Alcuni Aspetti del Differenziamento Muscolare in Coltura

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Alcuni Aspetti delDifferenziamento Muscolare inColturaAngelo Gino Levis a , Vera Bianchi a , Lucia Celotti a ,Danila Furlan a & Gianni Tamino aa Istituto di Biologia Animale dell'Università diPadovaPublished online: 14 Sep 2009.

To cite this article: Angelo Gino Levis , Vera Bianchi , Lucia Celotti , Danila Furlan& Gianni Tamino (1971) Alcuni Aspetti del Differenziamento Muscolare in Coltura,Bolletino di zoologia, 38:4, 405-479

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Boll. ZOO^., 38: 405-479, 1971 Atti dcl XL Convcgno dell’U.Z.I.

dLCUNI ASPETTI DEL DIFFERENZIAMENTO i\IUSCOT,.ARE I N COLTURA (*) (**)

AXGELO GISO LEVIS, VERA BIAXCIII, LUCIA CELOTTI, DANILA FURLAX c GIANKI TA3ITXO Istituto di I3iologia Anirnalc dcll’Universith di Padova

I. INTRODUZIOSE

11. ASPETTI CITOLOGICI, l 3 I O C ~ I J I I C I ED ULTRASTRUTTURALI DELLA JIIOGE-

NESI I N COLTURA

A. Fasi diverse del differenziamento niuscolarc B. AIeccanisnio di forniazione dcllc fibre polinucIeetc C. Aspctti ultrastrutturali dclla rniogcnesi

111. RAPPORT1 TRA ?JOLTIPLICAZIONE E DIFFERESZIAZIOSE

Iv. RAPPORTI TRA CICLO MITOTIC0 E FUSIONE DEI JIIOi3LASTI : LA JIITOSI + CRITICA *

V. INTEIIFERENZE SULLA JIIOCESESI

A. Tnterfcrenzc sulla maturnzionc dei mioblasti B. Dissocinzionc tra moltiplicazione ‘e fusionc C. Intcrfcrcnzc dovute a ccllulc eterotipiclic D. Efletti della BUdR sulla miogenesi E. Intcrfercnzc sul diffcrcnziarncnto dcllc fibre F. Revcrsibilith dcllo stnto diffcrcnziato

VI. DIFFERENZIAJIENTO DEI JIIOBLASTI CARDIACI IN COLTURA

VII. LIVELLI DI REGOLAZIOSE DEL DIFFERESZIAJIENTO JIUSCOL~RE A. Rcgolazione della duplicazione L1. Regolazionc della trnscrizionc C. Regolnzionc della tradozionc

VIII. CoNcLusIosI nrnLrocnarra

Pag. 405

a 408 m 408 u 410 u 412 a 410

* 421 Y 485 m 425 6 42s a 420 D 433

440 a 442 a 440 R 451 n 452 D 457

* 400 8 470

I. IXTItODUZIOSE

Per affrontnrc il probleina del diffcrenziamento negli Eucarioti i: an- Cora necessario rifarsi in gran partc alle conoscenzc di Biologia Molecolare rieavatc dallo studio (lei sisteini bntterici e dellc intcrnzioni Batteri-Virus.

(*) Lo ricerelie pcrsonnli citatc ncl corso dclla Relazione sono state escguitc con

(**) ilbbrfviazioni : Tdr = tirnidina ; Ur = uridina ; BUdII = 5-brornodesos- . siuridina ; PUdR = 5-fluorocicsossiuridina ; Tdr-311 = tirnidina tritiata, ecc. ; RNAin, RSAr = IiXA mcssnggero, ribosonialc ; DSasi = dcsossiribonucleasi ; RNasi = ribo- nuclcasi. Le fnsi dcl ciclo di duplicazionc dcl DNA S b n O indicate con lc siglc S (fasc di sintcsi), G2 (rase prcmitotica), 31 (niitosi), G1 (hsc postmitotica).

contributi del Consiglio Xazionale dellc Riccrche.

Indubbiamcntc il diflccrcnziamento prcsentn aspetti distinti c pih complessi rispetto ai mcceanismi dclla regolazionc genica (induzione, rcpressione) nei Battcri. Si pcnsi ad csempio a1 fcnomeno dell’amplifieazionc gcnica, importante per una rcgolazionc quantitativa dclla produzione di molccole specifiche ; alla restrizione spesso irrcversibile, delln trnscrizionc anchc in hsscnza di uno stimolo costnntc, come invccc ricliiedcrcbbe la regolazione ; all’associazionc dcl DNA con molccolc (istoni, proteinc acide, RNA) awnti UII ruolo nclla regolnzione sia dclla duplicezionc clie delIa trascrizionc ; alla coniplessith del ciclo mitotic0 ed alle conscguenze clic questo comports per la struttuia e la funzionc dei eromosomi, per la distribuzione dell’RNA e per l’attivith dci ribosomi ; all’azionc di sostanze complesse come gli ormoni, che non possono certo essere confrontate coi mctaboliti spccifiei chc intcrvengono nei sistemi classici di regolazione ; alla prescnza di RNAm a vita media relativamente Iunga c rircvcrsa alla maggiorc instabilitj dellc molecole proteiche ; alle variazioni della quantith di stampi attivi per la traduzionc, rcalizzatc attraverso mcccanismi chc controIIano sin il trnsporto dcll’RNAm dnl nuclco a1 citoplasma sia In m a stnbilith sia il livello dci ribosomi ; all’esistenza di fattori capaci di a attirarc i ribosomi e di pcrmetterc una sclezione degli stampi prescnti in momcnti specifici della vita cellulare ; all’iniportanza dcl citoplasma nella stabilith della determinazione e nclla rnodulazione dell’cspressionc dello stato dif- ferenzinto, in rapport0 anclic alla possibilith chc non tutto 1’RNAm sin di origine nuclearre ; allc diffcrcnziazioni strutturali e funzionali dclla membrans plasmatica cd allc conscguenze clie questc provocano sullc intcrazioni cellulari, sulla permcabilitj e quindi sull’ambientc intracellularc ; in gcneralc all’csistcnza cii meccanismi di rcgolazione clic intervcngono non solo (0 non prevalcntcmcntc) alla trascrizionc eom’i: nci Batteri, bend in punti divcrsi dclla catena di reazioni clic portnno alla sintesi ed a1 mon- tnggio dellc proteine cnrattcristiclie delln ccllula differcnziata. 3ia proprio I’impostazione clic 6. partita dalle teorie gcncrali sulla trasmissione c sulla iegolazione dcll’informazionc gcnctica ha permcsso di coglicrc questi ed altri caratteri distintivi bcl differcnziamento cellularc e di elaborarc ipotesi di lavoro clie lianno trovato nei metodi dclla Biologia Molccolore una possibilith di vcrifica.

Dal punto di vista sperimentalc, oltrc ai sistemi classici in vivo (fe- condazionc, sviluppo cmbrionalc, istogenesi ed organogcncsi), trovnno oggi largo sviluppo gli studi sul differenziamcnto di cellulc dissociate in colturn. L’idea che i sistemi di coltura in vitro, a partc lc colturc d’organo e di tessuto, si prcstino male a1 mantcnimcnto o all‘espressionc dei caratteri eellulari differenziati, riflcttc gIi esiti di uri period0 lion troppo lon-

tan0 in cui l’inadcguatczza clci mctodi di dissocinzionc c I’insuacicI1za dci tcrrcni c dcllc tccnichc di coltura permcttevnno di ottcncrc popolazioni ccllulari con elcvata cnpncitj prolifcrativa, ma (( sdiflcrcnziatc )). oggi invcce i. possibile mantenere in viiro tipi cellulari spccifici (per citnrne a]- cuni : condrociti, mioblasti, ccllulc pigmcntatc dclla retina, fibroblasti, ccllulc nerrosc) c studiarnc i carattcri diffcrcnziativi. Lc possibilitj di ma- nipolaaione clic offrono i sistcnii in vitro permettono inoltre di affrontarc con relativa scmplicitj lo studio dcllc intcrazioni ccllulari, dcllc influenzc anibicntali sull’cspressionc fenotipicn dei carattcri diffcrcnziatit-i, dei fattori clic sono alla base dclla stabilitj e della revcrsibilita dello stato diffcrcnziato. P. cs. i mctodi di sincronizzazione, di coltura clonak, di ibri- dazione sonintica, ctc., rendono lo studio delle basi biochimiclic dcl dif- fcrcnzianicnto assai pih acccssibile i1~ vibo clic i n v i w , anclic sc ovvia- mcntc lc diffcrcnzc tra le due condizioni richiedono una notcvolc cautcla ncll’cstrapolazionc dellc conclusioni raggiuntc.

