第 15 回厚生科学審議会科学技術部会　　　　　　　ヒト幹細胞を用いた臨床研究の在り方に関する専門委員会　　　　　　　　　　　　　　　　　　 議事録平成 15 年 11 月 28 日（金） 13:30 〜 15:30　　　　　　　　　　　 厚生労働省　５階　共用第７会議室

○ 中畑委員長　それでは、第 15 回の専門委員会を開催したいと思います。　前回の委員会で今後の進め方について御議論いただきまして、審査体制、安全性、倫理と３つに分けて集中的にやっていこうという方針が決定されまして、前回は審査体制について集中的に御議論いただいたわけですが、その中で中央審査の在り方について、実際に処理できるのかどうかという問題があって、その部分だけ積み残しになっております。それについては資料等を整えているところですので、年明けにその点についてだけ御議論いただきたいと思います。　本日は予定どおり２番目の安全性について集中的に議論していただくことになっておりますので、その形で進めていきたいと思います。安全性の確保については最終確認というところまでもっていけたらと思いますので、ご協力のほどよろしくお願いいたします。　本指針の作成にあたって、特に細胞を加工する際の安全性について以前から議論があるわけですが、その際に、医薬品の安全基準が表裏一体となってまいります。この点につきましては薬事法が改正されまして、その指針と整合性がないといけないということもありますので、最初に医薬食品局から改正薬事法について御説明いただきまして、その上に立って議論を進めていきたいと思います。　それでは、医薬食品局から新しく改正されました薬事法の生物由来製剤に関する安全基準についてお話しいただきたいと思いますので、よろしくお願いします。

○ 医薬食品局　医薬食品局審査管理課の佐藤でございます。

間葉系幹細胞増殖培地の検討

間葉系細胞の供給源間葉系細胞の供給源

骨髄骨髄多指症多指症

子宮内膜子宮内膜内膜幹細胞内膜幹細胞

月経血月経血臍帯血臍帯血胎盤胎盤

ESES 細胞細胞OP9OP9 細胞フィーダー上細胞フィーダー上

死亡胎児死亡胎児胎児心筋胎児心筋

検体肉眼像および組織像

HE x100 HE x200 HE x200

Type II collagen

軟骨培養細胞の形態像 (Papanicolau 染色、各倍率　 200 倍 )

P0 P1

P10 p16 免疫染色

P0 軟骨細胞皮下移植　２週間後

軟骨培養細胞皮下移植　２週間後

初代培養細胞移植 初代培養細胞移植、浮遊組織を再移植 一回継代細胞移植

初代培養細胞 HE ｘ1.25

初代培養細胞　 TB ｘ 1.25初代培養細胞　 HE ｘ 200

間葉系幹細胞

拡大培養に要求される３つの特性

・安全・安全・迅速・迅速・大量・大量

再生治療

血清の役割・増殖因子・微量元素・脂質成分・脂質、鉄等のキャリアー・抗酸化作用・細胞接着性の向上・細胞毒性物質の中和

増殖培地＝血清（牛胎児）＋基礎培地

○ 寿命延長化ヒト骨髄由来間葉系幹細胞で組成検討

○ 初代細胞へ適用

・ UEET１２　←　 E ７、 E６、 TERT導入

１．基礎培地２．増殖因子３．ホルモン、微量元素その他

基礎培地の最適化

MEMMEM+aMEM

aMEM+DMEM

DMEM+IMDM

NCTC109F12

D:F12F12/CaD+:F12

F10D:F10

F10/CaMDCB105

D:105MCDB110

D:110MCDB131

D:131MCDB153

D:153153/CA

D:153/CaMCDB201

D:2010 50 100 150 200

Cell Growth(%,ëŒÇlÇdÇlî‰)

