ТЕХНОЛОГІЇ ТЕХНОЛОГІЇ МІКРОБНОГО СИНТЕЗУ МІКРОБНОГО СИНТЕЗУ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

11

Лекцій – 38 годин, лабораторних робіт -38, диф. залік

Тема Тема 44. . Культивування мікроорганізмів Культивування мікроорганізмів для одержання антибіотиківдля одержання антибіотиків. .

Особливості біосинтезу антибіотиків у Особливості біосинтезу антибіотиків у мікроорганізмів.мікроорганізмів.33

Вплив умов середовища на Вплив умов середовища на антибіотичну продуктивністьантибіотичну продуктивність1010. .

Спеціальні умови культивування для Спеціальні умови культивування для отримання антибіотиків.отримання антибіотиків.1818

Спрямований біосинтез антибіотиків.Спрямований біосинтез антибіотиків.2323

22

Особливості біосинтезу антибіотиків у Особливості біосинтезу антибіотиків у мікроорганізмів мікроорганізмів

Особливість біосинтезу антибіотиків Особливість біосинтезу антибіотиків мікроорганізмами полягає в тому, що мікроорганізмами полягає в тому, що цей процес відбувається за двохфазним цей процес відбувається за двохфазним принципом (рис.принципом (рис.11) Ця закономірність ) Ця закономірність характерна для більшості стрептоміцетів характерна для більшості стрептоміцетів і міцеліальних грибів. В 1-й фазі (фаза і міцеліальних грибів. В 1-й фазі (фаза збалансованого росту, збалансованого росту, тропофаза)тропофаза) відбувається процес накопичення відбувається процес накопичення біомаси продуцента. біомаси продуцента.

33

В 2-й фазі (В 2-й фазі (ідіофазіідіофазі, фазі , фазі незбалансованого росту) спостерігається незбалансованого росту) спостерігається уповільнення накопичення біомаси, уповільнення накопичення біомаси, навіть її зменшен-ня. В період ідіофази навіть її зменшен-ня. В період ідіофази відбувається дерепресія ферментів, що відбувається дерепресія ферментів, що приймають участь у біосинтезі приймають участь у біосинтезі антибіотиків. Починається антибіотиків. Починається антибіотикоутворення. антибіотикоутворення.

44

55

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216

Тривалість культивування, год

Інте

нсив

ніст

ь пр

оцес

у, у

м.о

д

утворення біомаси стрептоміцета біосинтез стрептоміцина

Рис. 1. Схема двофазного процесу культивування Streptomyces griseus

Основні біосинтетичні шляхи утворення Основні біосинтетичні шляхи утворення антибіотиківантибіотиків

Механізми біосинтезу антибіотиків можна Механізми біосинтезу антибіотиків можна розділити на три основні категорії:розділити на три основні категорії:

1. 1. Антибіотики, що походять від одного Антибіотики, що походять від одного первинного метаболіту. Шлях їх первинного метаболіту. Шлях їх біосинтезу складається з послідовності біосинтезу складається з послідовності реакцій, які модифікують вихідний реакцій, які модифікують вихідний метаболіт, як це має місце за синтезу метаболіт, як це має місце за синтезу амінокислот та нуклеотидів.амінокислот та нуклеотидів.

66

2.2. Антибіотики, що походять від двох чи Антибіотики, що походять від двох чи трьох різних первинних метаболітів, які трьох різних первинних метаболітів, які модифікуються та конденсуються з модифікуються та конденсуються з утворенням складної молекули. утворенням складної молекули.

33. Антибіотики, що є продуктами . Антибіотики, що є продуктами полімеризації декількох схожих полімеризації декількох схожих метаболітів з утворенням основної метаболітів з утворенням основної структури, що згодом може структури, що згодом може модифікуватися.модифікуватися.

77

В результаті полімеризації утворюються В результаті полімеризації утворюються антибіотики антибіотики чотирьох типів: чотирьох типів:

1) 1) поліпептидні антибіотикиполіпептидні антибіотики, які , які утворюються шляхом конденсації утворюються шляхом конденсації амінокислот; амінокислот;

2)2) антибіотики, утворені з ацетат-антибіотики, утворені з ацетат- пропіонатних одиниць пропіонатних одиниць в реакціях в реакціях

полімеризації, полімеризації, ccхожих на реакції хожих на реакції біосинтезу жирних кислот; біосинтезу жирних кислот;

88

3)3) терпеноїдні антибіотикитерпеноїдні антибіотики, що , що утворюються з ацетатних утворюються з ацетатних субодиниць в шляху синтезу субодиниць в шляху синтезу ізопреноїдних сполук; ізопреноїдних сполук; 4)4) аміноглікозидні антибіотикиаміноглікозидні антибіотики, що , що утворюються в реакціях утворюються в реакціях конденсації, сходних з реакціями конденсації, сходних з реакціями біосинтезу полісахаридів. біосинтезу полісахаридів.