Da quest? punto di vista lo studio clcl diffcrenziamcnto muscolarc ha seguito in nianiera tipicn l’cvoluzionc dci nictodi di coltura in viiro. Solo rcccntcmcntc infatti sono state mcsse a punto tccniclic per isolare ccllulc rnuscolari c per coltivarlc in monostrato, per scpararc cloni puri di mioblasti, per ottenere lince stabili dotatc di cnpacith diffcrenziativa, per rcs- lizzarc fibre muscolari ibride ctc. ~ stnto cosl chiarito il mcccanismo di formazionc dcllc fibre muscolari plurinucleatc, il rapport0 trn ciclo mitotico c firsionc dci mioblnsti, quello tra sintesi di DNA (moltiplicazione) c comparsa dellc proteinc contrattili (diffcrcnziazionc) ; cd importanti contributi sono stati portati alla conosccnza dcllc modificazioni ultrastrutturali c biochimiclic iicl corso dcl differenziamcnto, dcll’origine dci mioblasti c dclln stabilith dcllo stato differenziato, dcllc influcnze nmbicntali sulla mnturazione e la fusionc dci mioblasti c sullo sriluppo dcllc fibre. X e i: derivato un quadro ancora larganicntc incomplcto, ma comunque in grad0 di fornire un contributo anchc a1 problema pih gencrale dclla rcgolazionc dcl differcnziaincnto ccllularc.

Nella rclazionc prcndcrcmo in esamc alcuni aspctti spccifici dclln miogcncsi in coltura, intcgrando la discussionc ovc possibile con dati ottenuti irt vivo c cercando soprattutto di ricavare, sulla base dei meccanisnii di rcgolazione del differcnziamcnto cliiariti per sltri tipi ccllulari, sclicmi intcrprctativi cd ipotcsi di lavoro validi anclic per il muscolo. Con I’CC- cczionc di un pnrngrafo dcdicato agli nspctti pcculiari del diffcrenziamcnto dcl niuscolo cardiac0 in coltura, farcmo costante riferimcnto a1 muscolo sclieletrico striato dci Vertebrati die rapprcsenta il msterialc di scclta, per lo studio dclla miogcnesi in coltura. Ottime monografic sull’argomento

sono state scrittc da KOSIGSBEEG (19G3), ~IURRAY (19G5), KOSIGSBERG e HAUSCIIKA (19G5), HOLTZER (19GG), e rcccntemcnte da HAUSCIIKA (1968) e da YAFFE (IDGO). Gli aspctti macromolecolari dcl diffcrcnziamento muscolarc e quelli ultrastrutturali della niiofibrillogcnesi in vivo sono stati riristi rispcttivanientc ds HERRMANK et nl. (1970) c da Frscmrax (1970), e contengono riferimenti anche a h miogcnesi in coltura. 11 lettorc in- tercssato potrb approfondire in qucsti articoli qucgli argomenti che in questa scdc vcrranno trattati solo sommariamente.

11. iismi=m CITOLOGICI, UIOCIII~IICI ED UI,'I'IIASTRUTTUR~~LI DELLA 1lIOGENESI I N COLTUIiA

Lc prime colturc di muscolo schcletrico sono state rcalizzate una cin- quantina di anni fa mcdiante la tecnica degli cspianti, ma i contributi pih importanti alIo studio dcl diflcrcnziamcnto muscolarc in vitro sono stati ottcnuti ncgli ultimi dieci anni, cioit dopo la realizzazionc dcllc colture monodispcrsc (KOXIGSBERG, 1960). Ne & emcrso un dato nuovo c stimo- lantc, cio6 la dimostrazionc clie it possibile seguirc la diffcrcnziazione di un tessuto cmbrionalc a psrtirc ciagli clcmcnti ccllulari clie lo compongono, anchc se qucsti rcngono dissociati c coltivati in vitro. B stata cosl final- mentc superata la tcndcnza fatalistica a considerarc la (( sdifferenziazionc B destino comiine pcr i divcrsi tipi ccllulari in coltura.

A. Fnsi diverse del di$erenzianiento miiscolare

Rccentcmcntc sono stati pubblicati dati sul diffcrcnziamcnto in coltura dcl muscolo in rigcncrazionc dclla coda di luccrtola (Cox e SIJXPSON, 1970) c dci muscoli di larvc di Lcpidottcri (KURTTI c BROOKS, 1970), ma il niatcrialc clcttivo pcr Ic colturc in monostrato di ccllulc muscolari dissociatc b rapprcscntato dai muscoli pcttorali o dclla coscia di embrioni di pollo (10-14 gg) oppure dni muscoli dclla coscia di rattini nconati (fino a 3 giorni). Ci sono dei rnotivi prccisi nclla scelta di particolari stadi di sviluppo : il muscolo, pur prcscntando gi& sottili fibrc polinuclcatc, comprcndc ancora un numcro elcvato di ccllulc mononucleate, rclatiramentc indif- fcrcnziatc, c sono soprattutto qucstc clie danno origine allc colturc monodispcrsc. I mctodi di dissociazionc dcl tcssuto, i tcrrcni di coltura, i composti aggiuntivi (sicri, estratti cmbrionali, ormoni, ctc.), il substrato per I'adcsionc c la crcscita delk cellule, son0 molt0 divcrsi (RESSEGUIE, lOGl ; KOSIGSBERG, lW3) : Ie modificazioni ambientali hanno grandc importanza pcr l'individuazionc dci fattori clie rcgolano I'esprcssionc dcllo stato diflcrcnziato c alcunc vcrranno discussc nci prossimi paragrafi.

Dalla disgregazionc dcl muscolo originano essenzialmcntc due tipi di cellule, fibroblasti e mioblasti, distinguibili fin dulle sospensioni inizidi (COLEJIAX, 1070), e mcglio dopo I’adesione a1 substrato (KOSICSBERG, 19G3), in base allc dimensioni, alla forma, alla mobilith, alla rifrangcnza, alle proprieth di colornbilith, etc. Lc colturc che ne derivano sono dunque colturc miste, ma c’i! la possibilith di allestirc colture purc di mioblasti isolando, in colture clonali iniziate a bassissima densith cellulare, le colonic originate da cellule singole e morfologicamente distinguibili come @ muscolari D ( KONIGSDERO, 1961), oppurc scparando i mioblasti dni fibroblasti in base alle diverse proprieta di adesionc a1 substrato (YAFFE, 1968). Lc colture miste restano tuttavia le pih facili da realizzare e sono ancora le pih utilizzatc.

Dopo l’adesione dellc ccllule a1 substrato, si distinguono sempre trc fasi ben caratterizzate. Dapprima i niiobhsti ed i fibroblasti si moltipli- enno attivamcnte per uno o piii cicli ; a1 20-30 giorno di coltura, senza clie necessariamente il tappet0 cellulare sia diven tato confluente, compaiono improvvisaniente e contcmpornneamente piii (( foci o in cui i mioblasti si fondono e formano fibre polinucleatc chc, nel giro di poclle ore, diren- tano il tip0 cellularc predoniinantc. Mentrc in vivo la formnzione di fibre eon qualchc centinaio di nuclei pub ricliiedere scttimane, in coltura fibre con migliaia di nuclei si formano entro 24 ore ; le fasi della miogenesi in vitro hanno quindi luogo in manicra notevolmente sincrona e questo rapprcscnta un grosso vantaggio. A differenza di quanto si osserva in viuo, in coltura le fibre si fondono attivamente anche fra di loro c finiscono per formare un complicate intreccio. X C I I ~ fasc successiva si ~ i a un finomeno di u saturazione )) delle fibre, clic diventano refrattarie ad assumerc altri mioblasti, mentre acquistano complessitj struttmale (striatura longitu- dinale c trasversale) e funzionale (contrazioni spontanee). In quest’ultima fase eessa la moltiplicazione delle ccllule mononucleate clie non si sono fuse, per cui una coltura ben sviluppata (5-7 gg) consiste di una rctc di fibre striate polinucleate contrattili, e di un tappcto quicscente di fibroblasti, con rari mioblasti mononucleati generalmeiite sparsi o piii di rado strcttnmcnte accollati allc fibre.

Abbiamo descritto subito l’aspetto pih elenlentare, niorfologico della miogenesi in coltura perch6 ritcniamo clie si possa partire dall’ipotcsi chc lc tre fasi dcl diffcrenziamento (moltiplicazionc dci mioblasti ; loro fusione ; differcnzinzione dellc fibre) siano collegatc cronologicamcnte pcrcli6 si trovano in relazionc causale l’unn con l’altra. Esaminandone in dct- taglio alcuni aspctti, l’nttenzione snrh centratn su qucgli eventi clie pas- sono costituire la base per una rclazione di questo tipo.

