Influência de polimorfismos genéticos do citocromo P450 de

pacientes com malária falciparum na resposta terapêutica

à mefloquina

Sandra do Lago MoraesInstituto de Medicina Tropical –

SPLab. de Imunologia – InCor-SP

Maláriaagente etiológico: protozoários do gênero Plasmodium

vetor:mosquito do gênero Anopheles

P.falciparum

P.vivax

P.malariae

P.ovale

Febre, calafrios, sudorese, cefaléia, vômitos, palidez cutâneo- mucosa, icterícia,

hepatomegalia, esplenomegalia

Quadro clínico

FRIO CALOR SUDORESE

Distribuição da malária no mundo

Fonte: WHO, 2006

Mais de 300 milhões de casos novos por ano

MALÁRIA

AIDSTB

HANSENÍASE

SARAMPO

Conseqüências Malária mata um milhão de

pessoas a cada ano3000 pessoas morrem de malária a cada dia (uma de cada quatro mortes de crianças na África e gestantes), 170 por hora Morrem por falta de

acesso aos serviços de saúde, às drogas e às redes impregnadas

Dificuldades no controle da malária

resistência do mosquito aos inseticidas resistência do parasita às drogas mudanças sociais, políticas e econômicas

(crise energética, inflação, guerras e instabilidades políticas)

ausência de vacinas que confiram proteção por longo período

1992- Declaração mundial para o controle da malária- Conferência Ministerial em Malária, outubro de 1992, Amsterdã/Holanda

1998- Roll Back Malaria (Retroceder a malaria)- campanha global

Diagnóstico precoce e tratamento rápido

Seis princípios do Roll Back Malaria

O retardo no diagnóstico e no tratamento é decisivo na

manutenção da transmissão e gravidade da doença

Desenvolvimento de resistência às drogas antimaláricas

e se espalhou nos últimos 20-30 anos

na eficácia de muitas drogas disponíveis

Cloroquina

≈ antimalárico confiável e disponível≈ extremamente importante no passado≈ hoje é ineficaz em muitas áreas endêmicas de malária falciparum

Outros derivados da quinolina

amodiaquina, halofantrine, mefloquina

segunda linha de tratamento: alternativas no caso de resistência aos esquemas terapêuticos de escolha ou de primeira linha

artemisinina e seus derivados (artesunato, artemeter, artemotil, diidroartemisinina)descobertos e desenvolvidos na Chinatransformaram o padrão de tratamento da malária em várias regiõessão eficazes na diminuição da parasitemia assexuada e não causam efeitos colateraisaltas taxas de recrudescência, que variam com a duração do tratamento e a dose total usada

Terapia de Combinação de Antimaláricos (TCAM)

Recomendação atual da OMS para conter a ameaça da resistência de P. falciparum às monoterapias e melhorar o tratamentoPrincipalmente, terapias combinadas baseadas em artemisinina, no máximo um dia após o início dos sintomas da doença

uso simultâneo de duas ou mais drogas esquizonticidas com modos de ação independentes e portanto com alvos bioquímicos não relacionadosbaseia-se no potencial destas combinações aumentarem a eficácia terapêutica e também retardarem o desenvolvimento de resistência aos componentes individuais da combinação

Terapia de Combinação de Antimaláricos (TCAM)

Não são TCAMCombinações de drogas como

sulfadoxina–pirimetamina sulfaleno–pirimetamina proguanil-dapsona clorproguanil-dapsona atovaquone-proguanil- dependem da sinergia entre os dois componentes e têm alvos relacionados no parasita

- são considerados como produtos únicos

Terapias com drogas múltiplas que incluem um medicamento não-antimalárico para aumentar o efeito antimalárico de uma droga esquizonticida sangüíneo (por ex. cloroquina e clorfeniramina).