UEET-12/3%FCSë∂ç›â∫

EGF1003010

31

PDGF1003010

31

bFGF1003010

31

aFGF1003010

31

LIF1003010

31

HGF3010

31

IL610

31

0.30.1

VEGF3010

3

0 50 100 150 200 250 300Cell Growth(Åì,ëŒÇfÇeñ≥ìYâ¡î‰Åj

ëùêBàˆéqÇ…ÇÊÇÈëùêBë£êiå¯â ÅiÇtÇdÇdÇsÅ|ÇPÇQÅj

増殖因子の最適化

◎ 　 PDGF,EGF, ｂ FGF, ａ FGF ／○　 LIF ／△　 VEGF,HGF

（ ng/ml ）

PDGF

EGFLIF

VEGF

P+EP+LP+V

P+E+LP+E+VP+L+V

0 50 100 150 200 250 300 350Cell Growth(%,ëŒGFñ≥ìYâ¡î‰)

UEET-12Å@ëùêBàˆéqÇÃëgçáÇπ

複数の増殖因子により相乗効果が得られる。

bPAPBhP

bPAbPBbhP

bPABaEV

PaPEPVabbEbVaEaVEV

-0 100 200 300 400 500 600 700 800

mAbs=450nm

12/54-143/04.7.20

bPAPBhP

bPAbPBbhP

bPABaEV

PaPEPVabbEbVaEaVEV

-0 50 100 150 200 250

mAbs=450nm

M/9-13/04.7.21

bPAPBhP

bPAbPBbhP

bPABaEV

PaPEPVabbEbVaEaVEV

-0 100 200 300 400 500 600

mAbs=450nm

13/37-72/04.7.26

bPAPBhP

bPAbPBbhP

bPABaEV

PaPEPVabbEbVaEaVEV

-0 50 100 150 200 250

mAbs=450nm

1/p9/04.7.26

bPAPBhP

bPAbPBbhP

bPABaEV

PaPEPVabbEbVaEaVEV

-0 100 200 300 400 500

mAbs=450nm

H10-8/13-19/04.7.26

bPAPBhP

bPAbPBbhP

bPABaEV

PaPEPVabbEbVaEaVEV

-0 50 100 150 200

mAbs=450nm

7/p68/04.7.28

クローンによる反応性の違い

・無血清化の戦略→複数のクローンで検討・クローン選択的培地→目的細胞の培養

0 0.5 1 2 10FCS(%)

0

20

40

60

80

100

120

Cell Growth(%,ëŒÇPÇOÅìFCSî|ínî‰Åj

PPL

PLVMSCGM(10%FCS)

UEET-12Å@ñ≥ååê¥î|ó{

改良培地は無血清下でも血清含有培地と同等の増殖性を有する。

1053210.50FCS(%)

0

50

100

150

200

Cell number(%,ëŒ10ÅìFCSÅ]NoCoating))

No CoatFibronectin

UEET-12Å@ç◊ñEê⁄íÖê´

接着性の低下は 1％血清の添加で補われる。

○ 寿命延長化ヒト骨髄由来間葉系幹細胞で組成検討

○ 初代細胞へ適用低血清ヒト型間葉系幹細胞増殖培地　確立

・間葉系幹細胞のヒト型低血清培地を作製した。

・改良培地で通常の１００倍の細胞量を得た（２週間培養）。

間葉系幹細胞

拡大培養に要求される３つの特性

・安全・迅速・大量

再生治療

分裂回数

時間

M0

M1

M2クライシス

培養ストレス

テロメア短縮、DNA障害

テロメア消耗 ,ゲノム不安定化

不死化

p16↑

p53,Rb 経路

テロメアーゼ↑

活性酸素、熱ショック、浸透圧　など

＜目標＞　培養ストレス与えずテロメア限界まで培養できる培地＜戦略＞　 p16発現抑制

ｐ１６ INK４ a／ｐ 14ARF遺伝子領域

ｐ１６ INK ４ a

Cdk4/6サイクリン D

RbE2F

ｐ１４ ARF

MDM2(HDM2)