99

Вплив умов середовища на Вплив умов середовища на антибіотичну продуктивністьантибіотичну продуктивність

Для кожного продуценту Для кожного продуценту антибіотика розробляється оптимальне антибіотика розробляється оптимальне поживне середовище, яке повинне поживне середовище, яке повинне забезпечувати максимальне забезпечувати максимальне накопичення продуцентом антибіотика. накопичення продуцентом антибіотика.

1010

Поживне середовище (ПС) повинно Поживне середовище (ПС) повинно відповідати наступним вимогам:відповідати наступним вимогам:

• повноцінність; повноцінність; • вміст доступних і дешевих вміст доступних і дешевих

компонентів; компонентів; • забезпечувати можливість забезпечувати можливість

ефективної фільтрації ;ефективної фільтрації ;• використання економічних методів використання економічних методів

виділення і очищення антибіотика.виділення і очищення антибіотика.

1111

Джерела азоту при культивуванні Джерела азоту при культивуванні продуцентів антибіотиківпродуцентів антибіотиків

Продуценти антибіотика засвоюють Продуценти антибіотика засвоюють азот в окисленій (азот в окисленій (NONO22

--, NO, NO33--) або у ) або у

відновленій (відновленій (NHNH44++, -NH, -NH22) формах. ) формах.

Найбільш важливі джерела азоту – солі Найбільш важливі джерела азоту – солі азотної або азотистої кислот, а також азотної або азотистої кислот, а також амонійні солі органічних або амонійні солі органічних або неорганічних кислот, амінокислоти, неорганічних кислот, амінокислоти, продукти гідролізу білків, білки. продукти гідролізу білків, білки.

1212

В натуральних середовищах В натуральних середовищах невизначеного складу (невизначеного складу (кукурудзяний кукурудзяний екстракт, меляса, соєве борошноекстракт, меляса, соєве борошно) азот ) азот міститься у формі білків. Утилізація міститься у формі білків. Утилізація такого азоту залежить від наявності у такого азоту залежить від наявності у продуцента відповідного протеїназного продуцента відповідного протеїназного комплексу для перетворення білків до комплексу для перетворення білків до амінокислот. У більшості продуцентів амінокислот. У більшості продуцентів антибіотиків найефективніше засвоює-антибіотиків найефективніше засвоює-ться азот амонійних солей та ться азот амонійних солей та амінокислот, в яких він знаходиться у амінокислот, в яких він знаходиться у відновленій формі.відновленій формі.

1313

Джерела вуглецю С при культивуванні Джерела вуглецю С при культивуванні продуцентів антибіотиківпродуцентів антибіотиків

Значення джерела вуглецю С Значення джерела вуглецю С для антибіотикоутворення полягає для антибіотикоутворення полягає насамперед у впливі на використання насамперед у впливі на використання джерела азоту джерела азоту NN. Для біосинтезу . Для біосинтезу антибіотика можуть бути використані: антибіотика можуть бути використані: глюкоза, галактоза, мальтоза, глюкоза, галактоза, мальтоза, сахароза, лактоза, крохмаль, гліцерин, сахароза, лактоза, крохмаль, гліцерин, етанол, янтарна, пировиноградна, етанол, янтарна, пировиноградна, оцтова, молочна кислоти. оцтова, молочна кислоти.

1414

Важливе значення має також Важливе значення має також співвідношення вуглецю С та азоту співвідношення вуглецю С та азоту N N в в середовищі. Для росту багатьох середовищі. Для росту багатьох продуцентів зазвичай оптимальним є продуцентів зазвичай оптимальним є співвідношення співвідношення 20:120:1 (С:N). (С:N).

Але не завжди таке співвідношення Але не завжди таке співвідношення призводить до максимального призводить до максимального накопичення антибіотика. накопичення антибіотика. Для Для кожного конкретного продуцента воно кожного конкретного продуцента воно встановлюється окремо встановлюється окремо експериментальним шляхом.експериментальним шляхом.