TCAM com artemisinina e derivados

clareamento rápido da parasitemia e resolução rápida dos sintomas

10 000 vezes o número de parasitos a cada ciclo assexuado (outros antimaláricos de 100 a 1000 vezes a parasitemia por ciclo)são eliminados rapidamente

Se administrados em combinação com compostos que são rapidamente eliminados (tetraciclinas, clindamicina), são necessários sete dias de tratamentomas se administrados em combinação com antimaláricos eliminados lentamente, três dias de tratamento são suficientesAs evidências para a sua superioridade em relação às monoterapias têm sido claramente documentadas

Ensaios clínicos de TCAM de artemisinina

amodiaquinaatovaquone-proguanilcloroquinaclindamicinadoxicyclinalumefantrine

mefloquinapiperaquinapironaridinaproguanil-dapsonasulfadoxina–pirimetaminatetraciclina

ainda se conhece muito pouco sobre essas interações

Mefloquina

arilaminoálcool (4-metanolquinolina)quimicamente relacionado ao quinino é administrado oralmente com potente ação esquizonticida sangüíneoNão é gametocida nem é ativo contra formas hepáticas do parasitarecomendada como droga profilática para quem viaja a áreas com risco significante de malária falciparum resistente à cloroquina

MEFLOQUINA QUININO

F

F FF

F

FN

N

NHN

HO

HO

O

Mefloquinaativo contra P.falciparum resistente às 4-aminoquinolinas (cloroquina e drogas relacionadas) e combinações de sulfa-pirimetamina; também é ativo contra P. vivax e P. malariae e muito provavelmente contra P. ovale. O que reduz o risco de morbidade e mortalidade devido a erros diagnósticos de especiação, principalmente se o erro for em relação ao não diagnóstico da infecção por P. falciparumtem ação sinergística com os derivados da artemisina, o que também justifica a sua utilização como droga de combinação à artemisina em TCAM

MefloquinaTem uma meia-vida longa (14 a 28 dias) e consequëntemente mantém concentrações sub-terapêuticas no sangue também por mais tempo, o que favorece o surgimento de resistência, principalmente em áreas de alta transmissão altamente ligada a proteínas plasmáticas (~98 %) e é largamente distribuída pelo corpobem absorvida no trato gastrintestinal, mas existe uma variação inter-individual no tempo requerido para alcançar o pico de concentração plasmáticaÉ metabolizada no fígado e excretada principalmente na bile e nas fezes

Uso da mefloquina em TCAM com artemisinina

??? Interações farmacocinéticas e metabólicas potenciais das drogas e implicações para o uso clínicopouca informação sobre o metabolismo da MF em humanosprincipal metabólito circulante da MF: carboximefloquina (concentrações >>> composto original), parece não ter ação antimalárica significanteOutro metabólito: hidroximefloquina

Avaliação da resposta terapêutica

Métodos in vivo de assessoramento da eficácia terapêutica e estudos in vitro da suscetibilidade do parasito às drogas em cultura, genotipagem molecular para marcadores de resistência validadosPropriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas (tolerabilidade, padrão dos efeitos adversos, velocidade da resposta terapêutica)Resultados de ensaios clínicosCusto (importante a ser considerado na política e prática de tratamento)

Ensaios in vitro e in vivode avaliação da terapêutica

refletem apenas a reação do parasito ao medicamento e não permite avaliar a

resposta imune e as condições fisiológicas e de saúde do hospedeiro

nem sempre coincidem

Outros fatores podem influenciar na eficácia do tratamento

qualidade do medicamentodose e via de administraçãoprocessos farmacocinéticosrota metabólica de biotransformaçãogenética do hospedeiroresposta imune do hospedeiroestado nutricional e de saúde do hospedeiro

Rota metabólica de biotransformação

série de enzimas não integradas nas vias do metabolismo energético ou intermediário do organismo e cujos substratos são os xenobióticos (compostos químicos que não fazem parte da composição normal deste organismo)sua função é converter os xenobióticos em moléculas mais polares, mais hidrossolúveis e, portanto, mais facilmente excretáveispode gerar compostos mais ativos que o medicamento original e outros com pouca ou nenhuma atividade ou de mais rápida excreção

Fases da biotransformação

• fase 1: ocorrem reações de oxidação, redução ou hidrólise que modificam os xenobióticos e os convertem em produtos mais hidrossolúveis, graças ao aparecimento de novos grupos funcionais de caráter polar (hidroxila, amina, carboxila)

• fase 2: ocorre a combinação dos metabólitos gerados pelas reações da fase 1 com moléculas endógenas de caráter polar para formar produtos de conjugação que são rapidamente excretados

Enzimas de de biotransformação da fase 1

•capazes de transformar múltiplos substratos e catalizar reações diferentes

• têm natureza muito diversa, ex.: enzimas com atividade monooxigenase (Citocromo P-450, flavina monooxigenase), diversas oxidases (álcool desidrogenase, aldeído desidrogenase, amino oxidases, aromatases), epóxido hidrolase ou esterases e amidases hepáticas e plasmáticas

