Instrumental Analysis

Instrumental Analysis Chapter 3

高效液相色谱分析 high performance Liquid Chromatography

高效液相色谱发展历史

• 1 903 年 茨维特发明液相色谱• 1 931 年 Kuhn , Le d e re r， 液固色谱分离结晶胡萝卜素为为和和异构体， 同年制得叶黄素结晶，• 1 938 年 从维生素 B 中分离出 B6。 1 938年获诺贝尔化学奖• 1 958 年 S te in 和 Mo o re 研制出氨基酸分析仪，成为研究蛋白质和酶的重要工具。• 1 972 年获得诺贝尔化学奖。• 1 968 年 出现商品化的高效液相色谱仪

第一节 高效液相色谱法的特点

（（ 11 ）高压 ）高压 150~350x105Pa

（（ 22 ）高速 ）高速 <1h

（（ 33 ）高效 ）高效 3万塔板 /米

（（ 44 ）高灵敏度 ）高灵敏度 如荧光检测器 10-11g

高沸点、热稳定性差、相对分子质高沸点、热稳定性差、相对分子质量大等物质，尤其是对生化样品的分离分量大等物质，尤其是对生化样品的分离分析。析。

适于分析高沸点不易挥发的

受热不稳定易分解的

分子量大

合成的和天然的高分子化合物等

不同极性的有机化合物

生物活性物质和多种天然产物；

2. 高效液相色谱的应用范围

第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素

（ 1）涡流扩散项 He = 2λdp

（ 2 ）纵向扩散项 Hd = Cd Dm /u

（ 3 ）传质阻力项 Hs = Cs df2 /Ds 、

Hm = Cm dp2 /Dm 、

Hsm = C sm dp2 /Dm

H=2λdp + Cd Dm /u +(Cs df2 /Ds + Cm dp

2 /Dm + C sm dp2 /Dm ) u

H = A + B/u + C·u

不同 dp载体的柱子分离的对比

不同 dp 的载体的 H～ u关系

第三节 高效液相色谱的主要类型及其分离原理

• 1. 分离原理：• 利用组分在两相中溶解度的差异进行分离。

一、分配色谱

根据物质在两种互不相

溶的液体中溶解度的不同，具有

不同的分配系数。分配是在柱中

进行的，使这种分配平衡可反复

多次进行，造成各组分的差速迁

移，提高了分离效率，从而能分

离各种复杂组分。

2. 类型：据固定相状态分（ 1 ）液 - 液色谱 ： 固定相是通过物理吸附方法将液

相固定液涂在载体表面。

缺点：物理浸渍的液体固定相，由于流动相的溶解作用或机械作用易流失，导致柱上保留行为改变。

（ 2 ）键合相色谱：固定相通过化学反应将有机分子键合到载体或硅胶表面上。

正相液液色谱法 : 亲水性固定液疏水性流动相M 极性 <S 极性

分类

反相液液色谱法 :极性小固定相极性强流动相M 极性 >S 极性

极性柱：正相柱 非极性柱：反相柱

组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反

• 按固定相与流动相极性分

2 化学键合相色谱法涂渍固定液

• 化学键合固定相 : 化学反应通过化学键将固定液结合在担体表面。

• 键合相色谱法：采用化学键合固定相的液相色谱法

• 固定相的结构：载体或担体（基质 )+ 功能层

• 分类

• 化学键合相

• 反相键合相色谱

• 正相键合相色谱

• 离子对色谱和离子抑制色谱

• 疏水基团 如不同链长的烷烃（ C8和 C

18）和苯

基等

• 极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。

S i

O

O H

S i

O

O H

S i

O

O H

固定相表面

C H S i C l1 8 3 7 3

S i

O

O

S i

O

O

S i

O

O

固定相表面

C H1 8 3 7S i

relatively polar surface

O O O | | | −O−Si−O−Si−O−Si−O−H | | | O O O | | | −O−Si−O−Si−O−Si−O−H | | | O O O

bulk (SiO2)x surface

relatively nonpolar surface

Silica Gel

bulk (SiO2)x surface

Derivatized Silica Gel

Where R = C18H37

hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv.

silica or “C18”)

“normal phase” “reversed phase”