Un primo nspetto che si i: dato per scontato mn chc in rcaltk ha rap- presciitato unn dcllc maggiori controvcrsic tra gli embriologi che si sono occupati dcl diflcrenzianiento muscolare, riguarda In dipcndcnza assoluta dell0 sviluppo dclln fibra polinuclcata dal processo di fusionc dci mioblasti. Infatti per molto tempo si & ritcnuto che l’aumento dci nuclei nclln fibra fosse conscguenza di un processo cli divisionc dirctta, amitotica. L’ipotcsi si basava su di un reperto rclativamcnte comunc nel matcriale fissato: nuclci strettamentc addossnti, a coppic, con picglie della membrann nucleare c a voltc con nucleoli csattamentc corrispondcnti per numcro c posizione. Divcrsi Autori lianno dcscritto cscrnpi di aiiiitosi c persino di mitosi ncllc fibre muscolari striate (I’argomento i: stato rivisto da JIURRAY, 10G5). Jla lie1 muscolo fissnto hi ioto o nclk colturc di frammenti di tcssuto & molto diflicile escludcre che cventunli figure mitoticlie siano rifcribili, invecc clic ni nuclei della fibra, a mioblasti ad essa strettamciite accollati o sovrapposti ; inoltre per potcr csscr ccrti dell’csistenza di fcnomeni ami- totici & indispensabilc scguirc lo svolgimcnto dcll’intcro processo. I1 problcma & stato comunque risolto in manicra definitiva grazic alle colturc di cellulc muscolari dissocintc, mcclinntc osscrvazioni a livcllo diverso che possono csserc schcmntizzate come scpc. a) I n vivo, a contrast0 di fasc, non sono niai stati osscrrati cscmpi di amitosi o di niitosi ncllc fibre (Bass- LEEI:, 10G2 ; KONIGSBERG, 10G3) ; qucste si formano in scguito alla fusionc dci mioblnsti c I’rrumcnto dci nuclei dipende csclusivamentc dall’apporto di nuori mioblasti o ddla fusione tra fibre. I nuclei dellc fibre si spostnno con notcvole rnpidith (possono percorrcrc pih cli 80 p in un’ora), si addcn- sano in dcuni tr,ntti, ruotano anchc quando sono strcttamentc a contntto c nc clerivnno dcforniazioni tcmporancc dclla mcmbmna nuclcare cbe nci preparati fissati possono far pensarc a figure amitotiche. b) Melitre i inioblasti si inoltiplicaiio attiramcntc c sintctizzano DNA, dopo la fusionc cessn 13 sintcsi di DNA, c in questc condizioni lion si redc come possa cssere ripristiiiato il corredo nuclcare dopo eventuali proccssi tli divisionc iiiitotica o amitotica. I1 dato i: ben dimostrabile incubando Ic colturc per pcriodi brcvi con Tdr-3I-I e continuando poi l’incubazionc in assenza dcl prccursore radioattiro dcl DNA : inizialmcntc risultano niarcnti i mioblasti mn lion Ic fibre p~linuclcate, iicllc quali nuclei marcnti compaiono solo dopo un ccrto tcmpo, quando cioe si fondono mioblasti radioattivi (STOCKDALE

c IIOLTZCII, 1061 ; BJSSLECB, l9G2 ; BISCIIOPF c HOLTZEII, 1000 ; PICCISSI et nl., 1970). c) Dctcrminazioiii istofotometrichc dirnostrano chc nientre i nuclci dei niioblasti lianno contenuto in DKA uariobile dal lirello postmi-

totico (2 C) CI qnello prcmitotico (1 C), i nuclei della fibra sono tutti 2 C (BASSLEER, 19G2 ; STREIILER et QZ., 1963 ; cox e SIJIPSON, 11)50), in rapporto a1 fatto clie i mioblnsti si fondono in una fase bcn prccisa. del ciclo mitotic0 ( G I ) . d) Importnnti conferme vcngono ds studi sugli effetti di inibitori del ciclo mitotic0 e dclla sintcsi &I DNA. La eolcliicinn blocca la divisione dci mioblnsti ma non provoca nccumulo cli figure mitoticlie nclle fibre (OKAZAKI e HOLTZEI~, l 9 G G ; BISCIIOFF c HOLTZER, 1968). L’iprite nzotata intcrfcriscc con la sintcsi del DNA (LEVIS e DE NADAI, 1DG.E) c provoca un blocco nella fasc S o nll’inizio di G 2, pcr cui Ic ccllulc clie si trovano in G 3 a1 momento del trnttamento possono ancora dividersi e vcngono arrcstate solo dopo un ciclo moltiplicativo (LEVIS et al., 1965) ; riclle colturc di ccllulc mmcolari I’iprite, pur provocando grosse altera- zioiii nuclcai i nclic celluk mononuclcate c bloccando la sintcsi dcl DNA, non inibiscc In fusionc dci mioblnsti nC lo sviluppo dcllc fibre, c cib di- ,mostrn clie i due processi non dipendono da sintcsi di DNA (KOSIGSBERG et d., 1OGO ; BASSLEER, 1902). La BUdR clic & ixii analogo dclla Tdr, incorporata dni mioblnsti clie sintctizznno ottivamcnte DNA, ne inibiscc la fusionc mn non la moltiplicazionc ; riportati in terrcno privo clcll’inibitorc, i mioblnsti dopo nlcunc gencrazioni riprendono D, fondersi c for- mnxio fibre polinucknte (STOCKDALE cl d., 19G4 ; COLEJfAS et d., 1961)). T’iccversa la FUdR, che inibisce la timidilato-cliinasi c quindi la sintesi dcl DNA, fa dcgcncrare i mioblnsti nieiitrc non altcra lo sviluppo delle fibre gih formntc (COLEXAX c COLEJIAS, IDGS). Annlogo effctto si otticnc trattaiido con actinomicina-D (YAFFE c FELDMAS, 1DG1) clie a bassc dosi inibiscc la sintcsi dcll’RXAr ed i: qiiindi lctnle per le ccllulc in nttivn moltiplicazionc conic i niioblasti, ma non per lc fibrc. Inoltre le fibrc, come tutti i tessuti carnttcrizzati da scarsn attivith prolifcrativn, sono rcsistcnti n forti dosi di raggi S sin in vifro (I’AFFE e Fucrrs, lOG7) die nelln rigcncrazionc muscolare in viuo (REZSIK, 11)70), iiicntre !c stcssc dosi inibiscono profondamentc la moltiplicnzionc (lei mioblasti c di conscgucnza la loro fusionc (REZSII;, 1970 ; I’AFFE, 1971). e) Dctcrriiinnzioni spcttofotometri- clie c scintillografiche dopo incorporazionc cli Tdr-W, confcrmano clie la ccssazionc dclla sintcsi cli DNA i: in rapport0 con In fusionc dei mioblasti : l’attivith spccifica dcl DNA 6 clcvata nellc prime fasi di coltiira, cala bru- scamcntc con la comparsa dcllc fibre poliniicleate e la trnnsizionc & pih o meno prccocc in rnpporto a1 momento in cui si vcrificn lo fusionc, clie pud csscrc rcgolato modificando In dcnsith clell’inoculo ccllularc ( CELOTTI ct d., 1071). Sc dnllc colture viene scparnta una frazionc ricca in cellule mo- nonuclcntc cd una forniata prcvnlcntcmcntc da fibrc, I’attivith dclla DNA- polimcrasi 6 aka nclla prima frazioiic c niolto bassn nclla scconda (OWEILL

e STROIIMAX, 10GO).f) La formazione di fibre muscolari ibridc in colture di mioblasti sclielctrici di specie animali diverse, chc pub cssere scguita marcando con Tdr-SH solo i mioblasti cfi uno dci due partners e ritro- rando poi fibre con nuclei marcati e non marcati (YAFFE c FE'LDJIAX, 1905 ; MASLOW, l9G9 ; BIAscrrI et al., 1971), forniscc un'ulteriorc conferma del fatto che le f i b r e 4 originano per fusione dci mioblasti. Ad analogs conclusione portano i risultati di un esperimento molto elegante realizzato da R h T z e BAKER (10G7), chc hanno ottenuto lo sviluppo di u ibridi d o - fenici )) di top0 aggrcgando blastomeri di cmbrioni con due divcrsi gcnotipi, ciascuno competcnte per la produzione di una forma divcrsa, genetica- mente determinata, degli isoenzimi dells deidrogenasi isocitrica (p. es., aa, bb). Nei diversi tessuti degli animali cod ottcnuti, comprcso il muscolo cardiaco, si trovano soltanto gli isoenzimi parentali ; ncl muscolo sclieletrico sono prescnti lc formc molccolari ibride (ab) dato clie solo in qucsto tessuto i mioblasti si fondono c le fibre contengono cvidentcmcnte en- trambi i genomi parentali. Questo risultato suggerisce anchc un possibile us0 dcllc fibre niuscolari ibride per studi sullc intcrazioni fenogcnetiche tra nuclei diversi : esso confcrma clie gli isoenzimi derivano dall'aggrcgszionc di monomeri polipeptidici sintetizzati separatamente, e dimostra che nella fibra possono essere attivi genomi divcrsi, e clie sintesi e montaggio delle subunit& possono aver luogo in un citoplasma comunc. g) Infine la fusione dci mioldasti come meccanismo di formazione delle fibre e conic segnale per l'instaurarsi di fenomeni differcnziativi complessi, b documentata da osservazioni ultrastrutturali sulla miogenesi in coltura, ehc i: il caso di esaminare in dettaglio.

