ser útiles en mapeo deben ser polimórficos (deben existir formas alternativas entre individuos de forma tal que se puedan diferenciar entre los diferentes miembros de las familias en estudio)

Trazabilidad genética individualTrazabilidad genética de raza o cultivarTrazabilidad genética especie específica

D. Posik, 2012

Microsatélites

Regiones variables (polimórficas) del ADN nuclear que consta de repeticiones de 1 a 6 nucleótidos que se ubican uno tras otro. La variación en el número de repeticiones crea diferentes variantes (alelos) los cuales se distinguen entre sí por la longitud total del fragmento.

D. Posik, 2012

campo faena góndola

8786.2

8988.2

9190.2

9392.2

9594.1

9796.2

9998.2

236234.9

238236.8

240238.9

242241.1

244242.8

246244.8

248246.8

250248.8

252251.1

254253.0

256255.0

G01 060224_CTD_DogRun01 CTD7

0

100

200

300

400

500

227232.0

229233.8

231235.6

233237.6

235239.4

237241.2

239243.2

241245.2

243247.2

245249.0

B02 060309_CT_DOG CT2

0

100

200

300

400

500

600

235245

192191.4

194193.1

196195.1

198197.1

200199.2

202201.2

204203.3

206205.2

208207.1

210209.3

212211.6

D01 060309_CT_DOG CT15

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

199

201

220223.5

222225.4

224227.5

226229.5

228231.6

230233.7

232235.9

234237.9

236239.9

238241.8

240243.6

E02 060228_TC_EqDogRun01 CTD18

0

1000

2000

3000

229 239

8786.2

8988.2

9190.2

9392.2

9594.1

9796.2

9998.2

236234.9

238236.8

240238.9

242241.1

244242.8

246244.8

248246.8

250248.8

252251.1

254253.0

256255.0


0

100

200

300

400

500

227232.0

229233.8

231235.6

233237.6

235239.4

237241.2

239243.2

241245.2

243247.2

245249.0

B02 060309_CT_DOG CT2

0

100

200

300

400

500

600

235245

192191.4

194193.1

196195.1

198197.1

200199.2

202201.2

204203.3

206205.2

208207.1

210209.3

212211.6

D01 060309_CT_DOG CT15

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

199

201

220223.5

222225.4

224227.5

226229.5

228231.6

230233.7

232235.9

234237.9

236239.9

238241.8

240243.6


0

1000

2000

3000

229 239

8786.2

8988.2

9190.2

9392.2

9594.1

9796.2

9998.2

236234.9

238236.8

240238.9

242241.1

244242.8

246244.8

248246.8

250248.8

252251.1

254253.0

256255.0


0

100

200

300

400

500

227232.0

229233.8

231235.6

233237.6

235239.4

237241.2

239243.2

241245.2

243247.2

245249.0

B02 060309_CT_DOG CT2

0

100

200

300

400

500

600

235245

192191.4

194193.1

196195.1

198197.1

200199.2

202201.2

204203.3

206205.2

208207.1

210209.3

212211.6

D01 060309_CT_DOG CT15

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

199

201

220223.5

222225.4

224227.5

226229.5

228231.6

230233.7

232235.9

234237.9

236239.9

238241.8

240243.6


0

1000

2000

3000

229 239

D. Posik, 2012

SNP(Single nucleotide

polymorphism = snips)

Es una variación en la secuencia de ADN que

afecta a una sola base de una secuencia del genoma. Estos cambios pueden ser

responsables de causar una enfermedad o afectar la

respuesta de los individuos a bacterias, virus, productos

químicos, fármacos, etc.

D. Posik, 2012

D. Posik, 2012

El ADN de las muestras a analizar, marcado de diferentes maneras, se incuba sobre el panel de sondas permitiendo la

hibridación de los fragmentos homólogos. Donde hubo hibridación podrá verse y cuantificarse la señal emitida por

la marca.

Microarrays de ADN, chips de ADN

D. Posik, 2012

Microarrays = chips de DNA

D. Posik, 2012

Identificación Especie Específica

....|....|....|....|....|....|....|....|

....|....|....|....|....|....|....|....| 10 20 30 40

Especie 1 GCTATCAACAGACTAGCAACTGTGGGTTCAAGCTGGTTAAEspecie 2 GCTATCAACAGACTAGCACAGGCGGGTTCAAGCTGGTTATEspecie 3 GCTATCAACAGACTAGCAAGTGTGGATTCAAGCTCGTTAAEspecie 4 GCTATCAACAGACTAGCAAGTGCGGATGTAGGCTGGGTAAEspecie 5 GCTATCAACAGACTAGCAAGTGTGGATTTAAGCTGGTTAA ****************** * ** * * *** * ** 50 60 70 80

Especie 1 AGAACAGTTTGAATGTCTACGCGGTGGACTTGATTTACTA Especie 2 AGAACAGTTTGAATGTCTCCGCGGGGGACTTGATTTACTA Especie 3 AGAGCTTGTTGAATGTCTTCGTGGTGGCCTTGATTTACTA Especie 4 GGAGCATGTCGAGTGTCTACGCGGTGGACTTGATTTACTA Especie 5 GGAGCGTGTCGAGTGACTACGCGGTGGACTTGATTTACTA * * * ** ** ** ** ** ************

¿Qué es el Barcoding?