ｐ 53

ｐ 21Cdk2

サイクリン E

細胞増殖

リン酸化 Rb

E2F

ＭＳＣＧＭ X

ｐ１６ＩＮＫ４ａ

β‐ｔｕｂｕｌｉｎ

培地 X ではｐ１６ＩＮＫ４ a発現上昇がみとめられる

蘇生後の継代 １ １ ２ ２ ３ １ １ ２ ２ ３

0 5 10 15 20 25day

8

10

12

14

16

18

20

22

PDL MCSGM

X

MSC

なぜ培地 X で p16 の発現が高いのか？

Q

ｐ１６ＩＮＫ４ａ

β‐ｔｕｂｕｌｉｎ

ｐ１６ＩＮＫ４ａ

β‐ｔｕｂｕｌｉｎ

o oo ooo oox oooo ooox ooxo ooxx ox oxo oxx oxxx oxoo

x xx xxx xxo xo xox xoxx xoo xoox xooo xoxo

○ 　→　 MSCGM 　、　 × 　→　培地 X

ｈ MSC （ P-7)

培地 X 　 ×

MSCGM 　○培地 X 　　○ ×

MSCGM 　○○

培地 X 　 ××

MSCGM 　 ×○

○○○

○○×○×○

○×××○○

×○×××○

×××

培地により p16発現は変動する。

ｐ１６ＩＮＫ４ａ

β‐ｔｕｂｕｌｉｎ

X ＋ FCS -IT+FCS

-IT -PDGF- ｂ FGF

-EOP -Sel -P,b+FCS-P,b MSC

p16誘導の主要要因は PDGF,ｂ FGF である。

ｐ１６ＩＮＫ４ａ

β‐ｔｕｂｕｌｉｎ

X-P,b X-P,b/10%FCS MSCGMPDGF+bFGF(ng/ml) 0 1 10 0 1 10 0 1 10

ｂＦＧＦ，ＰＤＧＦが p16発現を誘導する。

PDGF＋ｂ FGF によりｐ１６発現が上昇

なぜ培地 X で p16 の発現が高いのか？Q

A

MSC bFGF P-AAP-BB

P-AB

+bFGF

P-AA,BBP-AA

P-BBP-ABPDGF

-AAPDGF

-ABPDGF

-BB

A 鎖 B 鎖

β ﾚｾﾌﾟﾀｰCD140ｂ

α ﾚｾﾌﾟﾀｰCD140ａ

Greb ２Nck

Ｒａｓ -GAP

Crk SrcSHP2

PLC-ｒ

PDGF-AA→Competent FactorPDGF-BB→Competent and Proguression Factor

IgG CD140a CD140b

p16

βtubulin

― ＋MSC の p16発現は PDGF-B鎖による。

( 細胞 /H10‐8)

MSC

aFGF

bFGF

EGFVEGFPDGF

PDGF+aFGF

PDGF+bFGF

PDGF+EGFPDGF+VEGF

aFGF+bFGF

aFGF+EGF

aFGF+VEGF

bFGF+EGF

bFGF+VEGF

EGF+VEGFHeL

a

p16p16

βtubulinβtubulin

H4-3Normal iz e dFlags Raw Common Description

1.0818335 P 2172.2 egfr epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian)1.1522822 P 657.3 egfr epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian)0.6146532 A 337.2 egfr epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian)0.8937527 A 17.8 egfr epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian)1.0583736 A 167.9 egfr epidermal growth factor receptor (erythroblastic leukemia viral (v-erb-b) oncogene homolog, avian)0.8768445 A 358.1 egfr ErbB1-S; Human epidermal growth factor receptor precursor (EGFR) mRNA, complete cds.1.0504522 A 10.4 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1, Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, J ackson-Weiss syndrome)0.7824624 A 21.5 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1, Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, J ackson-Weiss syndrome)0.417403 A 9.8 fgfr3 fibroblast growth factor receptor 3 (achondroplasia, thanatophoric dwarfism)

0.54518497 A 27.2 fgfr3 fibroblast growth factor receptor 3 (achondroplasia, thanatophoric dwarfism)1A 38.3 fgfr4 fibroblast growth factor receptor 4

1.2821407 A 125.7 fgfr1 fibroblast growth factor receptor 1 (fms- related tyrosine kinase 2, Pfeiffer syndrome)1P 652.2 fgfr1 fibroblast growth factor receptor 1 (fms- related tyrosine kinase 2, Pfeiffer syndrome)