• CYP-450 é o que tem sido mais estudado- responsável pela fase 1 do metabolismo de mais de 50% dos xenobióticos existentes

• também chamado de sistema de oxidases microssomais • maior parte da biotransformação de muitos

medicamentos antimaláricos ocorre no fígado com a participação do CYP-450

• Variações na atividade de uma ou de várias das enzimas deste complexo podem fazer com que o medicamento não se converta à sua forma ativa ou que sua conversão seja tão rápida que conduza à sua rápida excreção

Complexo enzimático do Citocromo P450 (CYP-450)

Citocromo P-450 (CYP-450)

• nome dado por Ronald Estabrook, quando em 1961 observou um pico no espectro de absorção a 450 nm em extratos de fígado na presença de monóxido de carbono

• nos anos 60 e 70 descobriu-se sua importância no metabolismo de esteróides e substâncias xenobióticas

• estudos da estrutura, funções e diversidade do P-450 foram dificultados pela sua natureza de proteína hidrofóbica associada às membranas

Fatores que podem inibir ou induzir a atividade do CYP-450

•polimorfismo genético•desnutrição•deficiência de micronutrientes•processos infecciosos e inflamatórios•consumo simultâneo de outros

medicamentos

Complexo enzimático CYP-450• 114 enzimas (em diversos tecidos e órgãos,

principalmente nas membranas microssomais do retículo endoplasmático liso do fígado)

• Muito versátil funcionalmente (cataliza vários processos e metaboliza vários substratos)

• Principal participação em oxidações, mas também catalizam reduções, hidratações ou hidrólise

oxidação do substratoPolaridade capacidade de excreção solubilidade em águaPrecursores se convertem em metabólitos que podem ou não ter uma maior atividade farmacológica

As enzimas do CYP-450 -hemoproteínas compostas de quatro elementos

• um grupo protéico heme do tipo da ferroprotoporfirina IX, no qual o átomo de ferro se encontra no estado férrico (Fe3+);

• uma cadeia polipeptídica codificada por apenas um gene, cujas variações originam as diferenças de uma enzima para outra;

• uma enzima flavoproteína dependente de NADH;

• o citocromo b5, relacionado com o transporte do segundo elétron na oxidação catalizada pelo sistema CyP-450

CYP-450

•As seqüências de aminoácidos entre os diferentes CYP-450 são pouco semelhantes, menos de 20% de similaridade em alguns casos

•porção C-terminal da molécula é mais conservada que a porção N-terminal

• regiões mais polimórficas estão nas porções intermediárias

Nomenclatura do CYP-450

Família: enzimas com homologia estrutural de 35 a 40% e se representa por um número arábico, por ex., CYP1, CYP3. Existem cerca de 270 famílias entre os seres vivos, e destas 18 estão presentes em humanos

Subfamílias: enzimas com uma homologia de 65 a 70%, se identificam pela adição de uma letra maiúscula, por exemplo, CYP3A, CYP2C. Subfamília CYP3A é a mais abundante em humanos e desempenha um papel importante no metabolismo de cerca da metade dos medicamentos

A adição de um número arábico em itálico= o gene que codifica uma enzima, (ex., CYP2C8, CYP2D6, CYP3A436). Cada um dos polipeptídeos que codificam os CYP, procede de um transcrito primário do gene que pode, em alguns casos, ser processado de modo alternativo, produzindo diferentes mRNA e por conseguinte diferentes proteínas, que podem ter diferentes capacidades de reconhecimento e catálise dos substratos oxidáveis.

Polimorfismos do CYP-450• variantes alélicas de cada um dos polipeptídeos

que codificam os CYP • variantes alélicas sã indicadas com asterisco

depois do número e um outro número posterior para identificar a variante, CYP2C9*1

• Alguns CYP têm variantes alélicas mais abundantes dependendo das populações e etnias e estes são considerados em estudos de farmacogenética

• Dados dos polimorfismos do CYP-450 são importantes para interpretar o efeito de diferentes transformações metabólicas e são a base da farmacogenômica, toxicogenômica, genômica de câncer, genômica de desenvolvimento, etc.

