Expression of Laminin genes during the development of the

apical ectodermal ridge (AER) in the chick embryo.

J.C Garrigues and L.Statuto. Departamento de biologia animal. Lisboa, Portugal.

Abstract

La expresión de Fgf8 actúa como señal inductora de las extremidades durante el desarrollo

embrionario, y puede mantener la proliferación de las células mesenquimales del brote. Este

factor paracrino tiene un patrón de expresión que durante determinados estadios del

desarrollo del embrión se restringen a la cresta ectodérmica apical (AER), por lo que permite

ser utilizado como modelo de control para la expresión de otros factores. La Laminina α5, es

una glicoproteína heterotrímerica cuya expresión durante el desarrollo embrionario se da en

distintas partes del embrión. Por este motivo, el objetivo de este estudio fue, a partir de

embriones de pollo, y basándonos en el modelo de expresión del Fgf8 detectado por

hibridación in situ, intentar verificar si la expresión de la Laminina α5 sigue un patrón similar

a éste, o por el contrario, se expresa en otras zonas además del AER. Lo que pudimos

observar fue que la expresión de la Laminina α5, a diferencia del de Fgf8, tiene lugar en más

zonas del ectodermo del embrión, y no se restringe únicamente al del AER.

Desarrollo de las extremidades y AER

El inicio del desarrollo de las extremidades en embriones de gallina comienza a ser evidente

hacia las 51-56 hs de incubación (1). Las extremidades serán originadas gracias a la

contribución de dos estructuras embrionarias, el plato lateral del mesodermo y los somitas,

que derivan del mesodermo paraxial. El primero será el encargado de dar lugar a todas las

estructuras de los miembros, con excepción de la musculatura, que será originada por la

migración de las células precursoras miogénicas desde los somitas hacia los brotes de los

miembros.

El desarrollo de las extremidades está bajo el control, principalmente, de una estructura que

se encuentra justamente envolviendo a éstos brotes, denominada AER (apical ectoderm

ridge). Esta estructura está formada por un epitelio columnar pseudoestratificado, que está

bajo la constante presencia de distintos morfogenes que lo mantendrán en un estado

dinámico (1). Se podría decir que el AER maduro se diferencia por presentar una banda

compacta de epitelio pseudoestratificado recorriendo la zona más distal del brote. Esta

estructura ya madura del AER sólo será visible transcurridas aproximadamente 24hs tras el

inicio de la formación del brote del miembro (1).

El AER, entre otras cosas, se encarga de mantener una población de células en estado

indiferenciado y en constante proliferación en la zona más distal del miembro, denominada

PZ (“progress zone”). La PZ es una capa de células mesodérmicas que está bajo la influencia

del AER.

Las células mesodérmicas de esta zona que se diferencian en primer lugar darán lugar a los

elementos proximales de los miembros, mientras que las células que permanecen un mayor

período en el PZ, bajo la influencia del AER, darán lugar a los elementos distales de los

miembros. Por lo que se podría concluir que el AER, dado que mantiene el estado

proliferativo del PZ, es necesario para el crecimiento y el patronamiento del axis próximo-

distal del miembro. Se cree que el tiempo que pasen las células mesodérmicas bajo la

influencia del AER será relevante en su futura identidad próximo-distal ( P/D), siendo estas

células distales quienes dependerán durante un período mayor de tiempo del AER (3). De

hecho, distintos análisis moleculares demuestran que la adquisición de la identidad P/D,

dependerá del tiempo en que estás células indiferenciadas en estado proliferativo presentes

en la zona distal del PZ, permanezcan bajo la influencia del AER (3).

Estudios iniciales, llevados acabo en los años 50 por Saunders, como la extracción del AER a

embriones durante el desarrollo de los miembros mostró qué tan importante era esta

estructura para que este proceso fuese llevado a cabo, ya que en aquellos embriones en que

el AER era extirpado no se formaba aquella extremidad.

Interesantemente, existía un correlación entre la fase del desarrollo en que el AER era

extirpado, mostrando que cuánto más tarde fuese llevado a cabo este procedimiento, más

estructuras de la zona proximal de los miembros llegaban a formarse. Estos estudios por

tanto apoyaban la teoría de que los elementos esqueléticos de los miembros se formaban

siguiendo un secuencia próximo-distal, siendo las estructuras más proximales las primeras en

formarse (1).

