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CRITÉRIOS PARA ESCOLHA DE TESTESDE IMUNODIAGNÓSTICO:
NA BANCADA E NO LABORATÓRIO CLÍNICO
RICARDO WAGNER DIAS PORTELA, DVM PhDLABORATÓRIO DE IMUNOLOGIA E BIOLOGIA
MOLECULARINSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
UFBA
COM TANTAS TÉCNICAS DIFERENTES, E COM MUITAS DELAS DESTINADAS A DIAGNOSTICAR AS MESMAS PATOLOGIAS, QUAIS ESCOLHER? EM QUE SE BASEAR NA HORA DE RECEITAR OU UTILIZAR NA ROTINA LABORATORIAL?
1- INTRODUÇÃO
1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas:-Especificidade-Diversidade-Memória-Especialização-Autolimitação-Não reatividade ao próprio
1- INTRODUÇÃO
1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas:-Especificidade – conferida por duas moléculas principais:
- TCR – presente na membrana de linfócitos;
- Anticorpos – produzidos por linfócitos B, presentes na membrana de linfócitos B e na forma secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais.
1- INTRODUÇÃO
1.2- Principais isotipos de anticorpos-IgM-IgG-IgA-IgE-IgD
1- INTRODUÇÃO
1.2- Principais isotipos de anticorpos:-IgMIgM-IgG – encontrado em maior concentração no soro, de obtenção mais fácil, sofre maturação de afinidade-IgAIgA-IgEIgE-IgDIgD
1- INTRODUÇÃO
1.2- Principais isotipos de anticorpos:-IgMIgM-IgG – MARCADOR DE CONTATO DO INDIVÍDUO COM O AGENTE INFECCIOSO-IgAIgA-IgEIgE-IgDIgD
Testes sorológicos
Detecção de anticorpos específicos no soro, produzidos por um
indivíduo após contato com agente infeccioso
Anticorpo – marcador de infecção
Somente produzido após contato com o Antígeno – RI Adaptativa
Estrutura dos Isotipos de Anticorpos:
Os diferentes isotipos de Acs apresentam estruturas variadas
IgM- Neutralizam toxinas
- Fixam o complemento-Receptor de antígenos na superfície dos Linf. B-Marcador de fase aguda de doenças infecciosas
IgG- Quatro subclasses: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4
- neutralizam toxinas (todos)- fazem opsonização (IgG1 e IgG3)
- fixam complemento (IgG1, IgG2 e IgG3)- são os únicos que podem atravessar a placenta (IgG2)
IgA- neutralizam toxinas
- bloqueiam a ligação de antígenos nas mucosas-Apresentam-se na forma dimérica
IgE-Levam a degranulação de mastócitos e basófilos.-Participam da imunidade contra helmintos-Participam das reações de Hipersensibilidades
Características dos Isotipos de Anticorpos:
Características dos Isotipos de Anticorpos:
Características dos Isotipos de Anticorpos:
Principais Características dos Ensaios deImunodiagnóstico:
-Especificidade
-Sensibilidade
-Repetitividade
-Reprodutibilidade
-Limite de Detecção
-Linearidade
ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE
-Especificidade: Característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado.
-Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de reações cruzadas.
ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE
-Especificidade: Importante principalmente quando aplicada a doenças infecciosas.
Doenças de notificação obrigatória – confere a certeza sobre o status infeccioso do paciente ou, no caso animal, evitando sacrifícios desnecessários e prejuízos.
Importante para um correto controle sanitário de rebanho, evitando a introdução de animais infectados e a disseminação da doença.
OBRIGATÓRIA ALTA ESPECIFICIDADE EM TESTES CONFIRMATÓRIOS
ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE
-Sensibilidade: Característica inerente ao método estreitamente relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada
-Quanto MAIOR a sensibilidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-negativos, MAIOR a possibilidade de detecção precoce de doenças.
-Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes.
ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE
-Sensibilidade: Importante característica que se aplica principalmente a doenças infecciosas, marcadores tumorais e hormônios encontrados em baixa concentração.
Um kit de alta sensibilidade permite a detecção precoce de patologias, levando a um tratamento mais efetivo e mais rápido, melhorando o prognóstico do paciente.
ALTA SENSIBILIDADE OBRIGATÓRIA EM TESTES DE TRIAGEM
Curso do Processo Infeccioso:Parasitemia / Viremia / Bacteremia
Curso da Infecção:Concentração de Anticorpos e Número de
Linfócitos T Efetores
ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE
-Exemplos Práticos:
Ensaio com boa especificidade e baixa sensibilidade
Interpretação dos Resultados:
Resultado + - Confiável
Resultado - - A confirmar
ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE
-Exemplos Práticos:
Ensaio com alta sensibilidade e média especificidade
Interpretação dos Resultados:
Resultado + - A confirmar
Resultado - - Confiável
CUSTO DO ENSAIO
+
SENSIBILIDADE / ESPECIFICIDADE
=
RELAÇÃO CUSTO / BENEFÍCIO
ADEQUAÇÃO DA AMOSTRA
- As amostras disponíveis são compatíveis com a metodologia a ser empregada/proposta
- AMOSTRA NÃO É SÓ SORO:Urina
FezesLíquido Céfalo-raquidiano
SêmenLágrima
Saliva
- O perfil dos componentes das amostras podem interferir nos testes, p. ex. as enzimas da saliva, as bactérias das fezes...