O O O | | |−O−S

i−O−S

i−O−S

i−O−R

| | | O O O | | |−O−S

i−O−S

i−O−S

i−O−R

| | | O O O

• Chromatography Stationary Phases

• 分离机制：

• 分配 + 吸附（以 LLC 为基础）

• 特点：

• 1 ）不易流失

• 2 ）热稳定性好

• 3 ）化学性能好

• 4 ）盛载载样量大

• 5 ）适于梯度洗脱

A. 反相键合相色谱（ RP-HPLC ）

（ 1）．分离机制：疏溶剂理论

非极性的烷基键合 :“分子毛”，有较强的疏水特性。

流动相：极性溶剂

任务：分离含有极性官能团的有机化合物时，

保留：分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产

生缔合作用，使它保留在固定相中；

洗脱：被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使

它离开固定相，并减小其保留作用，

分离：两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为

。

• B. 正相键合相色谱

• （ 1 ）分离机制：存在溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力

• （ 2 ）固定相：极性大的氰基或氨基键合相

• （ 3 ）流动相：极性小（同 LSC ）

• 底剂 + 有机极性调节剂

例：正己烷 + 氯仿 - 甲醇，氯仿 - 乙醇

• 出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱

• 极性大的组分后出柱

极性小的组分先出柱 极性大的组分先出柱

表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快

可键合不同官能团，提高选择性

化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击

耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定

有利于梯度洗脱

传质快 寿命长 选择性好

• 化学键合相色谱法特点

• 小结

固定液极性 < 流动相极性

极性大的组分先出柱，

极性小的组分后出柱

适于分离非极性组分

固定液极性 > 流动相极性

极性小的组分先出柱，

极性大的组分后出柱

适于分离极性组分

正相色谱（ NLLC ） 反相色谱（ RLLC ）

正相色谱：固定相 --- 极性， 流动相 --- 非极性溶剂反相色谱：固定相 --- 非极性，流动相 --- 极性溶剂

二、 液 - 固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography

固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝

等，较常使用的是 5 ～ 10μm 的硅胶吸附剂；

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂

。

基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附

与解吸；

适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样

，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；

缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；

三、 离子交换色谱ion-exchange chromatography

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子

交换树脂；

流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采

用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱

性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子

交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子

半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长

；

阳离子交换： R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H

+

阴离子交换： R—NR4OH +X- = R—NR4 X +

OH-

应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸

等。

四、 离子对色谱ion pair chromatography

原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相

反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质

离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之

间进行分配；

阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四

丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；

阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺

酸钠作为对离子；

反相离子对色谱：非极性的疏水固定相 (C-18

柱 ) ，含有对离子 Y+ 的甲醇 - 水或乙腈 - 水作为流动相

，试样离子 X- 进入流动相后，生成疏水性离子对 Y+ X -

后；在两相间分配。

五、 离子色谱ion chromatography

离子色谱是在 20世纪 70年代中期发展起来的

一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的

、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采

用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的

有效方法。

六、 空间排阻色谱size- exclusion chromatography

固定相：凝胶 ( 具有一定大小孔隙分布 ) ；

原理：按分子大小

分离。小分子可以扩散到凝

胶空隙，由其中通过，出峰

最慢；中等分子只能通过部

分凝胶空隙，中速通过；而

大分子被排斥在外，出峰最

快；溶剂分子小，故在最后

出峰。

全部在死体积前出

峰；

可对相对分子质量

在 100-105 范围内的化合物按

质量分离

第四节 高效液相色谱固定相和流动相

一、液相色谱固定相 stationary phases of LC

1. 液 - 液分配及离子对分离固定相

（ 1 ）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体

；早期采用 100μm 的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不

佳已不多见；

现采用 10μm 以下的小颗粒，化学键合制备柱

填料；

（ 2 ）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30 ～ 40μm 的玻璃微球，表面附着一层厚度为 1 ～ 2μm 的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底；

（ 3 ）化学键合固定相

化学键合固定相 : 目前应用最广、性能最佳的固定

相；

a. 硅氧碳键型： ≡ Si—O—C

b. 硅氧硅碳键型：≡ Si—O—Si — C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最

广；

c. 硅碳键型： ≡ Si—C

d. 硅氮键型： ≡ Si—N

化学键合固定相的特点

（ 1 ）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质

快；

（ 2 ）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲

击；

耐水、耐光、耐有机溶

剂，稳定；

（ 4 ）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；

（ 5 ）有利于梯度洗脱；

存在着双重分离机制：

( 键合基团的覆盖率决定分离机理 )