Morfogenes y AER

Un morfogen es una molécula que gracias a la creación de un gradiente es capaz de

determinar el destino de un determinado grupo celular. El desarrollo de las extremidades en

los vertebrados es producto de un bucle de realimentación en el que intervienen distintos

morfogenes tales como Wnt, Sonic Hedgehog (Shh), Gremlin y FGFs (1).

En la segunda mitad del siglo XX fueron realizados numerosos experimentos con el objetivo

de comprender la funcionalidad de éstas moléculas en el desarrollo embrionario, sobretodo

en el modelo aviar. Se sabe que la inducción de la AER está dirigida por interacciones

complejas entre las vías de sañalización de FGFs, Wnt, β- catenina y las BMP (Bone

morphogenetic proteína), que operan en el ectodermo y mesodermo.

Los experimentos clásicos de Harrison:

Uno de estos experimentos fue bloquear con barreras impermeables la comunicación entre

el mesodermo intermedio y la placa lateral del mesodermo en embriones de pollo en los

estadios 13 y 15 de desarrollo. El resultado fue la inhibición del desarrollo de la extremidad,

sugiriendo así que debería existir alguna señal proveniente del mesodermo intermedio que

actuase sobre el mesodermo de la placa lateral induciendo la formación de la extremidad.

Aunque estos experimentos permitieron la identificación de las áreas del embrión en donde

se formaban las extremidades y la capacidad inductiva del mesodermo intermedio, no fueron

capaces de demostrar cuál era la naturaleza molecular del inductor o inductores.

Por un lado, se podrían destacar aquellos factores pertenecientes a la familia del factor de

crecimiento de fibroblastos (FGF) y otros a la familia Wingless (Wnt), que se expresan en el

mesodermo intermedio y actúan como inductores endógenos de la extremidad. La expresión

de Fgfs actúa de forma sinérgica con la de Wnt, siendo suficiente como para inducir el

desarrollo del miembro (2).

Los FGFs (Fibroblast growth factor) son factores paracrinos que activan diversas vías de

transducción necesarias en diversos procesos del desarrollo. Se ha visto que algunos

miembros de los FGFs juegan un papel vital en el mantenimiento del AER y en la formación

de las extremidades.

Uno de los morfogenes que se ha visto más involucrado en el desarrollo de las extremidades

es el Fgf8. Este factor es expresado tanto a nivel del mesodermo intermedio como en el

ectodermo de los brotes de las extremidades durante el inicio de su desarrollo, y su expresión

parece marcar a los precursores del AER. Gracias a la implantación de perlas de heparina de

100-150 µm que liberaban FGF-8 se demostró que estas moléculas eran capaces de inducir la

formación de extremidades ectópicas en el flanco del embrión. Lo mismo ocurre con la

aplicación de los FGF-1, FGF-2 y FGF-4, sin embargo estas moléculas no se expresan en el

mesodermo intermedio, tal como Fgf8, por lo que fueron descartados como los inductores

endógenos de la formación de las extremidades. Su expresión es detectada en la superficie

del ectodermo antes y durante las primeras fases de la extrusión del miembro. Esto lleva a

pensar que la principal función de Fgf8, en esta zona, es de estimulación del crecimiento de

las extremidades (2,11).

Otro morfogen involucrado en la inducción de las extremidades es Wnt2b que al igual que

FGF-8 se expresa en el mesodermo intermedio y en la placa lateral del mesodermo de la

extremidad anterior en el embrión de pollo. Estas moléculas son capaces de inducir la

formación de extremidades ectópicas al igual que Fgf-8 y están a su vez implicadas en la

inducción del gen FGF10 en la placa lateral del mesodermo.

La inhibición de la señalización de Wnt, a su vez bloquea la expresión de Fgf10,

observándose que no hay formación de las extremidades (Imagen 1). Esto demuestra que

Fgf10 pertenece a la cascada molecular de inducción de la formación de las extremidades

(9,11). Estos datos señalan que existen distintas moléculas de la familia Wnt que se expresan

diferencialmente en los campos embrionarios de las extremidades y que están involucradas

en la formación de éstas, por ejemplo al inducir la expresión del gen Fgf10. Sin embargo, se

ha determinado que sólo aquéllos morfogenes pertenecientes a la familia de los FGFs son

capaces de rescatar el crecimiento de la extremidad cuando el AER es eliminado (10).