Es un método estandarizado para identificar animales y plantas a partir de secuencias de ADN.

www.barcoding.com/

www.barcodinglife.org/

En animales ADNmt, región COI.

En vegetales rbcL, matK, trnH-psbA, atpF-H

¿POR QUÉ ADNmt?

Único para cada especie animal y vegetal.

Alto número de copias por célula.

Grandes diferencias entre especies.

Pocas diferencias dentro de la misma especie.

Ausencia de intrones.

Las distintas especies comparten el mismo conjunto de genes.

BarcodingOf Life

REGIÓN COI

Amplicón: 648 pb.

Fácil de recuperar desde taxas variados, utilizando un set limitado de primers.

Efectivo en distinguir en especies animales relacionadas desde un phylum de vertebrados e invertebrados.

Fácilmente alineable para comparación de secuencias.

VOLVIENDO A LOS VEGETALES

Tasa de sustitución nucleotídica mitocondrial es mucho menor que en animales.

Hibridización presente para este grupo es un problema a la hora de encontrar un locus único para barcoding.

Propuesta: loci multiples. rbcL, matK,trnH-psbA, atpF-H

PCR

Reacción en cadena de la polimerasa

(USA, n. 1944, PN 1993)

Single Cycle

Secuenciación

(Fred Sanger, n. 1918, PN 1958 y 1980)

Escaneado electrónico de secuencias de ADN de cualquier organismo viviente.

Estrategias TraMa

BúsquedasAntecedentes bibliográficos

Google, scholar.google, www.google.com/patents

GenBank, BLAST

Alineamientos

Diseño experimental

Diseño cebadores (primers)

TRAZABILIDAD MOLECULAR ALIMENTARIA

… ADNS QUEDANLaTraMa ::: Laboratorio de Trazabiliad Molecular AlimentariaP Abete, F Alfonso, M Amilibia, M Arleo, J Correa, R Fernández, M Fernández, A Miller, E Miquel, F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, C Martínez DebatSección Bioquímica, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República. Montevideo. Uruguay.

Detección de: Secuencias específicas (transgénesis, OGMs) Especies animales (MeDeA)Especies vegetales (DeVa)

AlergenosDetección de gluten (TACC)Etc.

Algunos resultados de extracciones de ADN…

Embutidos..

Extracción de ADN para quesos (método Dellaporta modificado)

El ADN de cabra que se utilizó como control se extrajo a partir de sangre de cabra QIAGEN BLOOD & TISSUE Kit

Harinas de maíz, “Polentas”

Extracción ADN

Protocolo de extracción con CTAB (Doyle & Doyle 1987) modificado (PTB).

ADNs de salsas de tomate

Volumen: 100 uL

J Pereyra / M Arleo

Extracción y purificación del ADN a partir de matrices alimentarias

Etapas del trabajo

Amplificación mediante PCR

Cuantificación y Control de Calidad del ADN

Análisis de componentes animales en alimentosMeDeA ::: Método de Determinación de Especies

Animales

Ejemplo: Detección de adulteraciones de quesos de cabra con leche de vaca,

mediante técnicas moleculares

MeDeA

A Miller/ M Amilibia / J Correa

Estrategias analíticas• Discriminar vaca y cabra por

diferencias en la secuencia de citocromo b (cytb) de ambas especies mediante:

• Ensayos de PCR con primers reversos específicos para cada especie (Matsunaga et al Meat Science 51 (1999) 143±148)

• RFLP´s de un fragmento de cytb, producto de PCR con primers universales. (Bravi et al. Legal Medicine 6 (2004) 246–251)

RFLPs

• Se utilizaron primers universales para obtener una banda de 358 pb, y luego mediante el corte con enzimas (Alu I y Hinf I) lograr una diferenciación entre especies y ver su desempeño a la hora de comprobar la presencia de leche de vaca en quesos de cabra