1.4052641 A 14.3 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1, Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, J ackson-Weiss syndrome)0.75333506 A 59.2 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1, Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, J ackson-Weiss syndrome)1.3886433 P 124.5 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1, Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, J ackson-Weiss syndrome)1.1120172 A 13.6 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1, Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, J ackson-Weiss syndrome)1.0663294 P 2619.3 fgfr1 fibroblast growth factor receptor 1 (fms- related tyrosine kinase 2, Pfeiffer syndrome)

1A 11.1 fgfr4 fibroblast growth factor receptor 41.1922568 A 46.9 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1, Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, J ackson-Weiss syndrome)3.1074321 A 73.5 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1, Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, J ackson-Weiss syndrome)

1A 67.3 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1, Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, J ackson-Weiss syndrome)1A 8.2 fgfr2 fibroblast growth factor receptor 2 (bacteria-expressed kinase, keratinocyte growth factor receptor, craniofacial dysostosis 1, Crouzon syndrome, Pfeiffer syndrome, J ackson-Weiss syndrome)

1.3065747 P 3125.7 fgfr1 fibroblast growth factor receptor 1 (fms- related tyrosine kinase 2, Pfeiffer syndrome)3.3271298 P 4049.1 pd gf r bplatelet-derived growth factor receptor, beta polypeptide1.0704594 P 4990.3 pd gf r aplatelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide1.0662563 P 366.9 pd gf r lplatelet-derived growth factor receptor- like0.8164289 A 6.2 pd gf r aplatelet-derived growth factor receptor, alpha polypeptide2.3044996 A 403.1 pd gf r aplatelet-derived grow t h f a ct or r ec ep to r, a l p ha p oly pe p t id e0.6091959 A 19.5 flt4 fms- related tyrosine kinase 41.7572612 A 61.6 kdr kinase insert domain receptor (a type III receptor tyrosine kinase)

aFGF-R 　　○bFGF-R 　　○EGF-R 　　　◎VEGF-R 　　×PDGF-R 　　◎

受容体の有無

p16発現は増殖因子の種類による。

bPAPBhP

bPAbPBbhP

bPABaEV

PaPEPVabbEbVaEaVEV

-0 20 40 60 80 100 120

mAbs=450nm

MSC äeëùêBàˆéqÇ…ÇÊÇÈëùêBå¯â 

細胞増殖に都合の良い増殖因子ほど p16 の発現を誘導する？

相関係数：

０．７０0 50 100 150 200 250cell growth

0

20

40

60

80

100

120

p16

p16/cell growth

増殖因子によるｐ１６発現上昇

→　他細胞ではどうか？

毛乳頭細胞角化表皮細胞

HUVECHUVEC（ヒト臍帯静脈内皮細胞）（ヒト臍帯静脈内皮細胞）

HBECHBEC（ヒト気管支上皮細胞）（ヒト気管支上皮細胞）HDPCHDPC(( ヒト頭髪毛乳頭細胞ヒト頭髪毛乳頭細胞 ))

44 55 66 77 88 99 1010 111144 55 66 77 88

44 55 66 77 88 99 1010 1111

PassagePassage

Passage Passage

p16p16

22 33 44 55 66

HEECHEEC(( ヒト食道上皮細胞ヒト食道上皮細胞 ))

Passage Passage

33 44 55 77 1010 1313 1717 2020 2525 HFK

p=9HFFHFF

(( ヒト新生児皮膚線維芽細胞ヒト新生児皮膚線維芽細胞 ))

p16p16

HFKHFK(( ヒト陰茎包皮角化細胞ヒト陰茎包皮角化細胞 ))

44 55 66 88 99 101011 22 33

p16p16

清野先生のデータ

①無血清培地（増殖因子）

②血清培地（ 細胞）ﾌｨｰﾀﾞｰ① ②①

RamirezRD, et al. Genes Dev. (2001)

時間

分裂回数

MSC：MSCGM？毛乳頭細胞： 10%FCS-DMEM表皮角化細胞： 3T3 培ﾌｨｰﾀﾞｰ養乳腺上皮細胞： 3T3 培ﾌｨｰﾀﾞｰ養

MSC：培地 X？毛乳頭細胞：低血清培地表皮角化細胞：無血清培地乳腺上皮細胞：無血清培地

血清培地

増殖因子

増殖因子 ストレス

Ras

Raf

MEK1/2

ERK1/2

Ets1/2

MLKｓ、 TAKASK1

MKK3/6

ｐ３８MAPK

A

B

ｐ１６ INK4a

ｐ１６ＩＮＫ４ａ

β‐ｔｕｂｕｌｉｎ

X10%FCS

X A B

間葉系幹細胞

拡大培養に要求される３つの特性

・安全・安全・迅速・迅速・大量・大量

再生治療

ヒトの細胞数ヒトの細胞数 == 約６０兆個約６０兆個 == ２２ 4646 個個　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