La eliminación del gen Fgf4, que se expresa en la región posterior de la AER, afecta la

expresión la Shh en la ZPA, principal responsable en dirigir la formación del eje antero-

posterior. Wnt7a se ha visto involucrado en la inducción de la expresión de Shh en la ZPA, y

Shh a su vez induce la expresión de Fgf4 a través de la inducción de Gremlin, antagonista de

BMP, permitiendo la expresión de Fgf4. Por lo tanto, al eliminar la expresión de Wnt7a, no

hay expresión de Shh ni de Fgf4, viéndose afectada la formación de las extremidades (Imagen

1) (3,10).

Gracias a todo esto, este factor es utilizado como marcador de la presencia de las células del

AER, ya que durante todo el proceso de formación y actividad del AER el Fgf8 lo acompaña

tanto temporal como espacialmente (1). Por este motivo, en este trabajo se utilizó como

marcador de la formación de AER al morfogen Fgf8 debido a su expresión tan específica a lo

largo de toda ésta zona.

Actividad de Gremlin en la actividad del AER

Gremlin es una proteína extracelular que actúa como antagonista de las BMPs. Durante el

desarrollo de las extremidades, la vía de señalización de las BMPs debe de ser controlada con

tal de mantener el bucle de señalización entre la ZPA y el AER. Como ya mencionamos

anteriormente para que se produzca un correcto desarrollo de las extremidades, existe un

bucle de retroalimentación positiva, que requiere tanto de la vía de señalización de FGFs, de

Shh y de las BMPs. La función de los Fgfs en el AER es la de controlar el crecimiento de las

extremidades y el mantenimiento de la expresión de Shh a nivel del ZPA.

La expresión de los genes que codifican para estos Fgfs es inhibida por las BMPs, quienes a su

vez son inhibidas por Gremlin. La expresión de Gremlin se restringe a la zona distal del

mesénquima del brote del miembro, y parece ser que su expresión tiene un importante papel

en el mantenimiento del AER y de este bucle de retroalimentación del Fgf-Shh (9,10).

Experimentos llevados a cabo en ratones mutantes de Gremlin, muestran que la principal

consecuencia del la pérdida de su expresión en las extremidades afecta a la expresión de Shh,

y por tanto a este bucle de retroalimentación del Fgf-Shh, resultando en un desarrollo

anormal en las estructuras de los miembros (10).

Imagen 1. Interacciones entre los principales factores paracrinos

durante la formación de la extremidad.El Fgf8 a nivel del AER

induce la proliferación de las células del mesénquima en la Zona

de Progreso (PZ). Shh induce a Gremlin, quien bloquea la acción

de BMP, permitiendo la expresión de Fgf4, que es inducido por

Fgf8. Wnt7a, que se expresa en el ectodermo dorsal, también

mantiene la expresión de Shh y de Fgf8.

Lámina basal

La interacción entre células es fundamental para que se puedan llevar a cabo distintos

procesos durante el desarrollo embrionario. Desde el inicio de éste proceso las células

establecen interacciones con su medio extracelular (“extracelular matrix”) y estas

interacciones entre la ECM y otras células será fundamental para que se den distintos

procesos como la proliferación y/o diferenciación celular (7).

Las lamininas son glicoproteínas con estructura heterotrimérica, constituidas por tres cadenas

diferentes una α, otra β y otra γ, y gracias a su capacidad de autoensamblaje son capaces de

dar lugar a la lámina basal (BL), quien permitirá la separación del epitelio de las extremidades

de los compartimentos mesenquimales (5). Su principal función es a nivel estructural y de

señalización. Son de gran importancia en determinadas actividades fisiológicas, y su correcta

expresión será fundamental durante la embriogénesis.