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Capra Hircus CCATCAAACA TCTCATCATG ATGAAACTTT GGATCCCTCC TAGGAATTTG L14816 CCATCCAACA TCTCAGCATG ATGAA----- ---------- ---------- ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Capra Hircus CCTAATCTTA CAAATCCTGA CAGGCCTATT CCTAGCAATA CACTATACAT L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Capra Hircus CCGACACAAT AACAGCATTT TCCTCTGTAA CTCACATTTG TCGAGATGTA L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Capra Hircus AATTATGGCT GAATCATCCG ATACATACAC GCAAACGGAG CATCAATATT L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Capra Hircus CTTTATCTGC CTATTCATAC ATATCGGACG AGGTCTATAT TATGGATCAT L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 H15149 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- Capra Hircus ATACCTTTCT AGAAACATGA AACATTGGAG TAATCCTCCT GCTCGCAACA L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 H15149 ---------- ---------- ---------- ---TGAGGAC AAATATCATT Capra Hircus ATGGCCACAG CATTCATAGG CTATGTTTTA CCATGAGGAC AAATATCATT L14816 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ....|... H15149 CTGAGGGGCapra Hircus TTGAGGGGL14816 --------

Sitio de corte para Hinf I

Sitio de corte para Alu I

RFLPs

(Matsunaga et al Meat Science 51 (1999) 143-148)

1-Marcador de peso molecular 50pb, 2- Control + mezcla de 1ul ADN G (cabra)100ng/ul y 1ul ADN K(vaca)100ng/ul,3-Muestra de queso 29, 4- Muestra de queso 30, 5- Muestra de queso 31, 6-Muestra de queso 36, 7- Marcador de peso molecular 50pb, 8-Blanco de extracción, 9- Blanco de PCR

A Miller

Marca Muestra Especies declaradas

Especies encontradas

(datos congruentes con ambas

estrategias) La Chacra (Uy) LCH Cabra Vaca / Cabra

La Pataia (Uy) LP Cabra Vaca / Cabra

Caprino Alto (Uy) CA Cabra Vaca / Cabra

A (Mx) CB Cabra Vaca / Cabra

Queso Tierno (España)

QT Cabra, Vaca y Oveja

Vaca / Cabra

B (Mx) QTB Cabra Vaca / Cabra

Queso untable Conaprole Magretto

(Uy)

UN Vaca Vaca

J Correa

Resultado de la identificación de especies animales y vegetales en quesos y hamburguesas de carne. No se realizó la detección de especies vegetales en quesos.

PRODUCTO ORIGEN ESPECIES ANIMALES DECLARADAS

ESPECIES ANIMALES ENCONTRADAS

ESPECIES VEGETALES DECLARADAS

ESPECIES VEGETALES ENCONTRADAS

Queso (1) Uruguay Cabra Cabra


Queso (3) Uruguay Cabra y vaca Cabra y vaca

Queso (4) Uruguay Cabra Cabra y vaca





Hamburguesa de carne (1) Uruguay Vaca Vaca proteína vegetal y especias soja

Hamburguesa de carne (2) Uruguay Vaca Vaca s/declaración -

Hamburguesa de carne (3) s/información s/información Vaca, Pollo s/información soja

Hamburguesa de carne (4) s/información s/información Vaca s/información -

Hamburguesa de carne (5) Uruguay Vaca Vaca proteína de soja, pimienta soja




Hamburguesa de carne (9) Uruguay s/información Vaca s/información -


A Miller / M Amilibia /J Correa / F San Martín / M Arleo

Descripción del problema• Adulteración con Manzana (Malus

domestica) en matrices alimentarias altamente procesadas. Ejemplo: Pulpa de tomate (Solanum lycopersicum) envasada.

Lic. José Pereyra

DeVasDeterminación de

Especies Vegetales en

Alimentos

Objetivo

• Identificación de ADN de Manzana en Pulpas de tomate envasada

Etapas

• Extracción de ADN– Protocolo de extracción con CTAB (Doyle & Doyle

1987) modificado (PTB)• Busqueda de secuencias en GenBank

– Refseq– Resto de bases de datos

• Analisis de secuencias– Blastn,– Mega 4.0 (clustalW)– Webcutter, GeneRunner

• Amplificación de ADN por PCR • Geles, secuenciación, enzimas de restricción

RESULTADOS

Electroforesis en gel donde se observa los resultados obtenidos para la PCR realizada con cabadores Tab G-H sobre las muestras. Carril 1 al 6: muestras; 7: Tomate(T); 8: Soja (S); 9:T/S; 10: MPM 50 pb; 11: C(-) sin ADN

Pulpa de Tomate

RESULTADOS

Resultado de Blastn de las secuencias obtenidas contra las presentes en el GenBank

El análisis por Blastn de las secuencias “extrañas” empató con secuencias de Soja presentes en el GenBank con alto puntaje y un e-value de 3 x 10 -79.