高覆盖率：分配为主；

低覆盖率：吸附为主；

2. 液 - 固吸附分离固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；

结构类型：全多孔型和薄壳型；

粒度： 5 ～ 10 μm ；

3. 离子交换色谱分离固定相

结构类别：

（ 1 ）薄壳型离子交换树脂

薄壳玻璃珠为担体

，表面涂约 1% 的离子交换树

脂；

（ 2 ）离子交换键合固定相

薄壳键合型；微粒

硅胶键合型（键合离子交换基

团）

树脂类别：

（ 1 ） 阳离子交换树脂（

强酸性、弱酸性）

（ 2 ） 阴离子交换树脂（

强碱性、弱碱性）

4. 空间排阻分离固定相

（ 1 ）软质凝胶

葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；

水为流动相。适用于常压排阻分离。

（ 2 ）半硬质凝胶

苯乙烯 - 二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；

非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性

溶剂

（ 3 ）硬质凝胶

多孔硅胶、多孔玻珠等；

化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质

影响小，可在较高流速下使用。

可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。

二、液相色谱的流动相 mobile phases of LC

1. 流动相特性 （ 1 ）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱

剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离

状况；

（ 2 ）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流

动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，

极性柱也称正相柱。

（ 3 ）若流动相的极性大于固定液的极性，则称

为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种

类型分离柱上的出峰顺序相反。

2. 流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；

按极性分：极性、弱极性、非极性；

按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸

乙酯、乙醇、乙腈、水。

采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵

活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整

出峰时间。

3. 流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。

采用正相液 - 液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。

也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：

水 (最大 ) > 甲酰胺 > 乙腈 > 甲醇 > 乙醇 > 丙醇 > 丙酮 > 二氧六环 > 四氢呋喃 > 甲乙酮 > 正丁醇 > 乙酸乙酯 > 乙醚 > 异丙醚 > 二氯甲烷 > 氯仿 >溴乙烷 >苯 >四氯化碳 > 二硫化碳 >环己烷 > 己烷 >煤油 (最小 )

4. 选择流动相时应注意的几个问题

（ 1 ）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。

（ 2 ）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。

（ 3 ）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。

（ 4 ）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。

第五节 高效液相色谱仪

流 程

流程及主要部件 process and main assembly of

HPLC

1. 流程

2. 主要部件

(1) 高压输液泵

♥主要部件之一，压力： 150 ～ 350×105 Pa 。

♥为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm ）

，液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此

高压、高速是高效液相色谱的特点之一。

♥应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等

特性

(2) 梯度淋洗装置

外梯度 :

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。

内梯度 :

一台高压泵 , 通过比例调节阀 , 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。

(3) 进样装置

流路中为高压力工作状态，

通常使用耐高压的六通阀进样装置，

其结构如图所示：

(4) 高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径 1 ～ 6 mm ，柱长 5

～ 40 cm 。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效

。

(5) 液相色谱检测器

a. 紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。

特点：

灵敏度高；

线形范围高；

流通池可做的很小（ 1mm × 10mm ，容积 8μL ）；

对流动相的流速和温度变化不敏感；

波长可选，易于操作；

可用于梯度洗脱。

b. 光电二极管阵列检测器

紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器： 1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。