C. Aspetti iilfrastrittturali delln miogenesi Molto meglio clic a livcllo di microscopia ottica, le modificazioni strut-

turali clie permettono di identificarc il mioblasto come una ecllula relativamcnte indiffcrenziata c la fibra polinuelcata come una struttura diffcrcn- ziata, sono documentate dcllla mieroscopia clcttronica. Le osscrvazioni sulla miogenesi in coltura, rclativamente semplificatc dal fatto die le eellule formano tappeti monostratificati c possono quindi esscrc osscrvate in toto e selezionate in modo da distinguerc con sicurczza i mioblasti dallc sczioni di fibre polinucleate, lianno anche contribuito a cliiarire alcuni punti controversi, quali risultavano da osservazioni effcttuate durante lo sviluppo embrionale e In rigcnerazionc. e stato osservato (FIILIZET, 1967 ; SIIIXADA et at., 1967) che i inioblasti lianno abbondanti ribosomi c polisomi, a volte disposti ad cliea, associati alle membrane del reticolo ma piii spesso liberi, e che presentano microtubuli di 180-200 A, comuni in moltc altre cellule.

I mioblasti hanno filnmenti citoplasmatici di duc tipi : filamcnti sottili (GO A) raccolti a fasci nelle prossimith dclla mcmbrana plasmatica c che contengono una proteina simile all’actina (ISIIIKAWA et d., 1000) c filamenti pih spcssi (100 A), indicati come 4 filamcnti intermcdi 0, clistribuiti in manicra disordinata (ISIIIPIVA et nl., 1968). Dato che cntrambi i tipi di filamcnti si osservano in nltrc celluile mononuclcatc non miogeniche (fibroblasti, macrofngi, ctc.), C improbabilc che essi svolgano un ruolo ncIIa formazione dclle miofibrillc contrattili. I fihmenti spcssi (lG0 A) di miosina sono semprc assenti nei mioblasti. Second0 F1scmi.m (1070) nessuna delle carntteristiche ultrnstrutturali indico te 6 specifica dei mioblasti : csse si osscrvano nelln maggior pnrte dellc ccllule cnibrionali di origine nicso- dermica, prima clie queste si diRercnzino. Pcrcih la possibilith di idcntifi- care con sicurezza un mioblasto i! limitata sia in v im clie ita citro a1 momcnto della fusione ; anche i caratteri distintivi tra mioblasti e fibroblnsti, riconoscibili a1 microscopio ottico, possono corrispondcrc a modificazioni dell’espressione fcnotipica di un unico tipo cellularc, come risultcd chiaro pih avanti.

Un ccrto interesse prcsentano a1 microscopio clcttronico i prolunga- mcnti citoplasmntici che caratterizzano le cstremitii affusate clei niioblnsti : 6 a questo livcllo chc inizinno i movimcnti anieboidi, particolarmente attivi nellc prime fasi in colturn, cd i! qui clie si instaurano i contatti in- tercellulnri spcsso nccompagnati (la cnratteristiche modificazioni di membrana (4 tight junctions D). A livello (lei prolungamenti non sono prcscnti n6 microtubuli nC filamcnti nC ribosomi nC rcticolo (F~scrr~r~s, 1070).

Xclle fibre polinuclcate si osscrva una progrcssiva riduzionc dcl numero di ribosomi c la comparsa di polisomi ad elica formati da un numero anchc mdto elevato di unit5 (55-70)’ che in questo caso corrispondono ai complcssi rcsponsabili delln sintcsi deIIa miosinn, identihati mediantc studi su sistcmi isolnti (HEYWOOD et nl., 1937). Ncllc fibre, oltre ni microtubuli, si riconoscono tipici filnmenti sottili di actins c filamenti spcssi di miosina, inizinlnicntc liberi. La manennza di rnpporti spazinli tra polisomi e miofrlamcnti fa pcnsnre clic a1 niicroscopio clettronico siano risolvibili solo Ic molecole g i j polimcrizzatc c lion le suhunitii dclla miosina clw sono in\-ccc il profiotto immediato dcll’attivith polisomale (HEYWOOD c Nwa- GWU, 1OGO). I?, senza dubbio un process0 a tappc qucllo chc porta all’asso- ciazione dellc subunit&, alla polimcrizzazione dei monomeri dclla miosina, dl’organizzazione dellc varic proteinc muscolari : infatti solo man mano clie proccdc lo sriluppo della fibra i miofrltimenti si associano a formare fasci orgnnizzati di miofibrillc col carnttcristico ordinamento csngonale (FIRII‘ET, l9G7).

La comparsn di actina c di iniosinn orgnnizzato in miofibrillc 15 sicu- ramcntc succcssiva alIa fusionc (lei mioblnsti in coltura: se si osscrva un mioblasto chc si fonde con unn fibra g i j forrnatn, In distinzionc tra i due citoplnsmi i. molto ncttn anclie sc le mcmbranc dirisoric sono gih sconi- pnrsc (FIRRET, 1907). In coltura 6 possjbilc sclczionnrc mioblnsti bloccati in mctafase in scguito a trattamcnto con colchicina, i quali non prcsentano a1 niicroscopio clcttronico miofilnmcnti di miosinn nt5 altrc diffcrcnziazioni tipiclie dclla fibra polinuclcnta (ISIIIKAWA ct al., 10GS). L’affcrinazionc dclla prescnza in vim di miofilnmcnti di miosina anchc nci mioblasti mononuclcati (PIIZYBYLSKI c BLUJIDERG, 10GG) dcrira d a k dificoltj gih citatc di osservazionc dcllc sczioni di muscolo i t i toio, dall’impossibilit5 di distingucrc con sicurczzn i filnmcnti sottili da quclli spessi fincliC non sono associati nci fasci di miofibrillc, dall’esistcnza di un tcrzo tipo di filamcnti, i cosiddctti filnmcnti intcrmcdi D, trorati inizinlmcntc ncl muscolo in coltura ( I s 1 1 r K a w a et d., 1908) c prcscnti in tutti i tipi di ccllule del muscolo (mioblasti, fibre, fibroblasti) ed in altrc ancora. Lc osscrvazioni ultrastrut- turah piii rcccnti (PRZYBYLSKI, 1071) inclicano chc anche in vim lc miofibrillc cd i polisomi rcsponsnbili dclln sintesi tlclla miosinn compniono solo clop0 In fusionc dci mioblnsti.

La diffcrcnziazioiic succcssiva dcl muscolo in coltura & carattcrizzatta dalln forniazione di corpi scuri clie si orgnnizzano in bandc (iincc Z) ; nci punti in cui qiicsti prcndono contatto coi fasci di miofibrillc, i filanicnti spcssi nppaiono intcrrotti c qucsto dii originc nlla caratteristica strintura trasversale (bande A cd I). Con I’instaurmsi dcll’attiritii contrattilc nnclic 1’01- gnnizznzionc dci sarcorncri si complcta (FIIII~ET, 10G7 ; SIIIJIADA ct nl., 1067). Si sviluppa nnclic il sistcma tubularc trasverso (sistcma T), la cui originc dalla mcmbrana plasmatica ha potuto esscre dirnostratn in manicra incquivocnbilc proprio grnzic ni mctodi di coltura (EZERXAX c ISIIIKAWA, 1067), in qunnto Ic tccniclic cli diffusionc con fcrritina sono applicnbili in aifro scnza chc lc ccllulc dcbbano csscrc prima sezionatc. Dallc vescicolc dcl rcticolo cndoplasmatico prcndc inmcc origine il rcticolo sarcoplasmatico, clic fornin nssicinc ai tubuli rlcl sistcma T Ic cnrnttcristichc trindi si- tuate a livelli ben dcfiniti dci sarcomcri. In coltura si osscrrano pcrb con una ccrta frcqucnza vnriazioni dclla morfologia tipica dcllc triadi (diadi, pciitadi) in condizioiii c h si considernno normnli, xncntrc in vivo qucstc scmbrnno cnrnttcrizxnrc aspetti patologici dclla miogencsi (FISCIIIIAS, 1970).

Ncllc fasi pih aynnzate dclln miogcncsi in vifro si puB osscrvarc la forninzione dclln mcmbrnnn basale ( SIIIJIADA el nl. , 10G7 ; ISII IKA~A, 1070) c In prescnza, a1 di sotto di questa ma cstcrnamcntc alla mcmbrsna pla-

smatica dells fibra, di ccllule mononuclcatc simili a mioblasti, clic n qiie- sto stndio possono con ccrtczzn csserc idcntificatc come (( ccllule sntclliti ))

(JIuIR, 1970). La mcnibrana bnsalc ricopre quasi tuttn la supcrficic dclla fibrn trnnne le cstrcmith, clie sono cnrattcrizznte dn prolungamenti pscudo- podiali simili a quelli dci niioblasti e clic sono anch’csse prire di differen- zinzioni citoplnsmnticlie. Dopo In formnzionc dcllc fibre, 6 solo a lircllo di questc rcgioni indiffcrenziate dclla fibra clic ha luogo l’ultcriore assunzionc di miobhsti (FISCIIJIAS, 1070).