CONCLUSIONES

Pulpa de tomate

Estrategias Analíticas de Identificación de Especies

Esta metodología permitió determinar que algunas pulpas de tomate contienen de forma enmascarada otros vegetales que no son declarados como parte de sus componentes

De las seis pulpas analizadas 2 resultaron positivas para Soja

Identificación de especies vegetales en dulce de membrillo mediante análisis por PCR

OBJETIVOS

• Desarrollar un procedimiento eficaz para extraer ADN a partir de una matriz compleja como el dulce de membrillo.

• Utilizar métodos rápidos para la identificación de distintas especies vegetales en el material extraído. (PCR, restricción con enzimas).

• Ampliar el estudio utilizando métodos de cuantificación de especies (Real Time-PCR).

Lic. Fabiana Ruibal yMailén Arleo

MATERIALES Y METODOS

Extracción de ADN

• Las muestras de dulces se disuelven en buffer TEN (Tris 10mM, EDTA 10mM, NaCl 0.1 M) a 60ºC, se homogenizan y se filtran a través de filtro tipo Blutex con bomba de vacío.

• Las extracciones de ADN se realizan partiendo de 100-200 mg del filtrado, utilizando distintos métodos.

• Ensayo de inhibición

1-Marcador de peso molecular 50pb2- (-)

3- D. de membrillo de composición conocida (100% Mb)

4- D. de membrillo de composición conocida (50% Mb-50%Mz)

5- D. de membrillo problema (I)6- D. de membrillo problema (II)7- D. de membrillo problema (III)

8- Blanco de extracción9- Control+ de vaca

10- (-)11- control negativo de PCR.

- Amplificación con primers para vaca sobre dulces conteniendo ADN de vaca

- Estrategias para reducir la inhibición:

• Diluir la muestra

• Purificar la muestra mediante kits específicos.

• Modificar el protocolo de extracción inicial o proceder a utilizar uno

nuevo.

• Método Mat-k- Amplificación con primers A1F-A3R + digestión con EcoRI

1-Marcador de peso molecular 50pb, 2- Dulce de membrillo de composición conocida (50% Mb-50%Mz) digerido con EcoRI, 3-D. de membrillo (50%-50%) sin digerir, 4- D. de membrillo problema (I) digerido, 5- D. de membrillo problema (I) sin digerir, 6- D. de membrillo problema (II) digerido ,

7- D. de membrillo problema (II) sin digerir, 8- Control+ de manzana digerido, 9- Control+ de manzana sin digerir, 10- Control+ de membrillo digerido, 11- Control+ de membrillo sin digerir, 12-

Control negativo de PCR sin digerir

74

Métodos de Detección, Identificación y Cuantificación de OGMs

M Arleo, F Alfonso, J Correa, R Fernández, M Fernández,F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, C Martínez Debat

Transgénesis en plantas Incorporación estable y expresión de genes foráneos en una planta.

Evento transgénico: Recombinación o inserción particular de ADN ocurrida en una célula vegetal a partir de la cual se originó la planta transgénica.

Los eventos de transformación son únicos.Difieren unos de otros en :

los elementos de regulación y genes insertados (cassette).

los sitios de inserción en el genoma de la planta.

el número de copias del inserto. los patrones y niveles de expresión de las

proteínas de interés.

Alimento transgénico

El término “alimento transgénico” hace referencia a aquel que contiene, está compuesto, o ha sido producido a partir de OGMs.

Un alimento puede ser “transgénico” porque:

está formado por materiales derivados de un OGM (harina de maíz GM),

en su fabricación se emplearon microorganismos GM (yogurt)

contiene ingredientes que provienen de OGM (aceites, aminoácidos, ácidos

orgánicos, enzimas)

Fuente: http://www.mgap.gub.uy/portal/hgxpp001.aspx?7,1,144,O,S,0,MNU;E;2;2;12;5;MNU

Situación legal de los OGMs en Uruguay:“Coexistencia Regulada”

Decreto 353/008: el etiquetado de los alimentos que contienen OGMs es “voluntario "GM" o "no GM", aplicable a aquellos alimentos en los que se pueda comprobar mediante análisis del producto final la presencia de ADN o proteínas genéticamente modificados”

Nuevo marco regulatorio referente a OGMs

…”los alimentos que han sido manipulados genéticamente o que contienen uno o más ingredientes provenientes de éstos que superen el 1% de los componentes individualmente considerados, deberán ser etiquetados”…

Alcance: Alimentos conformados por materiales derivados de OGMs

x Excluidos: Alimentos producidos a partir de microorganismos GM, o que contienen

aditivos producidos por OGM.