最終分化最終分化増殖停止増殖停止細胞死細胞死

１１22

33

組織幹細胞組織幹細胞分化分化

皮膚幹細胞皮膚幹細胞

角化細胞角化細胞垢垢

造血幹細胞造血幹細胞

赤血球、白血球赤血球、白血球溶血溶血

自己再生自己再生

全能性幹細胞全能性幹細胞

体外での体外での増幅増幅細胞培養細胞培養

胚性幹細胞 (ES 細胞 )体性幹細胞→間葉系幹細胞など 増殖 / 分化 生体へ移植

ウシ血清含有培地を使用・感染症・安全性・未知成分の混入・高価・ロット差

医療用途へも展開できるウシ等動物由来成分を含まないヒト型無血清培地の開発（目標）

「増殖のスピード」と「寿命の長さ」の検討「増殖のスピード」と「寿命の長さ」の検討

開発の流れ＜血清の効果＞　　　・栄養分供給　・増殖促進効果　・脂質、鉄等のキャリアー　・脂質成分　・抗酸化作用　・微量元素供給　　

各作用を細胞増殖 / 形態を指標に既知成分で置換

○ ヒト骨髄由来間葉系幹細胞で組成検討

○ 初代細胞へ適用

○ 増殖 / 分化動態の確認

○ 安全性確認

④培養器表面ｺｰﾄ(1) 　 した培養器の細胞接着比較→◎ｺｰﾄ Fibronectin 、 Collagen I 　が良好(2) 　増殖への効果は Fibronectin が良好　

添加剤 12種の増殖効果を検討

Dex, HDC: 増殖因子の増殖作用促進

ﾎｽﾎｴﾀﾉｰﾙｱﾐﾝ , ｴﾀﾉｰﾙｱﾐﾝ : 脂質の前駆体

亜ｾﾚﾝ酸： 抗酸化作用

増殖効果が顕著な効果がなかったもの増殖効果が顕著な効果がなかったものVit E, Vit D, Testosterone, ProgesteroneVit E, Vit D, Testosterone, Progesterone

⑥脂質成分

(1) 　 酸ｵﾚｲﾝ , 酸を無血清下で濃度、組合ﾘﾉﾚﾝせ

　　　→従来培地程度には至らず(2) 　脂質に FCS添加　　　→ 酸の添加でｵﾚｲﾝ 0.5% 血清に成功(3) 　 FCS とヒト血清の比較　　　→低血清下で同等か？