Además de las diversas funciones que éstas tienen tras el nacimiento, se ha visto que la BL

tendrá funciones críticas durante el desarrollo embrionario, viéndose involucradas en la

señalización de la proliferación, la migración y diferenciación celular, además de jugar un

papel importante en la adhesión celular (5).

Existen diversos tipos de cadenas de lamininas, siendo sólo algunas de ellas quienes serán de

mayor relevancia durante la embriogénesis y de cuya expresión dependerán para el correcto

desarrollo embrionario (5). Su expresión tiene una distribución específica según el tipo de

tejido, y estará principalmente determinada por la variación en la expresión de las cadenas α

(6). Uno de estos tipos de cadenas de lamininas que parece estar más involucrado en el

proceso del desarrollo, es la Laminina α5. El gen que codifica para esta cadena es expresado

en diversos tejidos, tanto en adultos como durante la embriogénesis, y su producto, la

proteína Lam α5 está presente en la BL dentro de estos tejidos en cuestión (5).

Se ha visto que la Laminina α5 forma parte de la mayoría de BL embrionarias, pero durante el

desarrollo su expresión se irá restringiendo a un determinado conjunto de BL (5). Estudios

sobre su expresión señalan que durante las primeras fases del desarrollo la Laminina α5 se

encuentra en diferentes tejidos, incluyendo la superficie del ectodermo. Hacia estados más

tardíos, pese a ir disminuyendo su expresión en determinadas zonas, en el ectodermo esta

continuará siendo abundante en toda la BL, y permanecerá así durante todas las fases de la

embriogénesis (5).

Los principales receptores de las lamininas son las integrinas, y su correcta expresión

determinará la señalización de las lamininas a nivel intracelular. Las integrinas son unos de los

principales receptores de membrana, y su función es la de permitir la comunicación entre el

medio inter y extracelular (7).

Estas proteínas transmembrana poseen una estructura heterodimérica compuesta por dos

cadenas, una α y otra β. Ya han sido identificados más de 20 tipos diferentes de integrinas

que reconocen diferentes ligandos de la ECM, incluyendo entre ellos a diferentes isoformas

de la lamininas (7).

Se ha visto que las integrinas de cadena α3 y α6 son expresadas a nivel del AER, y parecen ser

importantes para la correcta migración y compactación de las células epiteliales que lo

originarán (7). Estudios llevados a cabo por técnicas de inmunohistoquímica mostraban que

durante las primeras fases del desarrollo del brote del miembro se podía detectar, a lo largo

de toda la superficie del ectodermo, la presencia de la integrina de cadena α 3. La diferencia

entre la expresión de las cadenas α 3 y la α 6 era que la primera era detectada tanto a nivel

de la membrana basolateral del AER, como en las células epiteliales que no formaban parte

de éste. Mientras que la integrina de cadena α 6 se expresaba en mayor grado en las células

columnares del AER (8).

La distribución de ambas integrinas de cadenas α 3 y α 6 sugiere, por tanto, que ambas

juegan un papel fundamental en la formación y en el mantenimiento del AER, y cuya

ausencia puede dar lugar a alteraciones de sus propiedades (6). Otros estudios han

demostrado que los dobles mutantes para las cadenas de integrinas α3 y α6 presentaban mal

formaciones a nivel de las extremidades (fusión de los dígitos), lo que se podría relacionar con

defectos en la morfogénesis del AER. Es decir, la inexpresión de este tipo de integrinas

repercute directamente en la formación, y por ende en la actividad del AER (7).

Las integrinas de cadena α6, asociadas con la subunidad β1 o la β4 parecen reconocer

diversas isoformas de lamininas. Aunque también se ha visto que la integrina de cadena

α3β1 está presente a nivel epitelial, y también puede unirse a diferentes cadenas de

lamininas gracias a otros ligandos (6). Y estas, al igual que las integrinas α6 actúan como un

prominente receptor de la Lam α5, la isoforma mayoritaria en la BL. Por lo que la correcta

expresión de las integrinas α6 β1, α6 β4 y α3β1 determinará la unión de su ligando, la

laminina, y por tanto también influirá en la correcta formación y posterior actividad del AER

(7).

Nuestro objetivo en este trabajo fue el de observar si la Laminina α 5 tiene el mismo patrón

de expresión que el factor Fgf8 o bien, si durante las diferentes etapas de la embriogénesis se

expresa en otras partes del embrión, y no sólo en el AER.