1515

• Джерела мінерального живленняДжерела мінерального живлення Важливими є фосфор (Р), калій (К), Важливими є фосфор (Р), калій (К),

кальцій (Са), магній (кальцій (Са), магній (Mg)Mg), сірка, сірка (S) (S), залізо, залізо (Fe)(Fe), цинк, цинк (Zn) (Zn), мідь, мідь (Cu) (Cu), молібден , молібден (Mo) (Mo) та інші елементи. Вони входять до та інші елементи. Вони входять до складу протоплазми клітини як складові складу протоплазми клітини як складові деяких ферментів, виступають як деяких ферментів, виступають як компоненти для регулювання компоненти для регулювання осмотичного тиску. осмотичного тиску.

1616

Важливе значення для утворення Важливе значення для утворення антибіотиків, що містять хлор антибіотиків, що містять хлор (( С Сl ) l ) (хлортетрациклін, хлорамфенікол), має (хлортетрациклін, хлорамфенікол), має наявність в середовищі цього галогену. наявність в середовищі цього галогену.

При цьому наявність інших При цьому наявність інших галогенів (наприклад, брому) призводить галогенів (наприклад, брому) призводить до інгібування процесу хлорування і до інгібування процесу хлорування і утворення антибіотика, що позбавлений утворення антибіотика, що позбавлений хлору.хлору.

1717

Спеціальні умови культивування для Спеціальні умови культивування для отримання антибіотиківотримання антибіотиків

Інтенсифікувати утворення антибіотика Інтенсифікувати утворення антибіотика окрім відомих підходів (окрім відомих підходів (отримання отримання мутантних штамів з підвищеною мутантних штамів з підвищеною здатністю до синтезу антибіотика, підбір здатністю до синтезу антибіотика, підбір відповідних середовищ для культивування, відповідних середовищ для культивування, покращення технологічних умов розвитку покращення технологічних умов розвитку продуцентапродуцента) можна шляхом сумісного ) можна шляхом сумісного культивування продуцента антибіотика з культивування продуцента антибіотика з іншими спеціально підібраними видами іншими спеціально підібраними видами мікроорганізмів. мікроорганізмів.

1818

Змішана культура термофільних Змішана культура термофільних Lactococcus та LactobacillusLactococcus та Lactobacillus,, що складають що складають мікрофлору йогуртів (кислого молока), має мікрофлору йогуртів (кислого молока), має більшу антибіотичну активність, порівняно більшу антибіотичну активність, порівняно з активністю цих мікроорганізмів поодинці.з активністю цих мікроорганізмів поодинці. Вплив мікроорганізмів в змішаних Вплив мікроорганізмів в змішаних культурах один на одного може відбуватися культурах один на одного може відбуватися по різному:по різному:

1919

– – продукти обміну одного організму можуть бути продукти обміну одного організму можуть бути використані іншим в якості джерела азоту, використані іншим в якості джерела азоту, вуглецю або іншого компонента чи в якості вуглецю або іншого компонента чи в якості попередника біосинтезу якої-небудь сполуки;попередника біосинтезу якої-небудь сполуки;

– – в змішаній культурі один з мікроорганізмів може в змішаній культурі один з мікроорганізмів може утворювати стимулятори росту для іншого.утворювати стимулятори росту для іншого.

2020

– – продукти життєдіяльності одного з продукти життєдіяльності одного з мікроорганізмів, що не утворює антибіотик, мікроорганізмів, що не утворює антибіотик, дещо притримують розвиток продуцента, який дещо притримують розвиток продуцента, який у відповідь починає активніше синтезувати у відповідь починає активніше синтезувати антибіотики.антибіотики.Необхідно враховувати, що не існує Необхідно враховувати, що не існує універсальних комбінацій для сумісного універсальних комбінацій для сумісного культивування. В кожному конкретному культивування. В кожному конкретному випадку необхідно підбирати відповідні випадку необхідно підбирати відповідні організми і їхнє оптимальне співвідношення.організми і їхнє оптимальне співвідношення.

2121

В останні десятиріччя ХХ століття успішно В останні десятиріччя ХХ століття успішно розвинувся новий напрям у біосинтезі розвинувся новий напрям у біосинтезі антибіотиків – це використан-ня імобілізованих антибіотиків – це використан-ня імобілізованих клітин продуценту. Виявилося, що живі клітини клітин продуценту. Виявилося, що живі клітини мікро-організмів в імобілізованому стані здатні мікро-організмів в імобілізованому стані здатні досить довго існувати і здійснювати характерні досить довго існувати і здійснювати характерні для них біохімічні процеси. для них біохімічні процеси. Існування Існування мікроорганізмів в імобілі-зованому стані є більш мікроорганізмів в імобілі-зованому стані є більш екологічним, тоб-то в природних умовах більшість екологічним, тоб-то в природних умовах більшість мікро-організмів існують саме в такому стані. мікро-організмів існують саме в такому стані.