Umbral 1%: presencia accidental o técnicamente inevitable

de transgénicos (contaminación en la producción, transporte

o almacenamiento).

Decreto Departamental N° 34.901 (Montevideo)

Solicitudes tramitadas (Actualizado a Marzo 2013)

Fuente: http://www.mgap.gub.uy/portal/hgxpp001.aspx?7,1,144,O,S,0,MNU;E;2;2;12;5;MNU;,

Construcciones génicas de distintos eventos de maíz aprobados en Uruguay

p-35S Intrón hsp70 cry 1 A (b)

t-Noscry 1 A (b) patp-35S p-35S intrón 1 adh t-Nosintrón 6 adh

p-1 ract intrón 1 ract CP4 EPSPS t-NosOTP

Maíz MON810

Maíz NK603

Maíz GA21

Maíz TC1507

p-ubiq mz intrón 1 ubq cry 1 F t-ORF 25 p-35S pat t-35Sexón 1 ubq

p-ract1 intrón 1 ract CTP2 CP4 EPSPS t-Nos intrón hsp70 CP4 EPSPS t-Nosp-35S CTP2

Maíz Bt11

Maíz Mon89034

p-e35S intrón 1 ractL-Cab Cry 1A.105 t-HSP17 intrón hsp70 Cry 2Ab2 t-Nosp-FMV TS-SSU

Maíz Mir162

p-ubiq mz T-35S p-ubiq mz pmi t-Nosvip 3Aa20 intrón 9 PEPC

84

Proyectos en curso Detección, Identificación y Cuantificación de OGMs

F Alfonso, M Arleo, J Correa, R Fernández, M Fernández,F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, C Martínez

Detección e Identificación de OGMs en alimentos de consumo masivo (Apoya I.M.)

Interpolinización entre cultivos de maíz transgénico y no transgénico comerciales en Uruguay (Apoya REDES-AT, CSIC-UdelaR)

Flujo Génico

2011-2013: “Flujo de Transgenes entre Cultivos Comerciales de Maíz en Uruguay”

En 3 de 6 situaciones se detectó presencia del transgen en la progenie de cultivos no OGM.

El evento detectado corresponde al del presunto origen de contaminación

Se detectó interpolinización a distancias de 20, 100 y 330m

CONCLUSIONES

En Uruguay existe contaminación de cultivos no OGM por interpolinización con cultivos OGM.

La distancia reglamentaria (250 m) no evita este tipo de contaminación

En cultivos comerciales no se respeta ésta distancia.

Financiación: Fundación Boell Programa Uruguay Sustentable – REDES AT

CSIC-UdelaR

Resultado de detección e identificación de eventos transgénicos para 20 muestras de harina de maíz (código M1 – M20) que se encuentran en el mercado nacional. De las 20 muestras 18 arrojaron resultados positivos en cuanto a la presencia del promotor 35S indicando presencia de maíz GM. Estas 18 muestras son variables en cuanto al contenido de eventos particulares encontrándose todas las combinaciones posibles (solo Bt11, solo Mon810 o mezcla de ambas). Cabe destacar que las muestras que dieron resultado negativo para 35S se mantuvieron coherentes para el análisis de eventos.

PRODUCTO ORIGEN DECLARA PRESENCIA DE MAÍZ PRESENCIA DE TRANSGENICOS

EVENTO

Endógeno de maíz (HMGA)

35S t-NOS MON810 BT11 GA21 TC1507

Cheetos Torciditos México Maíz + + - + - - -Topitos queso México Maíz + - - - - - -

Tortillas naturales (tlayudas)

México Maíz + - - - - - -

Tortillas naturales (tlayudas)

México Maíz + - - - - - -

Doritos recargados México Maíz 100% natural + + + + + + +Crujitos queso y chile México Maíz + + - + - - -

Rancheritos México Maíz 100% natural + + + + + + +Fritos chile y limón México Maíz 100% natural + + + + + + +Doritos pizzerolas México Maíz 100% natural + + + + + + +

Doritos Francia Maíz + - - - - - -Tortillas chili Francia Maíz + - - - - - -

3D Francia Maíz + - - - - - -Tortillas de Maíz Francia Maíz + - - - - - -

Nachitas USA Maíz + + - + - - +3D barbacoa Argentina Maíz + + - + - - -

Fritos España Maíz + - - - - - -Mix Bugles 3D´s España Maíz + - - - - - -

Mix Cheetos España Maíz + - - - - - -Mix Doritos España Maíz + - - - - - -

Mix cheetos 2 España Maíz + - - - - - -

Resultado del rastreo del promotor 35S y t-Nos y de la identificación de los eventos Mon810, BT11, GA21, TC1507 para las 20 muestras de alimentos a base de maíz (snacks). El resultado se representa de la siguiente manera: - resultado negativo, + resultado positivo.