RESULTADOS:

El estudio del desarrollo de las extremidades en embriones de aves puede ser seguido

gracias a un análisis gradual de los diferentes estadios del desarrollo, hasta su formación

completa. Los embriones fueron clasificados según el método de Hamburguer-Hamilton, que

además del tamaño, también los clasifica según el número de somitas ya formados, por el

tamaño craneal, por la pigmentación de los ojos, por la curvatura del eje corporal, y algo

fundamental para nuestro estudio, que es según el de nivel de desarrollo de las extremidades.

Expresión de Fgf8

Tras las primeras 50-53 hs de incubación, estadio HH14, ya se puede observar la formación de

22 somitas. A partir de esta fase del desarrollo, la dispersión del mesodermo aumenta y se

hará más complicada la determinación de las somitas en estadios posteriores de desarrollo.

En este estadio comienza a verse la zona emergente que dará lugar a las extremidades del

futuro individuo (13). La marcación con el anticuerpo anti-Fgf8 en el AER ya es apreciable,

pese a que aún su expresión es mínima (Figura 1Ay 1B). Durante el estadio HH16,

correspondiente a unas 51-56hs, se puede observar un incremento de entre 4 y 6 somitas. El

embrión presenta ya una leve curvatura entre la zona anterior y la zona posterior del cuerpo,

también el tamaño encefálico es visiblemente mayor al del estadio anterior (13). Durante este

período ya comienza la extrusión del brote de la extremidad. La expresión de Fgf8 durante

esta fase es notablemente superior, y su marcación es observable únicamente a nivel de AER

(Figura 1C y 1D). Durante el estadio HH19, se alcanza el número de 37-40 de somitas. Se

aprecia un notable incremento de tamaño tanto a nivel corporal como a nivel encefálico, pese

a que los ojos aún continúan sin estar pigmentados (13). Los miembros ya son perfectamente

visibles, y la marcación del Fgf8 es aún más intensa. (Figura 1E y 1F).

Durante el estadio HH24 las extremidades ya comienzan a sufrir el proceso de elongación.

Continúa sin poder observarse el desarrollo de la parte digital, tanto en la zona anterior como

posterior. Ya se observa la formación de los 43 somitas, y la curvatura del cuerpo del embrión

cada vez es más acentuada. Durante esta fase ya se puede apreciar la pigmentación de los

ojos (13). La expresión de Fgf8 no muestra cambios significativos a nivel de su marcación

(Figura 1G y 1H).

Se podría decir que a partir del estadio HH16-17, el número de células expresando Fgf8

incrementa sustancialmente, y los dominios de expresión se han extendido de forma tal que

cubren toda, o prácticamente toda la zona de las futuras extremidades. En todos los

embriones examinados, la expresión de Fgf8 fue detectada exclusivamente a nivel del

ectodermo, en la zona de formación de las extremidades. No fue detectada su expresión en

otras regiones. Por lo tanto, existe una gran correlación entre los dominios de expresión del

Fgf8 y las regiones donde se da la extrusión del miembro. Por lo que se podría decir que

durante el desarrollo normal de las extremidades, la expresión de Fgf8 está restringida al AER

(Figura 1).

1

1.1Extremidad anterior

(HH 14) (HH16) (HH 19) (HH24)

Extremidad posterior

(HH14) (HH16) (HH19) (HH24)

Figura 1. Desarrollo de las extremidades en embriones de pollo marcados contre Fgf8. Representación del desarrollo embrionario de los embriones de pollo Gallus Gallus Domesticus mediante la marcación de la expresión del gen fgf8 en los diferentes estadios HH14, HH16, HH19, HH24.

Expresión de Laminina α5

La expresión de la Laminina α5 a nivel del AER no es tan marcada como en el caso del Fgf8.

También podemos observar que durante los primeros estadios estudiados (HH16 y HH17) la

expresión de esta proteína en la zona de extrusión del brote está muy poco marcada (Figura

2; 1D y 2I).