光电二极管阵列检测器

紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较

普通检测器普通检测器 光电二极管阵列检测光电二极管阵列检测器器

c. 示差折光检测器（ differential refractive index detector ）

除紫外检测器之外应用最多的检测器；

可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指

数差值。差值与浓度呈正比；

通用型检测

器（每种物质具有不

同的折光指数）；

灵敏度低、

对温度敏感、不能用

于梯度洗脱；

偏转式、反

射式和干涉型三种；

d. 荧光检测器（ fluorescence detector ）

高灵敏度、高选择性

；

对多环芳烃，维生

素 B 、黄曲霉素、卟啉类化

合物、农药、药物、氨基酸

、甾类化合物等有响应；

液相色谱仪器 high performance liquid chromatograph

液相色谱仪（ 2 ）

液相色谱仪（ 3 ）

液相色谱仪（ 4 ）

第六节 高效液相色谱分离类型的选择

样品的溶解度

样品的分子量范围

样品的分子结构和分析特性

1 、同系物的分离

2 、同分异构体的分离

二维色谱及联用技术

高效液相色谱分离条件的优化

一、影响分离的因素 factors influenced separation

1. 影响分离的因素与提高柱效的途径

• 在高效液相色谱中 , 液体的扩散系数仅为气体

的万分之一，则速率方程中的分子扩散项 B/u 较小，

可以忽略不计，即：

H = A + C u

• 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的

一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。

• 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。

• 液相色谱中，不可

能通过增加柱温来改善传质。

恒温

• 改变淋洗液组成、

极性是改善分离的最直接的

因素。

2. 流速

流速大于 0.5 cm/s 时 ,

H ～ u曲线是一段斜率不

大的直线。降低流速，柱效

提高不是很大。但在实际操

作中，流量仍是一个调整分

离度和出峰时间的重要可选

择参数。 3. 固定相及分离柱

气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相

色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色

谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，

一般很少自行制备。

二、分离类型选择 choice of separation types

三、 HPLC 的应用 application of HPLC

1. 环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶 (37 ～ 50µm)

流动相：正己烷

流 速： 1.5 mL/min

色谱柱： 50cm×2.5mm(内径 )

检测器：差示折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。

2. 稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质。

固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相： 20% 甲醇 - 水 ～ 100% 甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速： 1mL/min 柱 温： 50 ºC 柱 压： 70 ×104 Pa 检测器：紫外检测器

第六节 毛细管电泳

一、毛细管电泳概述

在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场

力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方

向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及

性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。

1937 年， Tiselius( 瑞典 ) 将蛋白质混合液放在

两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，

第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和

α 、 β 、 γ 球蛋白；

发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度

决定；

第一次 自由溶液电泳；第一台电泳仪；

1948年，获诺贝尔化学奖；

二、经典电泳分析

利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。

按形状分类： U 型管电泳、柱状电泳、板电泳；

按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；

传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。

1981 年， Jorgenson 和 Luckas ，用 75m 内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达 40 万 /m ，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与 GC 、 HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。