0%FCS-HALO

AHALAO

AHLAHOALO

AHLO0.25%FC

-HALO

AHALAO

AHLAHOALO

AHLO0.5%FCS

-HALO

AHALAO

AHLAHOALO

AHLO1%FCS

-HALO

AHALAO

AHLAHOALO

AHLOMSCGM

0 100 200 300 400 500 600 700 800mAbs=450nm

12/45-109/03.8.4

増殖に対する効果は軽微無血清の場合は必要と考えられる

H: 高密度リポ蛋白L: Linoleic acidO: Oleic acidA: Albumin

⑤ 最適化(1) 　 MSCGM/10%FCS含有（ 社）と比較ﾎﾟｴﾃｨｸｽ　　　→低血清で従来培地と同等の増殖

H4-1

不死化不死化

老化 (M0) ： p16 の増加

老化 (M1) ：テロメアの短縮

E7E7RBRB の不活化の不活化

E6E6TERTTERT の発現誘導によるの発現誘導によるテロメラーゼの活性化テロメラーゼの活性化

培養日数培養日数

2020

5050

100100 M0M0 M1M1

乳腺上皮細胞の不死化モデル乳腺上皮細胞の不死化モデル推定

分裂回数 p53 経路（非常用ブレーキ経路）

Rb 経路（通常ブレーキ経路）

p53 経路（非常用ブレーキ経路） Rb 経路

（通常ブレーキ経路）

p14ARFp14ARF

HDM2HDM2

p53p53

p16INK4ap16INK4a

CycDCycD

RBRB

apoptosis

E2F

p21

Ink4a遺伝子座1 1 2 3

E7E6

細胞周期アクセル

細胞周期ブレーキ

エンジンブレーキ

1 2 3 4 5

1. 10%FCS-DMEM2. MSCGM (Poietics 社 )3. MF培地 4. MF培地 ( 低酸素 )5. Hela細胞

p16INK4a

培養過程における p16INK4a を介したストレスのモニター

低血清ではストレスを感知する低血清ではストレスを感知する

0 10 20 30 40 50î|ó{ì˙êî

0

5

10

15

20

25

30

35

ç◊ñEèWícî{âªêî

ÇPÇOÅìFCS-DMEMÅiè]óàî|ínÅjMFî|ín

H10-8

ToyoboToyobo 社社

低血清培地でも良好な増殖を示す低血清培地でも良好な増殖を示す

0 10 20 30 40 50 60î|ó{ì˙êî

90

100

110

120

130

140

150

ç◊ñEèWícî{âªêî

MCSGMMFî|ín

13

市販培地による良好な増殖市販培地による良好な増殖

MSCGM: PoieticMSCGM: Poietic 社社MF medium: ToyoboMF medium: Toyobo 社社

10030103110030103110030103110030103110030103130103110310.30.130103

A

B

Cell growth (% of control)

PDGF

EGFLIFVEGF

PDGF+EGFPDGF+LIFPDGF+VEGF

PDGF+EGF+LIFPDGF+EGF+VEGFPDGF+LIF+VEGF

(ng/ml)EGF

PDGF

bFGF

aFGF

LIF

HGF

IL6

VEGF

0 50 100 150 200 250 300

0 50 100 150 200 250 300 350

0 10 20 30 40 50 60

106

104

108

1014

1012

1010

#1#2#2#2C

umul

ativ

e ce

ll nu

mbe

r

1016

#2#2

0 10 20 30 40 50 60

106

104

108

1014

1012

1010

Cultuered day

Cum

ulat

ive

cell

num

ber

#1#1#2#2

0 10 20 30 40 50 60

106

104

108

1014

1012

1010

1018

Cum

ulat

ive

cell

num

ber

A

B

C

1016

Popu

latio

n do

ublin

g

Cultured day0 5 10 15 20 25

10

15

20

25

b-tublin

p16INK4a

Passage number1 2 3 4 1 2 3 4

C L

A

B

Lane 1 2 3 4 5 6 7 8

L L / 1

0%FC

S-Ins,Trf

-Ins,Trf /

10%FC

S-PDGF-BB

-ｂFGF

-PEA

-Sel -PDGF-BB,bFGF

-PDGF-BB,bFGF /

10%FC

SC

L(-GF) L(-GF)/10%FCS CPDGF+bFGF(ng/ml) 0 1 10 0 1 10 0 1 10

p16INK4a

b-tublin

p16INK4ab-tublin

A

B

Lane 1 2 3 5 7 9 104 6 8 11

Lane 1 2 3 5 7 94 6 8

C 20% 3%O2

p16INK4a

b-tublin

Lane

C

1 2 3

C bFGF

CD140b

p16INK4a

-tublin

PDGF AA ABBB AA ABBB AA+BB- -+bFGF

A

CD140a

C

PDGF-AAPDGF-AB

PDGF-BB

A-chain B-chain

PDGFRβCD140b

PDGFRαCD140a

B

101 102 103

101 102 103

Lane 1 2 3 5 74 6 8 9

C aFGF

bFGF

EGF

VEGF PDGF-BB

PDGF-BB+aFGF

PDGF-BB+bFGF

PDGF-BB+

EGF

PDGF-BB+VEGF

aFGF+bFGF

aFGF+EGF

aFGF+V

EGF

bFGF+EGF

bFGF+V

EGF

EGF+VEGF

HeLa

p16INK4a

b-tublin

A

bFGFPDGF-AAPDGF-BBPDGF-AB

bFGF+PDGF-AAbFGF+PDGF-BBbFGF+PDGF-AB

bFGF+PDGF-AA+BBaFGFEGFVEGF

aFGF+PDGF-BBEGF+PDGF-BB

PDGF+VEGFaFGF+bFGFbFGF+EGFbFGF+VEGFaFGF+EGFaFGF+VEGFEGF+VEGF

0 50 100 150 200

B

Cell growth (absorbance O.D. 450nm)