De las 20 muestras analizadas, ocho resultaron positivas para la presencia de transgénicos, con distinto perfil en el contenido de eventos.

Resultado del rastreo del promotor 35S y t-Nos y de la identificación del evento MON40-3-2 para las hamburguesas de carne (con presencia de soja), hamburguesas y milanesas de soja.

El resultado se representa de la siguiente manera: - resultado negativo, + resultado positivo.

PRODUCTO ORIGEN DECLARA PRESENCIA DE SOJA

PRESENCIA DE TRANSGÉNICOS

EVENTO

ENDOGENO DE SOJA

35S t-NOS MON40-3-2

Hamburguesa de carne (1)

Uruguay proteína vegetal + + + +Hamburguesa de

carne (3) s/declaración sin declaración + + + +


Uruguay proteína de soja + + + +Hamburguesa de

carne (6) Uruguay proteína de soja + - - -


Uruguay proteína de soja + + + +Hamburguesa de soja

(1) Uruguay soja certificada no

transgénica + + + +

Hamburguesa de soja (2)

s/declaración sin declaración + + + +Milanesa de soja (3) Uruguay soja certificada no

transgénica + - - -

Milanesa de soja (4) Argentina soja + + + +Milanesa de soja (5) s/declaración sin declaración + + + +

Tofu (6) s/declaración sin declaración + + + +Panchos de soja (7) Uruguay proteína de soja + - - -

Sistema de detección de OGMs

Detectar el DNA transgénico insertado.

Detectar la nueva proteína expresada.

Detectar el producto de una reacción enzimática.

Fin: Garantizar la trazabilidad de los productos GM y el cumplimiento de las normas de etiquetado.

Estrategia: Explotar las diferencias entre el organismo transgénico y la variedad no modificada.

Métodos cualitativosDeterminan la presencia o ausencia de material transgénico en

materias primas o alimentos procesados.

Detección de proteínas(Elisa, Strips)

Detección de ADN (PCR, microarreglos)

Técnicas InmunológicasTiras reactivas (Strip)ELISA

Rápidos, sencillos. Requieren poco equipamiento. Sirven únicamente como rastreo primario de OGMs, no son específicos de evento. No son apropiados para utilizar en alimentos con alto grado de procesamiento.

Microarreglos

Se basa en la hibridación del ADN de la muestra, sobre un gran número de sondas fluorescentes adheridas en una matriz sólida.

Permite el rastreo simultáneo de un gran número de fragmentos de ADN diferentes en una mezcla.

Incrementa la facilidad y velocidad del análisis. Actualmente en desarrollo.

PCR

La PCR es una técnica de amplificación enzimática in vitro que permite amplificar un fragmento específico de ADN, situado entre dos regiones de secuencia conocida.

Usa ciclos sucesivos de calentamiento y enfriamiento de las muestras para producir copias de la molécula de ADN blanco.

reacción de PCR1era etapa – Desnaturalización del ADN molde

Temperatura = 92- 97 ºC Temperatura = De acuerdo a la composición de las bases del par de cebadores (55-65°C)

2da etapa – Apareamiento de los cebador

5´

5´3´

3´

OHOH

ADN polADN pol

dNTPs

dNTPs

Temperatura = 68 - 72 ºC (depende de la enzima)

3era etapa – Extensión

Ciclado

Muy sensible, permite la detección de secuencias transgénicas a nivel de trazas.

Específica, capaz de detectar la secuencia blanco de ADN dentro de una mezcla compleja.

Apropiados para detectar e identificar eventos de transformación.

CICLADO – genera una amplificación exponencial

del fragmento de ADN deseado

PlantaPlanta PromotorPromotor PotenciadorPotenciador Gen de interésGen de interés TerminadorTerminador PlantaPlanta

Rastreo Rastreo

Específica de genEspecífica de gen

RastreoRastreo

Específica de construcción Específica de construcción

Estrategias de Detección e Identificación de transgenes por PCR

Existen cuatro niveles de especificidad para los análisis de transgénesis por PCR, dependiendo del blanco al cual estén dirigidos los cebadores. (De arriba hacia abajo va aumentando el nivel de especificidad).

Específica de eventoEspecífica de evento Específica de eventoEspecífica de evento

Normas Internacionales y protocolos validados

http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/

ISO 17025

Materiales de Referencia Certificados (MRC)

Herramienta indispensable para asegurar la calidad de los métodos de

análisis.