Enzimas do Citocromo P-450 envolvidas no metabolismo das principias drogas

antimaláricasDroga Citocromo P-450

Amodiaquina CYP2C8Artesunato CYP2A6Cloroquina CYP2C8, CYP3A4, CYP2D6Halofantrina CYP3A4Mefloquina CYP3A4Primaquina CYP1A2 e CYP2D6Proguanil CYP2C19 e CYP2A4Quinino CYP3A4, CYP1A2

envolvimento da subfamília CYP450 3A na biotransformação da mefloquina

• Aumento do metabolismo da MF em microssomas hepáticos de ratos pré-tratados com dexametasona e também em hepatócitos humanos e ratos após tratamento prévio com indutores de CYP450 3A.

• a biotransformação da mefloquina em hepatócitos humanos induzidos com rifampicina foi inibida de modo dependente da concentração pelo cetoconazol, um inibidor específico bem estabelecido de CYP450 3A

• forte correlação entre a atividade da eritromicina-N-demetilase (mediada pelo CYP450 3A) e o metabolismo da mefloquina em microssomas humanos (eritromicina é um potente inibidor de CYP3A)

Como muitos outros xenobióticos são metabolizados pela subfamília CYP3A, o envolvimento desta na biotransformação da MF possibilita numerosas interações

droga-droga, o que pode ter conseqüências importantes in vivo

especialmente no que diz respeito à escolha de drogas a serem usadas em

combinação na TCAM

Fatores que podem afetar a atividade do CYP-450

•Variação genética das enzimas do CYP-450•Própria doença•Demora em procurar tratamento•Administração em doses subótimas do medicamento (ou seja pela quantidade de medicamento ou pelo tempo de tratamento)•Deficiências da absorção ou da ligação do princípio ativo às proteínas plasmáticas•Conversão insuficiente da forma ativa•Excreção excessiva do composto•Alterações metabólicas

Fatores do hospedeiro

Fatores que podem afetar a atividade do CYP-450

•Baixa qualidade dos fármacos•Propriedades físico-químicas•Interação com outros

Fatores do medicamento

•Espécie•Metabolismo•Resistência ao medicamento•Mutações genéticas

Fatores do parasito

•interações entre o fármaco e os alimentos•Grau de imunidade antimalárica do paciente•Estado de saúde geral e nutricional

Fatores da relação hospedeiro-

medicamento-parasito

Variações genéticas no citocromo P-450

• Variações genéticas na atividade de enzimas e transportadores responsáveis pela absorção, distribuição, metabolismo e excreção de drogas são a base de muitos exemplos de diferenças interindividuais na resposta à drogas.

• Metabolismo e “clearance” muito rápidos tornam uma droga ineficaz enquanto metabolismo lento pode levar a níveis excessivos e potencial acúmulo, freqüentemente associados com efeitos adversos e toxicidade

O CyP-450 apresenta uma grande variedade genética

foram descritas variantes nos genes:

CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2A13, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4 e CYP3A5, etc.

Família CYP3• tem uma única subfamília em humanos, a

CYP3A, que contém quatro membros, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 e CYP3A43

• é uma das mais importantes na biotransformação dos medicamentos

• Todos os genes se encontram no cromossoma 7

• O CYP3A4 e o CYP3A5, são os citocromos mais abundantemente expressos no fígado e em todo o trato gastrintestinal

Objetivo #1.Investigar a prevalência de polimorfismos do CYP-450 em pacientes com malária falciparum em tratamento com MF e

internados em hospital

•PCR-RFLP (Polymerase chain reaction- restriction fragment lenght polymorphism)

•Detecção de polimorfismos nas enzimas do CYP-450, CYP3A4, CYP3A5, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1

Objetivo #2.Determinar o tempo de clareamento da parasitemia e do DNA de P.falciparum no sangue de cada paciente

• Amostras de sangue foram colhidas nos tempos 0, 48h, 7,14,21,28,35 e 42 dias de cada paciente com malária falciparum em tratamento com MF e mantidos internados em hospital

• gota espessa (tempo de clareamento da parasitemia- TCP)

• Nested-PCR para determinação qualitativa do tempo de clareamento do DNA (TCD) de P.falciparum.

• Real Time PCR para quantificação do DNA de P.falciparum

Objetivo #3.Analisar a associação dos polimorfismos do CYP-450 com a resposta

terapêutica à MF•Os resultados da ocorrência de

polimorfismos do CYP-450 serão analisados em função do TCP, TCD e tempo de clareamento da febre (TCF) (dados disponíveis de todos pacientes) e níveis plasmáticos da MF (dados disponíveis apenas de alguns pacientes).