Um teste sorológico pode ser qualitativo, semi-quantitativo ou quantitativo:
- qualitativo, se os seus resultados informam apenas sehouve ou não reação / detecção (positivo ou negativo).
Veja um laudo imaginário: Teste – detecção por ELISA de anticorpos IgM contra rubéola
Resultado: positivo
- semi-quantitativo, se a amostra testada (soro) foi diluída –a maior diluição a apresentar reação é o seu título.
Veja um laudo imaginário:Teste – detecção por imunofluorescência de anticorpos IgG contra o T. cruzi
Resultado: positivo até a diluição de 1:320
- quantitativo, se é capaz de informar a quantidade absoluta do material detectado.Veja um laudo imaginário:
Teste – detecção por ELISA de anticorpos IgM contra o T. gondiiResultado: 63 UI/ml
Cont. negativoCut-offCont. positivo
Resultado de um teste ELISA
Esta placa será lida por um fotocolorímetro, que informará os valores de den-sidade ótica.
Todos aqueles que apresentarem resultados abaixo do “cut-off” serão considerados negativos, enquanto que os que mos-
trarem valores maiores, serão positivos.
Trata-se portanto de um teste qualitativo
Hemoaglutinação PassivaTeste semi-quantitativo
Sorostestes
controle positivocontrole negativo diluições seriadas dos soros testes
de 1: 2 a .................. 1:1024
Na primeira fileira (de cima para baixo), a reação foi positiva até adiluição de 1:32 . Já na segunda fileira o resultado foi negativo em todas as
diluições.O resultado do primeiro soro teste acima referido é: reagente até a
diluição de 1:32 (ou título:1:32). O segundo soro teste é não reagente.
A maior ou menor sensibilidade e especificidade de um teste sorológico depende de qual é a sua finalidade.
- Para diagnóstico - é necessário a utilização de testes mais específicos. Nestes casos, é importante que sejam evitados
os testes falso-positivos.
- Para triagem em Banco de Sangue (ou outras finalidades similares)– os testes são usados com fins preventivos, ou seja, a função é prevenir a contaminação do receptor. Aqui busca-se evitar os testes falso-negativos (a repetição de um teste com resultado falso-positivo custa pouco, entretanto, a disseminação da doença em conseqüência de um resultado falso-negativo, tem que ser impedida a todo custo).
O QUE LEVAR EM CONTA NA HORA DE ESCOLHER O MÉTODO DE DIAGNÓSTICO?
-Sensibilidade;
-Especificidade (confiabilidade de resultados);
-Custo (PRIMORDIAL NA MED. VETERINÁRIA);
-Disponibilidade de material;
-Segurança;
-Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser
detectado e espécie animal a ser analisada;
-Tempo de realização do método.
Utilização de ensaios sorológicos:
Definição da suspeita clínica
Diferenciação de fases da doença
Diagnóstico de doença congênita
Triagem sorológica em banco de sangue
Seleção de doadores e receptores de órgãos para transplante
Prognóstico da doença
Avaliação / monitoramento da terapêutica
Diferenciação da imunidade naturalmente adquirida ou artificialmente
induzida
Estabelecimento da prevalência da doença
Verificação de erradicação da doença
Verificação de reintrodução de novos casos em áreas consolidadas
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
HISTÓRICO
CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS QUE EMPREGAM
ANTICORPOS
VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.1- Imunodifusão: Interação Ag/Ac realizada em meio sólido (gél de ágar)
- Diversos tipos:- Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até atingir região de concentração equivalente;
- Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de banda na região de equivalência.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
Método qualitativo empregado para doenças infecciosas e autoimunes – Baixa Sensibilidade, boa especificidadeUsado antigamente para diagnóstico sorológico de
Brucelose, e algumas doenças viraisEM DESUSO
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
Método quantitativo empregado para dosagem de moléculas presentes em alta quantidade em amostras, por
exemplo, dosagem de Imunoglobulinas Totais.Baixa Precisão, baixa sensibilidade
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.2- Imunodifusão:-Vantagens – Método de fácil execução, tempo curto de realização, baixo custo, não necessita de aparato sofisticado
-Desvantagens – Baixa sensibilidade, especificidade, difícil preservação do gel, não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas.
-- Pouco utilizado atualmente como ferramenta de imunodiagnóstico. Empregado como controle em produção de policlonais.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.3- Hemoaglutinação – Utiliza hemácias sensibilizadas com Ags na membrana, que formam complexos de alto peso molecular quando incubadas com Acs específicos para os antígenos.