Lane 1 2 3 5 7 9 104 6 8 11 13 15 1612 14 17

C 125

100

75

50

25

00 50 100 150 200Cell growth (absorbance O.D. 450nm)

p16INK4a level (relative expression)

R=0.70

D

p16INK4a

b-tublin

Lane 1 2 3 54 6 7 8

FCS - + - + - +- -

L +PD98059 +SB2035825mM 10mM 25mM 25mM 10mM 25mM

Serum No serumExcess growth factor

Cell proliferation Senescence

Activated Ras Oxidative stress

Mek-Erk p38

p16

Mek-Erk

Cell proliferation

E

培地による増殖速度の違い

ＰＤ

Ｔｉｍｅ

MSCGM, 10%FBS-DMEM

MF10

MF

10%DMEMMSCGM

MF5%FCS-MF

MF+colMF+FN

0

10

20

30

40

ÉRÉçÉjÅ[êî

í èÌî|ó{3% O2

マウス骨髄由来間葉系幹細胞を各培地に播種。２週間に形成されたコロニーをカウントした。低酸素培養の方がコロニー形成は良いが、ＭＦ培地では通常の培養条件でもコロニー形成が認められる。

培地によるコロニー形成能の差異

0 5 10 15 20 25day

12

14

16

18

20

22

24

PDL

MSCGMMF

ＭＳＣの増殖動態

Ｐ社ＭＳＣをＭＳＣＧＭ、ＭＦ培地で継代培養した。

ＰＤＬ １４ １５ １６ １７ １９ １６ １７ １８ ２１ ２３

１４ １５ １６ １７ １９ １６ １７ １８ ２１ ２３

ＰＤＬ

ＭＳＣＧＭ ＭＦ

ＭＳＣＧＭ ＭＦ

ｐ１６ＩＮＫ４ａ

β‐ｔｕｂｕｌｉｎ

継代によるｐ１６ＩＮＫ４ a の発現動態

10%DMSCGM

MF5%MF

5%MF-GF0bP

10.30.1

0.03bFGF

10.30.1

0.03PDGF

10.30.1

0.03EGF

31

0.30.1

0 100 200 300 400mAbs=450nm

MSC/11-15/04.2.2

bP01235

0.5bP01235

0.3bP01235

0bP01235

10%DMSC

0 50 100 150 200mAbs=450nm

MSC/a/5-7/04.2.20

MF＋の組成検討

GF の組合せと添加量の検討。ｂ FGF+PDGF の組合せが優れる。

GF （ｂ FGF＋ PDGF ）と FCS の量。 GF添加を 1/3 にしても増殖は良い。

0 50 100 150 200time(hr)