En fases más avanzadas del desarrollo se puede ver que la expresión de la Lam α5 es un poco

más intensa en la zona del AER, pese a que la marcación en otras zonas del ectodermo

demuestra que su expresión no se restringe únicamente al AER, sino que durante los

diferentes estadios del desarrollo su expresión también será visible en otras zonas del

ectodermo, tal y como se explico anteriormente (Figura 3Dy 4I). Estas imágenes nos permiten

ver como el patrón de expresión de la Laminina α5 difiere respecto al del Fgf8. Mientras que

en la figura 1 únicamente observamos el marcaje del Fgf8 a nivel de la cresta apical

ectodérmica, en la figura 2 podemos ver que la Laminina α5 se expresa de una forma más

global en todo el ectodermo, y la marcación a nivel del AER no es tan marcada como en el

caso del Fgf8.

Figura 2. Desarrollo de las extremidades en embriones de pollo marcados contra Laminina α5. Embriones con marcación para la expresión del gen de laminina α 5 en distintas fases de desarrollo embrionario de Gallus Gallus Domesticus (mediante el modelo de determinación de estadios

embrionarios de Hamilton-Hamburguer). (1D:HH14; 2I:HH16; 3D:HH19; 4I:HH24)

En cuanto a los resultados obtenidos a partir de la inhibición de Wnt, tanto para la expresión

del la Laminina α5 como para la de Fgf8, estos no fueron los esperados. Tal y como

explicamos anteriormente, Wnt está implicado en la inducción de la expresión de Shh en la

ZPA, quien a su vez interviene en la expresión de Fgf4. Por tanto, la inhibición de Wnt

impedirá la expresión tanto de Shh como de Fgf4, viéndose afectada la correcta formación de

las extremidades. En nuestro caso, los embriones obtenidos que se encontraban en el estadio

HH20 + 20hs fueron completamente normales, sin observarse ningún defecto en el desarrollo

de estos embriones (Figura 3). La marcación de la Laminina α5 no mostraba ninguna variación

con respecto a los embriones de la misma fase sin inhibidor de Wnt (Fig 4; 4.1). Su expresión,

por lo tanto, no se vio afectada en ningún momento, y el desarrollo de las extremidades

resultó normal. Como podemos observar, la expresión de Fgf8 tampoco se vio afectada,

siendo únicamente marcado a nivel del AER de las extremidades (Fig 4;4).

De estos resultados podemos extraer dos hipótesis que permitan explicar el motivo del fallo

del experimento. Lo más probable es que a la hora de colocar las perlas con el inhibidor de

Wnt se haya producido un error y estás no se hayan colocado correctamente donde era

debido. O bien, también cabe la hipótesis de que la concentración del inhibidor no era lo

suficientemente alta para generar el efecto esperado.

4

4.1

Figura 4. Inhibición de Wnt en embriones marcados contra Lamina α5 y contra Fgf8. Representación del embrión (Joaquin Rodriguez-León) HH20 con inhibición de wnt durante el desarrollo del crecimiento de las extremidades, presenta marcación en la zona de expresión del gen fgf8.Las 2 imágenes contiguas ,se trata de la ampliación de la extremidad anterior y posterior donde se aprecia mejor la zona de expresividad del gen fgf8 en la AER. 4.1Embrión de pollo (Joaquin Rodriguez-León) HH20 con inhibición de wnt y con presencia de marcación por el gen expresado laminina en visión dorso-ventral.

Por último, resultados similares fueron obtenidos tras colocar el inhibidor de Gremlin en

embriones en estadio HH20+ 20 hs. En este caso, sólo fue posible llevar el estudio en un

embrión marcado contra Fgf8. Gremlin actúa como antagonista de las BMP, y su expresión

tiene un papel fundamental en el mantenimiento del AER y del bucle de retroalimentación del

Fgf-Shh. Por lo tanto, el resultado de su inhibición sería el desarrollo anormal de las

extremidades de los embriones. En nuestro caso, los resultados obtenidos tampoco fueron los

esperados, ya que no pudimos observar ninguna anomalía a nivel del desarrollo de las

extremidades, tal y como debería haber ocurrido (Figura 4).