•Os pacientes serão divididos em bons e maus respondedores à MF

desenho da pesquisa

Indivíduos da pesquisa

critérios para inclusão dos pacientes:▫ indivíduos com infecção por P.falciparum

diagnosticada por gota espessa, com menos que 100.000 parasitas/mm3

▫sexo masculino▫ idade entre 18 e 60 anos▫não uso de drogas antimaláricas nos 7 dias

precedentes à internação▫nenhuma evidência de complicações clínicas,

tais como envolvimento renal ou cerebral▫consentimento pós-informado

métodos

•Extração do DNA genômico com Fenol/Clorofórmio

•“Semi-Nested” PCR para a detecção de plasmódios (Kimura et al.,1997)

•Real time-PCR para quantificação do DNA

Genotipagem dos polimorfismos

Genotipagem dos polimorfismos

Condições da PCR otimizada para os genes do Citocromo P450 (CYP450) estudados

Molécula DNA genômico

L

Primers [ ]* pmol

MgCl2 [ ]* mM

dNTP [ ]* mM

Tampão Taq polimerase

[ ]* U

H2O qsp L

CYP2C19*4 3 20 1,5 2,5 1x 2 16

CYP2C19*5 3 20 1,5 2,5 1x 2 16

CYP2C19*6 3 20 1,5 2,5 1x 2 16

CYP2C19*7 3 20 1,5 2,5 1x 2 16

CYP2C19*8 3 20 1,5 2,5 1x 2 16

CYP3A1*B 3 10 1,5 10 1x 2 14

Paciente DO 12h 48h 7d 14d 21d 28d 34d 35d 42d 44d4MEF9MEF14MEF15MEF17MEF18MEF19MEF20MEF26MEF27MEF29MEF31MEF46MEF48MEF52MEF53MEF62MEF67MEF78MEF80MEF85MEF87MEF90MEF91MEF92MEF93MEF95MEF107MEF

5MEF6MEF7MEF8MEF10MEF11MEF13MEF16MEF22MEF23MEF24MEF25MEF30MEF33MEF35MEF36MEF37MEF38MEF42MEF43MEF44MEF45MEF47MEF49MEF54MEF55MEF56MEF58MEF59MEF60MEF61MEF64MEF65MEF66MEF68MEF69MEF70MEF71MEF72MEF73MEF75MEF76MEF77MEF79MEF86MEF88MEF89MEF94MEF96MEF97MEF98MEF99MEF100MEF101MEF102MEF103MEF104MEF105MEF108MEF

não testada PCR- PCR+

Resultados preliminares

Polimorfismos do CYP3A

CYP3A*1B -392(n=90)

CYP3A*1B +268(n=90)

Genótipo A/AA/GG/G

61 (0,68)22 (0,24)7 (0,08)

31 (0,34)40 (0,44)19 (0,2)

Alelo A G

144 (0,8)36 (0,2)

102 (0,6)78 (0,4)

Polimorfismos CYP3A*1B -392 e tempo de clareamento da parasitemia

por P. falciparum Polimorfismo

CYP3A*1B -392TCP Estatística

≤ 48h (n=63)

> 48h (n=27)

2 P OR [95% CI]

Genótipo A/AA/GG/G

48 (0,76)11 (0,17)4 (0,06)

13 (0,5

)11 (0,4

)3 (0,1)

6,8a

0,005

3.4 [1,3-8,9]

Alelo A G

107 (0,85) 19 (0,15)

37 (0,7

)17 (0,3

)

6,3a

0,006

8.1[1-6,5]

a A/A vs A/G+G/GOR: odds ratio; CI: intervalo de confiança

PolimorfismoCYP3A*1B -392

TCD - snPCR

≤ 7d (n=16

> 7 d (n=71)

p OR [95% CI]

Genótipo A/AA/GG/G

15 (0,94)1 (0,06)

0

44 (0,62)20 (0,28)7 (0,10)

0,032 8,1[1-65]

Alelo A G

31 (0,97)1 (0,03)

108 (0,76)

34 (0,24)

0,004 9,7[1,3-74]

Polimorfismos CYP3A*1B -392 e tempo de clareamento do DNA de P.

falciparum

Faculdade de Medicina da USP

• Rui Rafael Durlacher• Crispim Cerutti Jr.• Filomena

Walter Reed Institute• Lorin Pang

IMT•Fabiana M. S. Leoratti•Thaís•Lilian de Farias

INCOR•Rajendranath Ramasawn•Jorge Kalil