Qucsti ultinii aspetti dimostrano clie in vifro, anchc in asscnzn del nervo, il rnuscolo raggiunge stadi di diffcrcnziamcnto analoghi a quelli osscrvabili in vivo. Perb differcnziazioni complesse del sistcma T, sotto forma di tubtili disposti rcgolarmcnte in un sistcnia csngonalc tridimen- sioiiale (a u favo di api u), quali si osscrvano in vivo in condizioiii patolo- giclic, sono prcscnti con una certa frequenza in coltura ncllc fibre pia sviluppate ( E z ~ n ~ r ~ i s c ISIIII;.~JVA, 10G7 ; ISIIII;AWA, 10GS) : pur lion cssendo in rapporto con fenomcni degcncrntivi, qucste differcnzinzioni potrcbbcro dipcndcrc da una crcscitn non bilancintn in assenza dcl ncrvo, e da una stimolnzionc, ad opera di sostanze prcsenti nci tcrrcni di coltura, di fenomcni di alvcolazionc a livcllo dclla membrnnn plnsmnticn, come nrviene nclla pinocitosi.

Gcncrnlmcnte Ic fibrc assumono forms nllungatn prima clie r i si nccumulino miofibrilic :in numero clcrato, il clie non significa clic la disposizionc dcllc miofibrillc non sin in rapporto con la formn dcllc fibrc. A1 contrario, In polarith dci fasci di miofibrillc dipcndc dircttamcnte dnlla nsimmctrin nssinlc dclln fibra c Ic condizioni clie impediscono I’nllunganiento dells fibrn provocano nnche una disposizionc disordinata dcllc miofibrillc (FISCIIJIAX, 1070). In base ni dati di DISCIIOPF c I~OLTZER (IOGS) si pub ritencrc chc anclic i microtubuli contribuiscnno a dctcrminarc la forma dellc fibrc : trnttnndo eon colchicina o con Colcemid, clie dcpolimcrizznno i microtubuli ma clie non linnno cflctti sulk niiofibrille, lc fibre niuscolari in colturn si frnninicntnno c si nrrotondano. In questc condizioni le miofibrillc pcrdono la disposizionc in fasci pnrallcli, diniinuiscono i microtubuli cd aumcntano i u filnmcnti intcrmcdi D clic possono forsc rapprescntnre uno stndio intcrnicdio iiell’or~nnizznzione dci microtubuli.

Blcunc conclusioni d i e rignnrdano la morfologia dcl nuclco c dcgli organuli associati nlln mitosi possono con unn ccrtn trnnquillith csserc estrapolatc dallc osscrvnzioiii ultrastrutturali sul mmcolo in vim, in quanto sono confcrmntc in z)ifro dni clnti citochimici c biochimici. I mioblnsti hanno 1111 grosso nuclco ovalc, con nuclcoli bcn evidcnti e cromatinn diffiisa ; nelle fibre qucsto aspetto, cnrnttcristico dcllc ccllulc nttivc nclla sintcsi di llKAr,

inizialmente non cambia, ma pill avanti i nucleoli diventnno piii compatti, la cromatina si fa pih dcnsa ed i nuclei assumono un tipico aspetto convo- h t o (FRASKE c SCIIISEO, l9G9 ; ?IIARCHOK c \VOIJT, 1969 ; FISCIIJIAS, 1070). h’elle fibre non si osscrvano mai nuclei in mitosi (cf. pag. 410) n6, con tccniche autoradiografichc npplicatc alla microscopia clcttronica, si riesce a mettcre in cvidcnza incorporazionc di prccursori marcati del DNA (MOSS e LEBLOSD, 1970). I mioblasti sono provristi di ccntrioli, spcsso associati a formnzioni cigliari; ma i centrioli scompaiono poco dopo la fusione (PRZYBYLSKI, 1071) forse perch6, cssendo la trascrizione orientata prevalentemente vcrso la sintesi degli stnmpi ncccssari per lc proteinc eontrattili, viene a mancare il rinnovo dci costituenti ccntriolnri.

I dati di microscopia clettronica confermano dunque clic lc fasi pih spccializzate della miogenesi, cioE la sintesi e l’organizzazione dcllc proteine contrattili e la formazione dei caratteristici sistemi di membrane citoplasmatiche, sono specificlic della fibra polinucleata : cssc si realiz- zano mcdiantc una successionc gradualc di eventi, solo dopo la fusione dei mioblasti, c si accompagnano alla cessazionc dell’attivith moltiplicativc~ e di sintcsi del DNA. D’nltra partc il mioblasto i: gi8 una ccllula spccializ- zata in quanto i: capacc di svolgerc almcno una funzionc, il process0 di fusione, tipica ed essenziale per lo sviluppo dcl muscolo. Possiamo dunqiic considcrare il differenziamento muscolarc come un proccsso a tappc in cui sono evidcntcmcntc possibili interferenzc a livclli divcrsi. Dai dati finora esposti apparc clie due fasi dcl diffcrenziamento, la moltiplicazionc dci mioblasti e la sintesi dcllc protcine contrattili, si escludono a vicenda e clic la fusione rapprcsenta il segnalc per il passaggio dn m a fase nll’altra.

111. RtlPPOnTI TRil JlOLTIPLICAiiIOSE E DIFFERENZIAZIOXE

i3 abbastanza ovvio che ncl niomcnto in cui ccssa di nioltiplicarsi una ccllula cntri in uila fase di riorganizzazione dellc attivith metaboliclie : ci si aspetta clie la sintesi delle protcinc e cssenziali )) (quelle nccessarie per la divisione cellularc) vcnga arrcstata o ridotta a livelli minimi di mante- nimento. Tuttavia in molti casi la sintcsi protcica non ricne uniformemcntc ridotta sotto l’aspetto quantitativo, ina subisce modificazioni qualitative importanti, divcntando per esempio prcpondcrantc la sintesi c l’organizznzionc di molecole legate a funzioni cellulari spccializzatc, lc cosiddcttc funzioni a di lusso )). I1 problcma ccntrale della differenziazionc, cioi: il meccanismo grazic nl qualc ccllule dello stcsso organism0 si speeializzano a srolgcre funzioni esclusivc c reciprocamente antagonistc (per esempio sintcsi dcll’cnioglobina o dclla tirosina o della niiosina), trora una prima

cscmplificazionc ncl fenomeno per cui specie molccolari divcrsc (molecole (( essenziali D o 6 di lusso n) possono esscre sintetizzntc da una stessa cellula in momenti dircrsi dclla sun storia. Nello sviluppo muscolare, il passaggio dalla fasc di moltiplicazione dei mioblasti (sintesi di DNA e di proteinc cssenzinli) n11a fase di differenziazione succcssira alla fusione (sintcsi dclk protcine contrattili e formazionc degli nltri sistcmi legnti nlla funzione muscolarc) nc costituisce, dato il mod0 brusco con cui si verifica e data I’esclusionc rcciproca tra lc due fasi, 1111 csempio tipico.

Clic ci sin antagonisnio tra moltiplicazione e differenziazione cellularc L. convinzionc diffusa ma, ad un’analisi attenta, si rivela inrece come una scmplificazione affrettata. Rivedcndo reccntcmente il problema eon riferimcnto a tcssuti diversi dcll’embrionc di pollo, CAMERON e JETER (1971) concludono clie .solo nello sviluppo del muscolo scheletrico ed in quell0 dci neuroni motori questo principio trova un’applicazionc rigorosa.

’Nclla maggior parte dei sistemi studiati (mioblnsti cardiaci, condrociti, ccllulc iniziali del sistema eritropoictico, fibroblasti dcllo stroma della cor- nea, cclltile ddla partc cndocrina ed csocrina dcl pancreas, cpitelio del cristallino, cpatociti) tale antagonismo non i: palcse, anchc sc in alcuni casi (muscolo cardiaco, pancreas, critrociti) la sintesi dellc molecole specifiche si acccntua dopo la ccssazionc dclln sintcsi dcl DNA c della mitosi. In altri sistcmi (pcr es. nella formnzione degli abbozzi delle piume dcll’cpidermidc) la relazione tra Ic due fasi ccllulari non i: chiara. An- che nltri casi, giti considerati comc esempi tipici di unn sintesi di molecole spccifiche solo dopo In ccssazionc dclla moltiplicazionc eellulare (per cs. la produzione di collagene da partc dci fibroblasti sia G vivo che h vitro), sono stnti rivisti di rcccntc senza ehc Ic conclusioni iniziali vcnisscro con- fcrmate (i\Tassm, 1971). & molto probabilc clie il problcma debba csscre rivisto in futuro per il fatto che i caratteri differcnzintil-i scclti sono sog- gcttivi c non sempre rigorosi, cioh riguardano aspetti morfologici o mcta- bolici complessi c non la sintesi di molccolc specifiche. Inoltrc la maggior partc dei sistemi studiati, soprattutto quclli in vivo, sono costituiti da PO-

polazioni ccllulari etcrogcnce cd asincronc mcntrc 6 csscnziale chc lc conclusioni si basino su osscrvazioni riguardanti cellrile singolc o popolazioni sincrone.