三、高效毛细管电泳分析

高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：

一是采用了 0.05mm 内径的毛细管 , ；

二是采用了高达数千伏的电压。

• 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大

大减小了温度效应，使电场电压可以很高。

• 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变

小，柱长增加，

• 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理

论塔板数高达几十万块 / 米，特殊柱子可以达到数

百万。

分离过程

♥ 电场作用下，毛细

管柱中出现：电泳现

象和电渗流现象。

♥ 带电粒子的迁移速度 = 电泳 + 电渗流；两种速度的矢

量和。

♥ 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出

；

♥ 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流

出；

♥ 阴离子：两种效应的运动方向相反。ν 电渗流 >ν 电泳时

,阴离子在负极最后流出 ,在这种情况下 ,不但可以按类分

离 ,除中性粒子外 ,同种类离子由于受到的电场力大小不一

样也同时被相互分离。

高效毛细管电泳的特点

1. 仪器简单、易自动化

电源、毛细管、检测器、溶液瓶

2. 分析速度快、分离效率高

在 3.1min 内分离 36 种无机及有机阴离子， 4.1min 内分离了 24 种阳离子；分离柱效： 105～ 107/m 理论塔板数；

3. 操作方便、消耗少

进样量极少，水介质中进行；

4. 应用范围极广

有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；

分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；

第二节 毛细管电泳仪

一、高效毛细管电泳仪

仪器 2

仪器 3

二、仪器流程与主要部件

• 电压： 0～ 30kV；

• 分离柱不涂敷任何固定液；

• 紫外或激光诱导荧光检测器；

（可检测到： 10-19～ 10-21 mol/L）

1. 高压电源（ 1 ） 0 ～ 30 kV 稳定、连续可调的直流电源；

（ 2 ）具有恒压、恒流、恒功率输出；

（ 3 ）电场强度程序控制系统；

（ 4 ）电压稳定性： 0.1% ；

（ 5 ）电源极性易转换；

2. 毛细管柱

（ 1 ）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；

（ 2 ）规格：内径 20～ 75μm ，外径 350 ～400μm ；长度 <=1m

3.缓冲液池

化学惰性，机械稳定性好；

4. 检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；

检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；

类型 检测限 /mol 特点

紫外 -可见 10-13 ～ 10-15 加二极管阵列，光谱信息

荧光 10-15～ 10-17 灵敏度高，样品需衍生

激光诱导荧光 10-18 ～ 10-20 灵敏度极高，样品需衍生

电导 10-18 ～ 10-19 离子灵敏，需专用的装置；

第三节 毛细管电泳方法

分离类型

八种分离类型，介绍常用的几种；

根据试样性质不同，采用不同的分离类型；

每种机理的选择性不同；

一、毛细管区带电泳

带电粒子的迁移速度 = 电泳和电渗流速度的矢量和

。

正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流

出；

中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离

子后流出；

阴离子：两种效应的运动

方向相反； ν 电渗流 >ν 电泳时 ,

阴离子在负极最后流出 , 在这

种情况下 , 不但可以按类分离 ,

同种类离子由于差速迁移被相

互分离。

最基本、应用广的分离模

式；

二、毛细管凝胶电泳

将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。

其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按

大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分

离效率高。

蛋白质、 DNA 等的电荷 / 质量比与分子大小无关

， CZE 模式很难分离，采用 CGE 能获得良好分离， DAN

排序的重要手段。

特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。

无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代

替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。

1. 缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到

临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。

三、 胶束电动毛细管色谱（ MECC ，MEKC ）

在电场力的作

用下，胶束在柱中

移动。

2. 电泳流和电渗流的方向相反，且 ν 电渗流 > ν

电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动；

5. 色谱与电泳分离模

式的结合。

3. 中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏

水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；

4. 可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳

的应用范围；

1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳

技术；

2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电

点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压

（ 6 ～ 8V ）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高

的 pH 梯度；

3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液 pH 有

关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点

时，呈电中性，淌度为零；

四、毛细管等电聚焦

4. 聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作

用下迁移，分别到达满足其等电点 pH 的位置时，呈电

中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；

5. 阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀 NaOH 溶液；

6. 加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检

测；

7. 电渗流为不利因素，应消除或减小。

1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子

( 充满毛细管 ) 和尾随离子，试样离子的淌度全部位于

两者之间，并以同一速度移动。

2. 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所

有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极

前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳

极检测。

五、毛细管等速电泳

3. 不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不

同 (ν=μE) ，淌度大的离子区带电场强度小；

沿出口到进口，将不同区带依次排序

1 、 2 、 3 、 4 ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ 电场强度依次增大。假

设“ 2” 号中离子扩散到“ 3” 号，该区电场强度大，

离子被加速，返回到“ 2” 区；当“ 2” 号中离子跑到

“ 1” 号区，离子被减速使之归队；

4. 特点：界面明显，富集、浓缩作用；

在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，

以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机

理的电动色谱过程；

六、毛细管电渗色谱

第四节 毛细管电泳的应用

一、离子分析

阳离子分析

迁移方向和电渗流方向一致；

4.5min内分离了 24种金属离子；

阳极进样，阴极检测；

具有很高的灵敏度；

阴离子分析

阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；

质量小、电荷密度大的离子如： SO4

-2 、 Cl-、 F-等，

电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；

加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在 3.1min内分离 36种阴离子；阴极进样，阳极检测；

离子价态及存在形态分析；

二、药物分析

检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；

尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；

采用毛细管区带电泳方式，在 11min内分离 17种药物；

采用 MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于 HPLG法

三、手性化合物分析

合成获得单一手性化合物相当困难； 528 种手性合成药

物， 61 中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分

析也相当困难；研究热点；

R-反应停是安眠药， S- 式致胎儿畸形；

HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；

形成配合物的稳定常数有差异，结合 HPCE的高效率；

常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性

表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠

盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）

四、氨基酸与蛋白质分析

采用 MEKC模式，在 25分钟内分离了 23种丹酰化氨基酸；

HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；

问题：吸附和检测；

蛋白质分析

五、核酸分析及 DNA排序

重要分析手段；

图，酶解的双螺旋

DNA限制性片段的

分离；

六、新进展

1. 微型化

整体化学分析系统（ TAS ）及 TAS 微型化

在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数10 5/m ；

2. 联用仪器 CE-MS ；

3. 阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因 DNA 测序；

5 ～ 10 万个基因， 30 亿个碱基对，目前最有效的

DNA 序列分析仪， 10 小时 / 次；可同时电泳 24 个样品

；速度 1200 碱基对 / 小时，提高速度！

100 支毛细管阵列电泳；速度 280 碱基对 / 小时 / 支