Elementos con propiedades estables y uniformes autenticadas por una

institución reconocida especializada.

Cada uno se certifica en relación a la fracción másica o la cantidad de

copias de ADN de un evento específico (expresado en porcentaje GM).

Material homogéneo con cigosidad conocida.

Flujo de trabajoMedidas para evitar la contaminación

1. Organización física del laboratorio y flujo de trabajo

Control de la contaminación2. Buenas prácticas de laboratorio

Descontaminar el área de trabajo con hipoclorito 10%, EtOH 70% y H20mq.

Usar túnica y guantes sin talco.

Realizar alícuotas de los reactivos de PCR.

Usar materiales descartables.

Usar puntas con filtro para evitar dispersión de aerosoles.

3. Uso de medidas específicas para la descontaminación

Radiación Ultravioleta.

Procedimiento general para la detección de OGMs

Muestra de ADN

negativo

positivo

Si No

>1% GMRequiere etiquetado

< 1% GMNo requiere etiquetado

Detección / screening

Identificación Evento autorizado?

Cuantificación

Materia prima o alimento

HomogenizaciónExtracción ADNCuantificación

SiNo

Prueba de inhibiciónAmplificación de un gen endógeno de la especie

*

*

Muestreo

Toma de muestra en el

campo

Manejo de la muestra

Homogenización

Toma de sub-muestra

Extracción de ADN

Amplificación por PCR

DETECCIÓN

Toma de sub-muestra

Como asegurar la certeza de los resultados:

Obtener muestras representativas y homogéneas del material para realizar la detección.Optimizar los métodos de extracción de ADN. Optimizar los protocolos de amplificación por PCR.Establecer y optimizar los límites de detección.

Extracción de ADN

Protocolos validados

1.Lisis en presencia de detergentes y sales (CTAB, NaCl, EDTA, temperaturas elevadas)

2. Separación de proteínas y lípidos (Extracción con solventes orgánicos, centrifugación)

3. Precipitación del ADN (etanol 100%)

4. Lavado del ADN (EtOH 70%)

5. Disolución (H20mq)

Kits comerciales

Basados en la absorción de ADN a matrices de sílica

Doyle J. J., and Doyle J. L. (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11–15.

Cuantificación del ADN extraído

Análisis espectrofotométrico del ADN (Absorbancia a 260nm)

Espectrofotometría de miscrovolúmenes (Nanodrop)

100ng ADNg. PCR convencional

50ng ADNg. qPCR

Amplificación por PCREs necesario utilizar controles en todos los análisis:

Control Interno positivo (CIP): Este control permite verificar que se ha extraído correctamente el ADN de la muestra y que no hubo inhibición. Generalmente se utiliza un gen endógeno de la especie.

Control positivo GM: Consiste en una muestra (o control) que contiene la secuencia diana buscada. Confirma que la PCR funcionó correctamente.

Control negativo de PCR : Consiste en un tubo que contiene H20 en lugar de muestra. Permite detectar la presencia de contaminantes en los reactivos.

Control Negativo (no-GM): Reacción que se lleva a cabo sobre ADN extraído de un organismo vegetal, no GM. Permite detectar la existencia de falsos positivos. Utilizado generalmente como control de contaminación de la extracción de ADN.

Análisis de la PCR - Electroforesis

Muestra

Gen en

dógeno

Control –

Control +

Muestra

Gen en

dógeno

Control –

Control +

POSITIVO NEGATIVO

Muestra C – (PCR) C + GM CIP C (no-GM) Resultado

+ - + + - Positivo

- - + + - Negativo

+ - + + + Inconcluso

- - + - - Inhibición

- - - - - Inconcluso

Variantes de la PCR utilizadas para la detección de OGMsPCR Multiplex

Detección simultánea de varias secuencias diana (utilizado para detectar varios eventos de transformación a la vez).

Utiliza múltiples pares de cebadores - Tm similar entre todos los pares

- Muy específicos

- No deben formar dímeros entre sí

Los segmentos de ADN a amplificar, deben diferir en tamaño para poder ser resueltos mediante electroforesis. (PCR convencional)

PCR en Tiempo Real

Métodos CuantitativosDeterminan la cantidad de material transgénico presente en

materias primas o alimentos procesados.

PCR en Tiempo Real o qPCR

El fundamento de la Real Time PCR es el mismo que el de la PCR convencional.

Se basa en la detección del producto amplificado ciclo a ciclo.

La PCR se acopla a la detección de un

reportero fluorescente, cuya señal aumenta

en proporción a la cantidad de producto de

PCR generado en cada ciclo.