Sotto qucsto aspetto, I’antagonismo chc si osscrva nel corso dclla miogencsi in coltura tra moltiplicazione c diffcrenzinzione c pih spccifica- tamcntc tra sintcsi di DXA c sintesi dellc protcinc contrattili, rapprcscnta invccc uno degli cscmpi mcglio documentati. Ncl paragrafo prcccdente abbiamo citato una scrie di dati che diniostrano come dopo la fusione dci mioblasti cessi la sintcsi di DNA e ogni forma di moltiplicazionc nuclenre ;

inoltrc la compnrsa dci miofilamcnti di actina c di miosinn, la loro organizzazione in fasci di miofibrille, la succcssiva complicazione strutturale legata all’instaurarsi dcll’attivith contrattilc, sono carattcristichc esclu- sire dello sviluppo dclla fibra dopo la fusionc. Una corrclazione prccisa tra formazionc delle fibre polinuclcate in coltura e comparsa di cnzimi associati alla funzionc contrnttile C dificilc da dimostrnre in popolnzioni mistc, che anchc dopo la formazione dcllc fibre contengono una quota di cellule mononucleate. Tuttavia i: stato dimostrato con nictodi biocliimici cd istochimici clie il livello delln succinico-dcidrogcnnsi (COOPER e KO- NIGSDERG, lDGl), dclla crcatin-fosfocliinasi (REPORTER et al., 10133 ; SIIAIX- BERG et al., 1 D G 9 , 1071), dclla gliceraldcidc-3-fosfato-dcidrogcnasi (EM- MART et al., 1063), d c h glicogcno-sintetasi (DE La IIaBA et al., 1068), della miocliinasi c dclla glicogcno-fosforilasi (SIiarsnEiiG et al., 1071), & particolarmente clcvnto ncllc fibre ed aumcnta col differcnziamento ; i: minore nellc estrcmitj poco diffcrcnziate dellc fibrc dove ha luogo di prcfcrcnza la fusionc dci mioblasti ; i: molto basso nelle cellulc mononucleate. Sfruttando l’inibizione dclla fusionc ad opcra della BUdR c quelln dclla moltiplicazione ad opera dclla FUdR, COLEJIAN e COLEXAN (1938) hanno ottenuto colturc formnte esclusivamentc da mioblnsti che si moltiplicano, cd altrc comprcndcnti prcvalcntcmente fibre clie si cliffcrcnziano ; I’attivitL dclla creatin-fosfochinnsi, In sintesi e l’accumulo di miosina sono cvidcnti dopo la fusionc dci mioblasti cd aumcntano, nel corso dclIo sviluppo dclla fibra, in manicra differenziale rispctto alle protcine totali. Perb la dificolta di localizzarc con mctodi istochimiei gli cnzimi citati ed il fatto che una certa lor0 rrttivitL, anchc sc molto bassa, E? dimostrabile anclie nclle coltnre con soli mioblasti, non consigliano di fare rifcrimento a quests categoria di molccole come carattcrc distintivo per il diffcrcnziamento muscolaze.

Scmbra dunque che la scelta di una molccola rivclatrice dcl diffc- rcnzianicnto muscolnrc c di sicura identificazione anchc a livello di singole ccllule, dcbba cadcic su una delle proteinc contrnttili, in particolare sulla miosina. Infatti i polisonii di 55-70 unit&, riconosciuti come rcsponsabili dclla sintcsi della subunit& maggiorc dclla miosina (HEYWOOD e NWAGWU, IDGD), possono csscre isolati dalle colturc muscolari solo dopo la fusione dei mioblasti (JIORSE ct al., 1071) cd anclie a1 microscopio elettronico possono

. essere riconosciuti solo nelle fibrc polinuclcate. h c l i e i polisomi spccifici pcr l’actina e per la tropomiosina compaiono in vivo solo in stadi in cui sono prescnti fibrc polinucleate (HEYWOOD e RICII, 1968). La possibilitj di localizzarc a livcllo ccllulare la miosina con anticorpi dluorcspenti e di sagginre contcmporaneamente la sintcsi di DNA con metodi autoradio- gmfici, ha pcrmcsso di stabilire clic in coltura i mioblnsti clie si nioltiplica-

no c chc quindi sintctizzano DNA, non sintetizzano proteine contrattili, da- . to clie non reagiscono ni sieri anti-miosina ; la rcazione i: positiva solo ncllc

fibre, ciob dopo la cessazione della sintesi di DXA (STOCKDALE c IIOLTZER, 1061; OKAZAKI c IIOLTZER, 1965, 1066; COI.EX%S c COLE~IAS, 1068). Anclic con nictodi di cstrazionc c purificazioiie si trora chc la miosina, la mcromiosina e l’actina sono assciiti ncllc ccllulc niononuclcatc e sono presenti solo negli estratti di colturc che contengono fibre (ISHIKAWA et al., 1968). I dati contrastanti clie indicano sintesi di DNA e initosi iicllc fibre in vice (MAC COXNACIIIE et al., 10G.i) dipendono dalla difficolth gib segnalata di distingucrc con sicurczza nclle sezioni di muscolo i i i fofo le cellule mononucleate da quellc fuse c dalla prcsenza, sotto la membrana basale della fibra, di ccllule satelliti clic si sono marcnte con Td+H ma clie non si sono fuse (Moss e LEDLOND, 1070). Una Vera eccczione & rappresentata invecc dalla riprcsa della sintesi di DNA nelle fibre dopo infczione con virus oncogcni, e dalla possibilitj di una sintesi di DNA unietabolico~ dopo la fusioiic dci mioblasti (vcdi $ V1I.A).

Sembra dunque lccito concluderc chc moltiplicazione (siitcsi di DNA) c differenziazioiie (sintcsi di protcinc contrattili) rapprcscntano fasi distinte c rcciprocnmcntc antagonistc della miogenesi in coltura. I1 piincipio pub esscrc estcso allo sviluppo dcl muscolo in viuo, sc si ticne in dcbito conto la maggiorc complcssith dei dati a causa dell’asincronia con cui cessa la moltiplicazione dei mioblasti c si rcalizza la fusione (HERR~IANN et nl., 1070), e la dificolth di ricavarc con nictodi istoimmunologici informazioni precise sulla localizzazione delle cellule provvistc di antigeni nei prcparati in foto o scliiacciati (IIOLTZER et nE., 1057), o nelle sezioni (IPEDA et al., 1968).

Non 6 invccc possibilc sostcncrc che mioblasti moiionucleati non possono diffcrcnziarsi scnza fondcrsi: il fatto chc vi siano ccllulc miogeniche mononucleate prowiste di miofibrille I? stato oggetto di disputa anche in tempi recenti (SIIAFIQ, 1070 ; REZXIK, 1070). QlleStCb possibilitj sembra rimettcre in discussionc Ie conclusioni fin qui raggiunte sui rapporti tra moltiplicazione e differenziazione, ma il problcma pub forse essere risolto esaminando con cura gli esempi segnalati. Non c’& dubbio clie in vivo mioblasti mononuclcati provvisti di niiofibrille e capaci di reagire con anticorpi fluorescenti anti-miosina compaiono in stadi precoci dello sviluppo dei somiti (HOLTZER et al., 1057 ; IKEDA et al., 1008 ; SIIAFIQ, 1070). Analog0 reperto 6 stato segnalato in colture di espianti (J~UI~RAS, 19G5) c di cellulc dissociatc di inuscolo sclieletrico (COLEMAS e COLEMAN, 1068 ; SAGGIORATO et al., 1070 ; Z a ~ u s o -et al., 1070a ; BISC~IOFF e HOLTZER, 1070 ; NAXIEROFF c t HOLTZER, 1000 ; LEVIS et al., 1071a) e in colturc di somiti (STOCKDALE e HOLTZER, 1061 ; OKAZAKI e HOLTZER, 1065, 1066).

k stat0 per6 dimostrato chc, come arvicne pcr le fibre polinucleate, anclie questi mioblasti, q u a d o si differenziano, lianno cessato di sintctizzurc DNA c di moltiplicarsi : in qucsto cnso la cessazionc dclla sintesi dcl DNA non dipendc dalla fusione ma dal fatto che nellc colturc confluenti, cioE in condizioni in cui si verifica il fcnomeno dell’inibizionc da contatto, rcngono a trovarsi mioblasti chc lion hanno potuto fondcrsi o perch6 troppo diluiti rispetto allc altre ccllulc prcscnti (NAJIEROFF e HOLTZER, 1009 ; SACCIORATO et al., 1070 ; Zasuso et at., 1070a ; LEVIS ef d., 1071a), o perch6 inibiti dalla BUdR (COLEJIAS c COLEMAX, l0GS ; BISCIIOFP c HOLTZER, 1070). Per quanto riguarda i mioblasti diffcrenziati dci somiti, va tenuta prcscntc l’inibizionc dellrr moltiplicazionc dcllc’ ccllule miogenichc ad opera di ccllulc ctcrotipiclie osscrvata in coltura (R’AMEROFF e IIOLTZER, 1000), ma die probabilmcntc ha grande importanza nclla rcgolazione della divisionc e dclla differenziazionc cellulare anclic i i i D I ’ U O . Anchc in qucsto case si rcrificano interazioni tra lc superfici ccllulari, maloghe a qucllc clie determinano l’inibizionc da contatto (v. $ V.C.).