Figura 4. Inhibición de Gremlin en embriones marcados contra Fgf8. Embrión de pollo (Joaquín Rodriguez-León HH20) con inhibición de Gremlin y marcación del gen expresado fgf8,junto a esta imagen, una ampliación de las extremidades anterior y posterior.

MATERIALES Y MÉTODOS:

2.1 Aplicabilidad del Modelo aviar a nuestro estudio.

El objetivo de nuestro trabajo era el estudio del desarrollo de las extremidades en embriones

de pollo. Dentro de los modelos de estudios existentes, fue escogido el modelo aviar frente al

modelo de ratón por diversas causas. En primer lugar el modelo aviar es más fácil de utilizar

en la medida en que podemos extraer los embriones sin necesidad de hacerlo directamente

del interior del útero materno, siendo por tanto un método mucho menos invasivo. Por otro

lado la estructura del huevo permite realizar microcirugía en el embrión y posteriormente

seguir con el cultivo normal, cosa que con el modelo del ratón no se podría llevar a cabo.

Otra de las ventajas que tiene este modelo es a nivel molecular, ya que se ha demostrado que

el FGF-10 está involucrado en la formación de las extremidades. Este factor es capaz de

inducirlas de manera ectópica en el embrión de pollo, mientras que el ratón, careciente de

este gen, es incapaz de formarlas.

2.3 Modelo de Hamilton-Hamburguer

El modelo de Hamilton-Hambuerguer es una tabla donde se nos presenta la relación entre el

tiempo de incubación de los huevos y el nivel del desarrollo que presentan los embriones.

Principalmente hay dos factores que influyen en el desarrollo durante la incubación de los

huevos, la temperatura y la humedad. Pero también se ha de tener en cuenta, que habrá

otros factores que influirán en el desarrollo, como factores genéticos, la alimentación de los

reproductores, su estado sanitario etc.

2.4 Proceso de señalización en el desarrollo de las extremidades.

El método utilizado para la marcación del desarrollo de las extremidades de los embriones de

pollo será la hibridación in situ. Esta técnica nos permitirá demostrar los diferentes

mecanismos moleculares que se llevan a cabo durante los diferentes estadios embrionarios.

La hibridación in situ es procedimiento histopatológico basado en la utilización de un

anticuerpo específico, previamente marcado mediante un enlace químico con un enzima

capaz de transformar un substrato en visible, sin afectar a la capacidad del anticuerpo para

formar un complejo con el antígeno aplicado a una muestra de tejido orgánico,

correctamente fijada. Esta técnica es muy útil para la identificación y/o localización de

muestras tisulares o citológicas. En nuestro caso se adicionó el anticuerpo anti-DIG, que es un

esteroide que posee una alta inmunogenicidad, y es un óptimo marcador para las

hibridaciones in situ.

2.5 Embriones de pollo modificados (Joaquin Rodriguez-León HH20)

En este caso, para la preparación de los embriones (I-Wnt y Gremlin) son usadas las mismas

técnicas de extracción quirúrgica que las utilizadas para el resto del trabajo. En este caso

antes de los procesos de preparación y fijación de la muestra, se procederá a la manipulación

de las extremidades de estos embriones mediante la aplicación de perlas de intercambio

iónico con presencia de inhibidor de Wnt e inhibidor de Gremlin.

Estas perlas fueron implantadas junto con una esfera de heparina-acrílica y se colocaron en la

extremidad del mesénquima mediante una aguja de tungsteno. Una vez realizado el injerto

en las extremidades de los embriones fueron puestos en período de incubación, y

basándonos en el modelo de “Hamilton-Hamburguer” fueron extraídos definitivamente para

su posterior estudio (12).

CONCLUSIÓN

En nuestro trabajo hemos estudiado algunos de los mecanismos que están íntimamente

involucrados en la formación de las extremidades en embriones de pollo.

En primer lugar, pretendíamos observar si la Laminina α 5 tenía el mismo patrón de expresión

que el factor Fgf8, o bien, si durante las diferentes etapas de la embriogénesis se expresa en

otros partes del embrión, y no sólo en el AER. Los resultados obtenidos en primer lugar

corroboran la idea que previamente se tenía sobre la expresión del Fgf8, siendo el AER su

único lugar de expresión. A su vez, también verificamos que la Laminina α5, quien tiene un

papel fundamental en el desarrollo de las extremidades, no sólo se expresa a nivel de AER tal

y como lo hace el Fgf8, sino que también se puede observar de forma gradual durante los

diferentes estadios a nivel de todo el ectodermo.