Fundamento de la qPCR

A medida que progresa la reacción, se recogen los datos de fluorescencia (Rn) y se construye un gráfico, respecto al tiempo de reacción (n° ciclos).

La cuantificación se realiza en la fase exponencial, donde la eficiencia es constante y existe buena correlación entre el producto amplificado y la concentración inicial de moléculas diana.

Cinética de amplificación

Cuanto más bajo es el valor de Ct, mayor es la cantidad inicial de ADN genómico en la muestra

Ciclo umbral (Ct)n° de ciclo en el cual la intensidad de fluorescencia se eleva por encima del ruido de la técnica y es proporcional al número de copias iniciales de la reacción.

Eficiencia de amplificación del 100%

Ct

Ventajas de la qPCR frente a la PCR convencional

Mayor precisión, y resolución.

Mayor especificidad.

Mayor sensibilidad (LOD =0.01% GM ~ 2-10 copias de ADN ).

Se pueden realizar ensayos cualitativos y cuantitativos.

No se requiere ningún proceso post-PCR

Se ahorra tiempo y se minimiza la contaminación.

Sistemas de detección de fluorescencia:

• Agentes intercalantes (SYBR Green)

• Sondas específicas marcadas con fluorocromos (TaqMan)

Agente intercalante SYBR Green

El colorante se une al surco menor del ADN bicatenario.

Como consecuencia de esta unión, se produce un

incremento de la señal fluorescente. A medida que

aumenta la cantidad de ADN sintetizado tras cada ciclo

del PCR, aumenta el número de moléculas de ADNdh y

así la emisión de fluorescencia.

Desventaja: No es específico de secuencia. Debe recurrirse al análisis de la curva de disociación

El contenido relativo de OGM (porcentaje) se determina normalizando la cantidad de secuencias específicas del OGM con respecto a la cantidad de un gen específico de la planta.

Se realizan dos curvas patrón para realizar la cuantificación relativa:

Gen endógeno:• Específico de la especie a analizar

• Presente en todas las variedades

• Copia única por genoma haploide

Secuencia transgénica• Región común a distintas variedades (P-35S)

• Región específica (evento específico)

Cálculo del porcentaje:

Cuantificación Relativa de OGMs

% GM = ADN GM x 100 ADN Referencia

Soja: LectinaMaíz: Zeína, invertasa, hmga

Interpretación y reporte de resultados

Expresión de un resultado negativo:

x Nunca debe expresarse como …. “la muestra no contiene OGM”…Puede aparecer en el reporte …..”no se detectó la presencia la secuencia x” “no se detectó el evento x”

Expresión de un resultado positivo:

…”Se detectó la presencia de la secuencia x”…….”Se detectó la presencia del evento x”…

Cuantificación del contenido GM:

El contenido de OGM (especificar el OGM) según lo determinado por la detección de (especificar la secuencia diana buscada) derivado de (especificar especie) es X ± incertidumbre%. "(Especificar unidad utilizada.)

Etiquetado de alimentos

Alimento que contiene <1% material GM: No se etiqueta

Alimento que contiene >1% material GM: Se etiqueta

…..”Alimento genéticamente modificado”

…..”alimento producido a partir de (nombre de la especie) genéticamente modificado”

Monitoreo de productos comercializados en Uruguay

Fueron muestreados varios productos a base de maíz, tales como:

Tortillas de maíz – 12 muestrasProductos de copetín (snacks) – 19 muestrasCereales de maíz – 19 muestras

Screening de OGMs: Promotor 35S, Terminados nos Identificación de eventos: Mon810, Bt11, Ga21, TC1507 y Bt176. Cuantificación: CAMVP-35S

Resultadosn° muestras analizadas

presencia de CAMVP-35S y T-nos

Contenido GM> 1%

tortillas 12 8 4

snacks 19 16 10

cereales 19 8 4

Total 50 32 18

porcentaje 100% 64% 36%

Bt 11 Mon810 Ga21 TC1507 Bt176

positivos 24/32 21/32 10/32 4/32 0/32

porcentaje 75% 65,6% 31,2% 12,5% 0%

123

Dr. QF Claudio Martínez Debat / [email protected] ::: Laboratorio de Trazabilidad Molecular Alimentaria

Sección Bioquímica. Facultad de Ciencias. UdelaR. Montevideo. Uruguay.

https://www.facebook.com/claudio.martinez.debat

Agradecimientos:SB-FC, CSIC,

DI.GE.GRA. (M.G.A.P.), REDES-AT,

LB-IM, Limay,BePé

Andrés Carrasco (RIP)Elena Álvarez-Buylla (UNAM)

CO del IX CCN –IBQ-UAA

Muchas gracias por vuestra atención