- Permite maior diluição da solução teste que a Imunodifusão. Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior velocidade e facilidade: Melhoria da detecção da interação entre Ag-Ac;- Variações no método: Inibição da Aglutinação.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
Método qualitativo e semi-quantitativo empregado para detecção de anticorpos específicos e moléculas
abundantes em membranas de células.Utilizado ainda em Med. Veterinária, apesar de impreciso.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.3- Hemoaglutinação:- Vantagens: Método simples, de fácil execução, baixo custo, rápido;
- Desvantagens: Baixa sensibilidade e média especificidade, devido a mau armazenamento das hemácias, pode-se obter resultados falso-negativos.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.4- Fixação do Complemento: Variação da técnica de Hemoaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolíca do Sistema de Complemento para amplificar a detecção da interação Ag/Ac.
-Variações da técnica: Inibição da Fixação do Complemento.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.4- Fixação do Complemento:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.4- Fixação do Complemento: -Vantagens: Maior sensibilidade do que a Hemoaglutinação, rápida execução, baixo custo;
-Desvantagens: Devido a problemas na preservação do Complemento, e na sua estabilidade, problemas de falso negativos podem ocorrer.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor;
-Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo
Outros componentes do soro
ELISA “SANDWICH”
Antígeno a ser dosado Anticorpo primário
Anticorpo conjugado
TMB
Enzima Peroxidase
ELISA DE COMPETIÇÃO
Outros componentes do soro
Antígeno a ser dosado Anticorpo primário
Antígeno biotinilado
TMB
ST-AV- Peroxidase
ELISA DE CAPTURA
Anticorpo anti-IgM
IgM a ser detectada
IgM inespecífica
Antígeno biotinilado
TMB
ST-AV- Peroxidase
ELISA INDIRETA
Antígeno purificadoIgM a ser detectada
IgM inespecífica
Anticorpo conjugado
TMB
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.5- ELISA:- Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio.
- Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.5- ELISA:- Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio.
- Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.5- ELISA:- Método Quantitativo de melhor relação custo/benefício em veterinária, para quantificação de hormônios (sexuais, tireoidianos, hipofisários, metabólicos...)
- Método de triagem para detecção de doenças infecciosas, alta sensibilidade, alta especificidade, mas podendo apresentar resultados falso-positivos, que devem ser confirmados por outros ensaios.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos (IF Direta) e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos (IF Indireta)
- Métodos de alta especificidade e boa especificidade
- Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC)
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:- Vantagens: Alta especificidade e boa sensibilidade; possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular.
- Desvantagens: “variação individual” na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis.
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot: Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas
- Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido
- Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução contendo diversos antígenos
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot:
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
2.7- Western-Blot:
Pode auxiliar na diferenciação de espécies de Leishmaniaque infectam o animal
Diferenciação do animal infectado do vacinado(dependendo do tipo de vacina)
2.7- Western-Blot:- Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes;
- Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança.
POUCO DISPONÍVEL AINDA PARA VETERINÁRIA
2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS
Métodos de Diagnóstico utilizando
Avanços Biotecnológicos no Brasil
-Leishmaniose canina – PCR, RFLP.
-Babesia canis, Ehrlichia canis – RFLP, RAPD.
-Leishmaniose – Citometria de Fluxo, Ags específicos
-Animais de Produção – Busca de diagnóstico rápido e
preciso, podendo ser realizado a campo.
SITUAÇÃO DA BIOTECNOLOGIAANIMAL NO BRASIL:
MERCADO BIOTECNOLÓGICO ANIMAL:
Mercado brasileiro de vacinas: US$ 221 milhões (2006)
Principalmente animais de produção, com participação de animais de companhia
MERCADO EM FRANCA EXPANSÃO
Não há dados disponíveis quanto ao diagnóstico veterinário
Colaboradores:
Prof. Vasco Azevedo – ICB/UFMG
Profa. Maria de Fátima Costa – ICS/UFBA
Prof. Luis Pita – EMEV/UFBA
Dr. Rodrigo Soares – CPqRR/FIOCRUZ-MG
Dr. Lain Pontes-Carvalho – CPqGM/FIOCRUZ-BA
Prof. Joaquin Patarroyo – DVT/UFV
Doutorandos:
Bruno Bastos
Soraya Correa
Mestrandos:
Daniele Dantas
Miriam Rebouças
Gabrielle Rodrigues
Ítala Fehlberg
Inara Rodrigues
Marcos Silva
Andrea Magalhaes
Osman Silva Jr.
Patrícia CisneirosIniciação Científica:
Ana Paula Portela
Marilia Marques
Jose Tadeu Raynal
Ludmila Sena
Aretha Alves
Rejane Rodrigues
Pesquisadores:
Prof. Roberto Meyer
Dra. Songeli Freire
Profa. Lilia Moura Costa
Profa. Vera Vale
Prof. Ricardo Portela
Dr. Edson Rodrigues
Profa. Kyioko Abe-Sandes
Profa. Ivana Nascimento
www.labimuno.org.br