Xcppure qucsti dnti contraddicono dunquc il principio dell’esclusionc rcciproca tra sintcsi di DNA c dcllc proteinc contrattili. Questa conclusione si basa per6 s u risultati ottenuti con metodi che hanno limiti di sensibilith ben precisi. Bletodi divcrsi portano a conclusioni diverse per quanto rigunrdn I’inizio deIIa differenziazionc muscolare : lc prime miofibrillc sono ricoiioscibili a1 microscopio ottico prima chc compaia I’atti- v i t j contrattilc, cd i metodi immunologici c la microscopia elcttronica permettono di anticiparc ultcriormentc il momento dclla comparsa dcllc proteinc contrnttili (IIOLTZER et nl., 1057 ; IKEDA et nl., 1968 ; ISIiIKAWA

et al., 190s). Per quanto rigunrda la microscopia elcttronica, si 6 visto che la iniosina e l’actinn sono evidenzinbili solo quando si trovano gih poli- merizzatc in miofilamcnti spessi c sottili c clie persino qucsti sono diflicil- mcnte distinguibili quando si presentano liberi c lion riuiiiti in fasci. Per quanto rignarda i metodi istoimmunologici, E stato calcolato (IIEREMASS et al., 1070) clie un mioblasto pub contenerc fino a 1 x lo5 niolecole di miosinn senza clie qucstc possano esserc identifieate mediantc l’uso di ail- ticorpi fluorcscenti.

I1 fatto cIie i mctodi non pcrnicttnno di localizzarc con precisione il momcnto in cui compare un dato caratterc diffcrenziativo, non pcrmette di trarrc conclusioni sicure sui mecceiiismi di rcgolazioiie dcl differenziamcnto. Per cscmpio la prescnza di qualche ccntinaio o migliaio di mole- colc. di miosina nci mioblasti in moltiplicazione, indiclicrcbbc un meccanismo di regolazione basato s u un controllo quantitativo dci livelli di trascrizionc c / o di trnduzionc dci mcssaggi spccifici, dopo la fusionc. Sc invece

la iniosina fosse del tutto assente fino a1 momento della fusione o comunque dclla ccssazione della sintesi del DNA, come sembrerebbe in base ai dati disponibili, il controllo dovrcbbe . attuarsi mediante modificazioni qualitativc dclla trascrizionc (sintesi di nuovi mcssaggi) o della trascrizione (attivazione di messaggi latenti).

IV. RAPPORT1 TRA CICLO MITOTIC0 E FUSIOSE DEI JIIOBLASTI: LA XI- TOSI $ CRITICA *

La fusione dei mioblasti costituiscc dunque un cvento cruciale nel corso de1,diffcrcnziamento rnuscolarc sia in vivo che in vitro, I n coltura i mioblasti schcletrici presentano a questo proposito una clevata specill- cith die si nianifesta, prima de lh fusione, giii nclla fase di aggregazione (YAFFE e FELDUAN, 1905) : si associano e si foiidono miohlasti schelctrici anclie se di specie animali diverse, mcntre non si osserva fusione con celldc di altri tessuti anclie se della stessa specie. Neppurc i mioblasti cardiaci partecipano alla fusione se non in pcrcentuali molto basse (YAFFE e FEL- DXIAS, 1905 ; PRZYBYLSRI e CIILC~OWSEI, 1970), cd i: interessantc notare clie si tratta di mioblasti clie si differenziano nllo stadio di cellule mononuclcatc. Evidcntemente la specificit& risiede in proprieta dclla membrana plasmatica clic i mioblasti acquistano in un particolare stadio dclln diffcrcnziazione e die sono sotto controllo gcnctico. JIAsLow (1969) ha osserrato clie celltile epatiche, trattate con dosi di actinomicina-D clie inibiscono totalmcnte la sintesi di RNA e riducono a livelli minimi la sintcsi proteica, poste in coltura mista si fondono con mioblasti scheletrici. PoichC i componenti proteici della membrana plasmatica sono soggetti a rapido turnover (WARREX, 1969 ; GERSER et nl., 1970 ; SLAVKIX, 197'1) & possibile chc, in conclizioni in cui questo 6 inibito, non vengano sintetizzati i a scgnali D che normalmente rcndono le ccllule epaticlie rcfrattarie d l a fusionc. Altri fattori, clic pure intcrfcriscono con lc propricth dci mioblasti, proclucono effctti rilevanti sulla. fusione e sulla forninzionc di fibrc ibride in coltura (BI-C~CIII et nl., 1,971).

Ma nonostante sia evidcnte c vciiga sottolineata da tutti l'importanza della membrana plasniatica ncl riconoscimcnto tra ccllule omoti- piche, i clati srille modificazioni clic rciidono possibile la fusione dci mioblasti in fibre sono nssolutamente carenti. i3 stata solo segnalata (FOGEL, 1905) In scomparsa, dopo la fusionc, di un antigcne di superficie prcsente nci mioblasti ; ma si tratta di un antigcne che, pur essendo spccifico per un dato t i p cellularc, compare scmpre quando le ccllule dei tessuti pill

diversi perdono la normalc organizzazione per csserc messe in coltura, e che scompare quando vengono ripristinati i contatti intcrcellulari. La scomparsa di tale antigenc nellc 6brc muscolari mature l! probabilmentc in rapporto non tanto con le proprieth clic inducono la fusione dei mioblasti, quanto col fenomcno per cui la fibra diventa (( satura n, ciol! refrat- taria alla fusione di nuovi mioblasti.

Questa carenza di informazioni sulk modificazioni di mcmbrana a1 momento dclla fusione tt tanto pih grave se si considera chc il process0 non awiene in un momento qualsiasi dcl ciclo mitotico, tra mioblasti a competenti a, ma si verifica in una fase ben, precisa (fase G 1, postmitotica) cd 6 quindi probabilmentc in rapporto lion solo con l’acquisizione di proprietk specifiche per i rnioblasti, ma anclie con qualcuna delle modificazioni ciclichc che la membrana plasmatics prcsenta ncl corso dells mitosi e del successivo pcriodo G 1. Gih i dati istofotometrici citati indi- can0 un identico contenuto in DNA dei nuclei dclla fibra, pari a1 livello postmitotico; ma la prova dccisiva clie la fusione ha luogo esclusivamente in G 1 & stata ottenutn da HOLTZEB, che ha determinato la durata deUe fasi del ciclo mitotico e I’intervallo di tcmpo tra il momento in cui i mioblasti assumono la (fase S) cd il momento in cui compaiono nella fibra i primi nuclei marcati (OKAZAKI e HOLTZER, lOGG ; BISCIIOFF c HOLTZER, 1OGD). Combinando i metodi autoradiografici con il blocco delle cellulc in mitosi mcdiante trattamento con colchicina, si k visto chc i mioblasti non si fondono quando si trovario nellc fasi S, G 2 e 31, ma solo quando hanno completato la mitosi e’si trovano in G 1.