2222

Спрямований біосинтез антибіотиківСпрямований біосинтез антибіотиків

Під спрямованим біосинтезом Під спрямованим біосинтезом антибіотиків необхідно розуміти втручання антибіотиків необхідно розуміти втручання експериментатора в метаболізм експериментатора в метаболізм мікроорганізму-продуценту для отримання мікроорганізму-продуценту для отримання одного (з декількох) або нових порівняно з одного (з декількох) або нових порівняно з тими, що звичайно синтезуються.тими, що звичайно синтезуються.

2323

Для спрямованого утворення Для спрямованого утворення переважно одного антибіотика з тих, що переважно одного антибіотика з тих, що продукує обраний продуцент (або їхньої продукує обраний продуцент (або їхньої модифікації) використовують наступні модифікації) використовують наступні методи втручання в метаболізм методи втручання в метаболізм мікроорганізмів:мікроорганізмів:

• зміна умов культивування і передусім зміна умов культивування і передусім зміна складу поживного середовища.зміна складу поживного середовища.

• введення в середовище для введення в середовище для культивування специфічних інгібіторівкультивування специфічних інгібіторів

2424

• отримання мутантів вихідного отримання мутантів вихідного продуцента, що утворюють продуцента, що утворюють модифіковані антибіотики.модифіковані антибіотики.

• оброблення отриманого антибіотика оброблення отриманого антибіотика певними ферментами або певними ферментами або мікроорганізмамимікроорганізмами..

2525

Отримання деяких антибіотиків шляхом Отримання деяких антибіотиків шляхом спрямованого синтезу:спрямованого синтезу:

• введення до складу поживного введення до складу поживного середовища речовин, що вбудовуються в середовища речовин, що вбудовуються в молекулу антибіотика, забезпечуючи молекулу антибіотика, забезпечуючи отримання препаратів з новими отримання препаратів з новими властивостями (введення попередників властивостями (введення попередників біосинтезу.)біосинтезу.) Попередники Попередники – це органічні – це органічні речовини, які в процесі біосинтезу антибіотика речовини, які в процесі біосинтезу антибіотика включаються в його молекулу без попереднього включаються в його молекулу без попереднього розщеплення на окремі фрагменти і їх розщеплення на окремі фрагменти і їх наступного ресинтезу.наступного ресинтезу.

2626

• зміна співвідношення концентрацій зміна співвідношення концентрацій джерел вуглецю та азоту (або ступеню джерел вуглецю та азоту (або ступеню аерації культури);аерації культури);

• введення специфічного інгібітору -на введення специфічного інгібітору -на середовищі з хлоридами S.aureofaciens середовищі з хлоридами S.aureofaciens продукує хлортетрациклін (90-95%) і продукує хлортетрациклін (90-95%) і тетрациклін (5-10%). тетрациклін (5-10%).

2727

ПРОМИСЛОВЕ ОТРИМАННЯ ПРОМИСЛОВЕ ОТРИМАННЯ АНТИБІОТИКІВ АНТИБІОТИКІВ

2828

2929

Промислове виробництво пеніциліну

• 1942 рік США – глибинне культивування

• 1942 рік СРСР – поверхневе культивування

• 1945 рік СРСР – глибинне культивування

3030

Автор промислового виробництва пеніциліну в СРСР

Ермольєва Зінаїда Віссаріонівна

Пеніцилін-крустозінPenicillium crustosum

Penicillium crysogenum

Київський завод медичних препаратів(нині корпорація "Артеріум")

• 1949 рік початок виробництва бензилпеніциліна;• 1950 рік початок виробництва стрептоміцину;• 1955 рік налагоджено випуск кристалічних

калієвих і натрієвих солей бензилпеніциліну

• Продуцент зберігають у вигляді спор на пшоні• Періодична перевірка продуктивності

•

Scientific classificationKingdom: FungiDivision: AscomycotaSubdivision: PezizomycotinaClass: EurotiomycetesOrder: EurotialesFamily: TrichocomaceaeGenus: PenicilliumSpecies: P. chrysogenum

Binomial namePenicillium chrysogenum

Thom (1910)

Склад поживних середовищ, що можуть бути використані для біосинтезу пеніциліну

Компоненти Середовище, вміст в %кукурудзяне жомове жирове

Кукурудзяний екстракт 2,0 – 3,0 – 2,0 – 3,0Жом (соняшниковий, соєвий) – 2,0 – 4,0 –Лактоза 5,0 5,0 1,0Глюкоза (сахароза) 1,5 1,5 1,5Азотнокислий амоній 0,4 0,4 0,4Сірчанокислий натрій 0,05 0,05 0,05Фосфорнокислий калій, однозаміщений