0

100

200

300

400

500

600

mAbs=450nm

10%DMEMMCSGMMF5%MF+0.3bP5%MF+0.25bP5%MF+0bP

MSC/M/6-9/04.2.20

MF＋の増殖性（短期間の培養）

0 5 10 15 20 25 30 35day

10

15

20

25

30

35

40

PL

10%DMEMMSCGMMF5%MFMF+

MF＋の増殖動態

増殖は MF 培地と同等。今後ｐ１６の発現も確認し組成を絞り込む。

１．ＧＦ刺激によるｐ３８リン酸化　→培養ストレス（ｐ１６発現）とｐ３８ＭＡＰＫ活性化との関係

２．小児指組織からの初代培養　→培地性能評価、適用例充実

３．ＭＦ－Ｐｌｕｓ組成検討　→上市前組成確定の為の細胞動態確認

４．住べ基材評価　→合成ＥＣＭの接着性評価

５．その他

ＧＦ刺激によるｐ３８リン酸化 ・培養ストレスにｐ３８ＭＡＰＫが関与・ｐ１６発現誘導にｐ３８ＭＡＰＫが関与　→ＧＦ刺激でｐ３８ＭＡＰＫが活性化？

ー　 ＦＣＳ　 Ｐｂ　　 Ｐ　　 －　　ＦＣＳ　Ｐｂ　ｂＦＧＦ　ＰＤＧＦ　Ｈｅｌａ

ｐ－ｐ３８

ｐ３８

ＭＳＣＧＭ ＭＦ

p-p38

p38

ｐ -Ｅｒｋ 1/2

Ｅｒｋ 1/2

0 5 10 15 20 40 60 (min)

・時間的動態の検討・ＪＮＫのリン酸化

刺激１５分後

ＰＤＧＦ＋ｂＦＧＦ刺激後

0 10 20 30 40 50 60î|ó{ì˙êî

10

15

20

25

30

35

40

PDL MF

MF+SB

MSC

0 10 20 30 40 50 60î|ó{ì˙êî

0

5

10

15

20

25

30

35

PDL MF

MF+SB

H10-8

・ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の寿命延長効果

・コロニーアッセイ試験　→特許化へ

目的 ・いやし培地特許化

ＹＵＢ－Ｂ　→　骨髄由来間葉系細胞 １０％ＤＭＥＭ　４種　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＭＦ培地　　　　４種ＹＵＢ－Ｃ　→　軟骨細胞　　 １０％ＤＭＥＭ　５種　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ＭＦ培地　　　　４種ＹＵＢ－Ａ　→　脂肪前駆細胞　 １０％ＤＭＥＭ　１種　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 ＭＦ培地　　　　１種ＹＵＢ－Ｓ　→　繊維芽細胞　 １０％ＤＭＥＭ　１種ＹＵＢ－Ｔ　→　すじ　 １０％ＤＭＥＭ　１種

これまで　５検体。　組織　５種類。

計２１種類

小児指組織からの初代培養

0 10 20 30 40 50 60Day

4

6

8

10

12

14

16

Cell(log10)

#2-MF#2-10%D#4-MF#4-10%D#5-MF#5-10%D#8-MF

YUB-B(MSC)

ＭＦ１０％Ｄ

＃４－ -脂肪分化 ＃５－脂肪分化 ＃５－脂肪分化

＃４－ - 骨分化 ＃５－骨分化 ＃５－骨分化

トリプシン（ 20 分）→コラゲナーゼ（ 60 分）

細切

0 10 20 30 40 50 60Day

4

6

8

10

12

14

16

18

Cell(log10)

#2-10%D#4-MF#4-10%D#5-MF#5-10%D#8-MF

YUB-C(Condrocyte)

0 10 20 30 40 50 60Day

4

6

8

10

12

14

16

Cell(log10)

#5-MF#5-10%D

YUB-A(Adipocyte)

脂肪分化誘導

ñ¢èàóùçáê ä̈ÓçfiCollagenI

0 1 2 3 4 5 6 7cell(x100000)

ÖAç◊ñEêî(9 da y,2000cel l / dish,N=1)

４．住べ基材評価　→合成ＥＣＭの接着性評価

未処理

合成基材

コラーゲン・前回サンプル（７月）より良い結果。・さらに機能向上へ

・ＭＦ培地と組み合わせて初代細胞へ適用

１．いやし培地　①　ｐ３８ＭＡＰＫ活性化 /時間的挙動の差を確認　②　ＪＮＫリン酸化　③　ｐ３８活性阻害剤の効果→コロニーアッセイ、特許化

２．細胞バンク作成・寄託　①　小児指組織　②　胎盤　③　ＵＢＥＴシリーズ

３．ＴＭＣＲ関連　①　ＭＦ－Ｐｌｕｓ上市・書類作成

MatsumotoTakeda

MoriTsuchiya

NasuNasu

National Research InstituteNational Research Institutefor Child and Health Developmentfor Child and Health Development

TakahashiTakahashi

ShibuyaShibuya

TeraiTerai

Takeda MatsumotoUyama

National Center for Child Health and Development