En la segunda parte de nuestro estudio, se pretendió observar los efectos que tenían la

inhibición de los factores Wnt y Gremlin en el desarrollo de las extremidades.

La inhibición de Wnt bloquea la expresión de Fgf10, provocando anomalías en el desarrollo de

las extremidades. Nuestros resultados no fueron los esperados ya que obtuvimos en ambos

casos embriones con todas sus extremidades bien desarrolladas. Y además, todos mostraban

una expresión de Laminina α5 y de Fgf8 consistente y propia al desarrollo normal de un

embrión Gallus Gallus Domesticus.

Por último, tal y como sabemos Gremlin juega un papel fundamental en la inducción de la

expresión de Fgf4 y de Wnt, por lo que su inhibición afecta de manera directa al

mantenimiento y posterior desarrollo de las extremidades. Nuevamente los resultados no

fueron los esperados, ya que en lugar de obtener embriones sin extremidades, o con

extremidades anómalas, obtuvimos embriones con un desarrollo normal y con marcaje de

Fgf8 adecuado para su estadio.

En estos tres últimos caso podemos relacionar estos fallos en el proceso de inhibición, o bien

a un a un error durante la colocación de las perlas con su respectivo inhibidor o a una baja

concentración del inhibidor, incapaz de producir el efecto esperado.

Bibliografía

1- Fernandez-Teran M, Ros M. (2008). The Apical Ectodermal Ridge:morphological aspects

and signaling pathways. Int.J. Dev.Biol. 52: 857-871.

2- Cohn M, Izpisúa-Belmonte JC, Abud H, Heath J, Tickle C.(1996). Roles for FGF8 in the

Induction, Initiation and Maintenance of Chick Limb Development. Cell 84:127-136.

3-Bénazet JD, Zeller R. (2009). Vertebrate Limb Development: Moving from Classical

Morphogen Gradients to an Integrated 4-Dimensional Patterning System. ColdSpring

Harbor Perspect Biol 1:a001339.

4- Johnson RL and Tabin† CJ.(1997) Molecular Models for Vertebrate Limb Development.

Cell 90: 979-990.

5- Miner JH, Cunningham J , Sanes JR. (1998).Roles for Laminin in Embryogenesis:

Exencephaly, Syndactyly, and Placentopathy in Mice Lacking the Laminina5 Chain.

Cell 6:1713-1723.

6- Durbeej M. (2009) Laminins. Cell Tissue Res 339:259-268.

7- De Arcangelis A, Georges-Labouesse E.(2000). Integrin and ECM functions: roles in

vertebrate development. Trends Genet 16(9):389-95.

8. De Arcangelis A, Mark M, Kreidberg J, Sorokin L, Georges-Labousse E. (1999). Synergistic

activities of a3 and a6 integrins are required during apical ectodermal ridge formation and

organogenesis in the mouse. Development 126:3957-3968.

9- Merino R, Rodriguez-Leon J, Macias D, Gañan Y, Economides A, et al. (1999). The BMP

antagonist Gremlin regulates outgrowth, chondrogenesis and programmed cell death in the

developing limb. Development 126: 5515-5522.

10- Khokha M, Hsu D, Brunet LJ, Dionne M, Harland RM. (2003). Gremlin is the BMP

antagonist required for maintenance of Shh and Fgf signals during limb patterning.Nature

Genetics 34:303 – 307.

11-Abarca-Buis RF, Garciadiego-Cázares D, Chimal-Monroy J.(2006).Mecanismos Moleculares Que Controlan El Desarrollo De La Extremidad De Los Vertebrados. Tip Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas 9:78-89.

12- Rodriguez-leon J, Tavares A T, Ipsúa-Belmonte JC. (2001). Developmental expression of chick Twist and it’s regulation during limb patterning. Int. J. Dev. Biol. 45: 000-000. 13- Sanes JR. On the Republication of the Hamburger-Hamilton Stages Series. (1992). Developmental Dynamics 195:229-230.