0,4 0,4 0,4

Сірчанокислий магній 0,025 0,025 0,025Гіпосульфіт натрію 0,2 0,2 0,2Крейда 0,5 – 1,0 0,5 – 1,0 0,5 – 1,0Попередник 0,3 – 0,4 0,3 – 0,4 0,3 – 0,4Піногасник 0,5 – 0,1 0,5 – 0,1 2,5 – 3,5

Умови біосинтезу пеніциліну

• Оптимальна температура росту 30ºС, в другій фазі – 20ºС.

• Найбільш сприятливе значення рН для росту міцелію 6,0-6,5. рН у другій фазі повинно бути 7-8.

• Біосинтез пеніциліну супроводжується інтенсивною аерацією.

• Максимум утворення пеніциліну відбувається на 6-7добу.

Для отримання бензилпеніциліну в якості попередника додають фенілоцтову кислоту або її похідні – фенілацетамід, фенілетиламін, фенілацетилгліцин та інші речовини.

Фенілоцтова кислотаДля отримання феноксиметилпеніциліну в

середовище для культивування додають феноксиоцтову кислоту.

Феноксиоцтова кислота

Технологія виробництва бензилпеніциліну (біосинтез)

Приготування посівного матеріалуt = 26C, -=12 – 48 год

Приготування та стерилізаціяпоживного середовища

Ферментація для отримання Бензилпеніцину

рН = 6.0 – 6,5, = 6 – 7 діб

Компоненти середовища

Penicillium chrysogenum

ПовітряПопередник

Піногасник

ПараВода

Середовище

Технологія виробництва бензилпеніциліну(попереднє оброблення культуральної рідини)

Фільтрування на фільтр-пресі

t = 4 - 6С

Фільтрування на барабанному вакуум-фільтрі

Коагуляція

t = 60 -75С, рН = 5,5 – 6,0

Міцелій

Міцелій

Культуральна рідина містить 3-6% сухих речовин, з них 15 -30% пеніцилін.

Виділення пеніциліну в промисловості базується на екстрагуванні розчинниками,

що не змішуються з водою.

Недоліком цього методу є екстрагування разом з пеніциліном інших органічних

кислот.

3838

Концентрування при екстрагуванні базується на великій розчинності бензилпеніциліну у вигляді кислоти в органічних розчинниках і малій розчинності у воді. Солі бензилпеніциліну навпаки добре розчинні у воді. Це дозволяє видаляти пеніцилін з нативного розчину невеликим об'ємом органічного розчинника і концентрувати цільовий продукт.

Вимоги до розчинників, що використовують для екстрагування бензилпеніциліну:

- Мала розчинність у воді; - Відсутність взаємодії з пеніциліном; - Можливість регенерації при температурі не вище 120 – 140С; - Низька собівартість.

Найкращими розчинниками визнано бутилацетат і амілацетат.

Технологія виробництва бензилпеніциліну(екстрагування пеніциліну)

Бутилацетатна екстракція пеніциліну з нативного розчину

підкислення нативного розчину до рН = 1,9 – 2,2

Екстрагування пеніциліну з бутилацетатного екстракту розчином бікарбонату натрію

рН= 6,3 – 6,8

H2SO4

Бутилацетат

Бікарбонат натрію

Технологія виробництва бензилпеніциліну(екстрагування пеніциліну)

Освітлення бутилацетатного екстракту вугіллям

Друге екстрагування пеніциліну бутанолом з бікарбонатного

екстрактурН = 2,0

Зневоднення бутилацетатного екстракту

t = -16 – -18С

Активоване вугілля

H2SO4

Бутанол

Технологія виробництва бензилпеніциліну(отримання кристалічних солей пеніциліну)

Стерилізуюча фільтрація концентрату натрієвої солі бензилпеніциліну

Отримання концентрату натрієвої солі бензилпеніциліну

рН = 6,4 – 6,8

Упарювання під вакуумом

t = 16 - 26С

0,56-0,6 н р-н NaОН

Безводний бутанол

Технологія виробництва бензилпеніциліну(отримання кристалічних солей пеніциліну)

Гранулювання пасти натрієвої солі бензилпеніциліну

Фільтрування та промивка осаду натрієвої солі бензилпеніциліну

Сушіння натрієвої солі бензилпеніциліну

під вакуумомt – 75 - 80С

Безводний бутанол

Дякую за увагу!Дякую за увагу!