Sulla base di qucsti dati HOLTZER ha formulato una teoria clic ticne conto anclie dell’incompatibilit5 tra sintesi di DNA c delle protcine contrattili e chc si basa sul principio die i mioblasti vcngono deriati dal normale ciclo moltiplicativo in conscgucnza di m a mitosi (( critica B. Pih pre- cisamcnte, second0 una prima formuhione (HOLTZEII, lOGG), 10 sviluppo iniziale del muscolo sarcbbc dovuto nlla moltiplicazionc di cellulc rclativamente indiffcrcnziate (cellulc dclla a‘stcm-line B o mioblasti prcsun- tivi), chc sintetizzano molccolc a essenziali a per I’nccrcscimento c clie vanno incontro ad un numero fisso di mitosi a proliferative R. I1 passaggio nlla fase di diffcrenziazionc, caratterizzato dalla cessazione dclla sintcsi di DXA c di protcine a essenziali a e dalla produzionc di iriolccolc lcgatc alle funzioni (( di lirsso P, vcrrcbbc realizzato mediantc una divisionc a critica )), asinimctrica ( a quanta1 mitosis o), che darcbbc origixic aneora ad un mioblasto prcsuntivo c ad nn mioblasto postmitotico. I mioblasti postmitotici sarebbero dcviati dal normalc ciclo moltiplicatiro c sarcbbero dcstinati a fondcrsi ed n diffcrcnziarsi ; i mioblasti presuntiri assicurcrcb-

bcro il continuo nccrcscimento delln popolazionc cellulare o potrcbbcro cventunlmente cessare di diridcrsi, cfnndo originc n celldc totipotenti, importanti collie riserva per uii nuovo ciclo differcnziativo (ccllrilc satelliti). 11 cnrattcrc nsimnictrico, critico della divisioiic coiisistcrcbbe in uiia i i- pnrtizionc disegunle dci fnttori chc controllnno I’csprcssionc genctica (cioe che determinano i mcssnggi clie possono esserc trascritti e tradotti) o nddi- rittura in una duplicazionc clisegunlc del DNA nelln fase di sintesi chc preccdc la divisione. Lo schema E stato poi niodificato (HOLTZER ct d., 19G8 ; BISCIIOFF c HOLTZER, 1970) pcrclii: E risultnto cvidentc clie l’esprcssione fenotipicrr dcl differcnzinmcnto iiiriscolnrc in coltura I? regolata da fnttori clie possoiio anticipare o ritardarc In fusionc, c clic il niimero di niioblasti cnpaci di continunre (L moltiplicnrsi diliiiriuisce progrcssiwmcnte sia in vivo che in vifro. Ln mitosi a critica v insorgcrcbbe pcrcii, 11011 dopo u n numcro fisso di divisioni moltiplicatire, bend in rapport0 nllc condizioni ambieiitnli ; inoltrc la clivisione sarcbbc a critica v ma non disegunle, dato clie cntrambi i niioblasti postniitotici sono cnpaci di diffcrcnziarsi.

’ a coimnque sottolincnto il fatto clic, sccoiido IIOLTZEII, i niioblasti vengono devirrti dal normnle ciclo moltiplicntivo in conscguciiza di un evento critico chc si rerifica clurnntc la mitosi e quindi prima dclla ftisione. A sostcgno di qucsta ipotesi viciie citato il fatto clic, nicntre nei mioblasti clic coiitiiiuaiio a irioltiplicarsi la fase postmitoticn durn f! ore, dopotliclii. si ha un nuoso pcriodo di sintesi di DNA, nei mioblasti clestinnti a forninre le fibrc In fusionc ha liiogo come riiiriirno 5 orc dopo In finc della mitosi. Poich6 In dissoluzionc dclln mcmbrann non ricliicclc pih tli un’ora, rcstc- rebbcro nlmcno 4 orc durante le qunli il niioblnsto I? coniunquc dcvinto (la1 ciclo nioltiplicativo. Anclic il fatto che in ccrtc condizioni possono difkrcnziarsi mioblasti rnoiioiiuclcati vicne citato a confernla clie la dc- riazionc dnl ciclo c I’induzionc alla diffcrcnziazionc prccedono la fiisionc c lion nc sono In conscgucnza. X a in qucsto niodo ricne scartata a priori, e senza seric giustificazioni spcrimentnli, I’ipotcsi clic In comparsa dcllc protcinc contrattili sia inrccc conseguenza dclln ccssnxioiic dclla dupli- cazioiie dcl DNA e dellc riiodificazioiii clie scguino la fusionc, oppurc (1i fenomeni nnnloglii chc si vcrificano, in condizioni particolari, nnclic iici niioblnsti mononiiclenti in seguito nd inibizione dn contntto. Quanto nl- I’intcrvnllo tra la fine della divisioiic cellulnrc c In fiisione, & indubbio chc solo nella fasc postmitotica i niioblasti ncquistnno proprieth ndattc n foiidersi c clic In dissoluzionc dcllc nicnibrnne ricliiedc un tcinpo rclnti-

. vnnientc brcvc ; ma 6 niolto probabilc clic i proccssi clic rciidorio possibilc la fusione sinno coniplicnti e vcngano inizinti gih iicl inonicnto in cui le cellule postmitoticlie prcndoiio contntto, con conscguentc intcrruzioiic

iinnicdintn dcl iioriiinlc ciclo di despirdizznzionc dci cromosomi c di duplicazionc dcl DXA.

Disognn nnclic dirc clic In distinzionc in mioblnsti prcsuntiri, mioblnsti postmitotici, ccllulc di riservn delln e stem-linc 8, cellule satelliti, etc., non trovn nlcunn giustificnzionc nei dnti ultmstriitturnli c biochimici (JIuIR, 1070 ; FIscmrAs, 1070). Tnoltrc I‘ipotcsi di HOLTZER rcnde estrc- mnnicntc complcssi gli schcmi per I’nutorcgolnzionc del niuscolo nclln differcnziazione c nclln rigcncrazione. Per cs., la progressivn diniinuzionc dci rnioblasti in vivo c in coltura dipendcrcbbc dnl prevalcrc dellc niitosi B criticlic a SII quellc a proliferative D, in scguito a stiiiioli clic partircbbero dnlle fibre ncoformntc (BISCIIOFF c ITOLTZEI~, 1970) ; In possibilith di otteiicrc in colturn lincc stnbili di mioblnsti clic si nioltiplicnno indefinititsnicntc c che si diflercnzinno in qunlsinsi moniciito purchC lawinti foiidcrc, vicne spicgstn amnicttcndo clic, clopo u ~ i n initosi a critica o, u m scric di clivi- sioni e prolifcrntivc B possano dctcrrriinirc un nuriiento dcl numcro di mioblnsti cnpwi di diflerciizinrsi (HOLTZER et nl., 10G8) ; In formazionc, a pnrtirc d s unn coniunc ccllula progcnitricc, di mioblasti chc si fondono c rli ccllulc sntclliti, c la possibilitb clic qucstc itltime riprcndano a dirirlcrsi pcr ripristinnrc, conic sc fosscro nuovc ccllulc progenitrici, In situnzionc pre- cedcntc in modo da permettcrc un nuovo ciclo. diffcrcnzintivo, vicnc in- terprctata con riiodelli in ctii si sncccdono divisioni a criticlic o c a prolifcrntivc o, sinimctrichc c discgunli, con possibilith praticamcntc infinite d i vnrinnti (CIIURCI!, 1070) ; ogiii intcrferelizn con In miogcncsi, pcr cscmpio l’azionc dclln BUdR clic rciiclc nncora possibilc In moltiplicnzione dci mioblnsti m a nc impcdiscc In dirt’crcnziazionc, vienc spicgntn ricorrendo nd iin’nzionc spccificn sulln mitosi e criticn o (BrscIro& c IIOLTZER, 1070).

11 tentntiro di gencrnlizznrc In teorin dclln initosi e criticn o nd nltri sistcnii ccllulnri, pcr cs. ni mioblnsti cartlinci in ciii nio!tiplicnzionc c diflc- renziazionc n o ~ i sono fcnorneni iicccssarinnicntc antngonisti, porta ad nf- feriiinrc clic u lc diffcrcnzc trn ccllulc muscolnri cardinclie e scliclctriclic costituiscono vnrinzioni niinori cli uno stcsso tcma fondamcntnle o (Ism- KAWA el nl., 10G8). Con qiirstn concliisionc non sono ovvinnientc cl’nccordo WEISSTEIS c HAY (1970) clie in un lavoro ivccntc hnnno ribadito lc dif- fcrciizc trn i diic sistenii iiiuscolari cd linnno nnzi concliiso nn‘mnaiido clic e L. giunto il mornento cli sottoporrc ncl annlisi critica 1s tcorin dclln niitosi qurtntnlc rrpplicntn nl dificrcnzinmcnto miiscolnrc D !

Al di lh di inutili polcmiche ci sciiibrn clic un mod0 scrio pcr nn’rontnrc i l problcnia consista ncll’csaminnrc i fnttori chc intcrfcriscono sd ln inoltiplicnzionc c sulla fusionc dci mioblnsti e sulln succcssivn ciif- fercnzinzionc dclle fibrc, lie1 tcntntivo di individnnre i proccssi e critici 9

cllc deterininnno il pnssnggio da una fnse alla siicccssivn, c di chinrire i nieccanismi che regolnno l'rspressione fenotipicn c In stnbilith clello stat0 diffcrcnzinto nel muscolo.

1'. ISTEIII'ERESZE SULLh AIIOGESESI

Ncl prendcre in esamc lc nltcrnzioni dcl difl'crcnzinmcnto niiiscolnrc in colturn h opportuno distingucrc divcrsi fattori n sccondn delln loro na- turn e clelln fnsc specifica dclln miogenesi durnntc In qunle si verifica I'in- terfercnzn.

A. Iiitcrfercizze sttlla ~iinfurnzioiic c1t.i tnioblasfi

YAFFE hn dimostrato rcccntcmeiite che i mioblasti, per potersi fon- derc in coltura, dcbbono suhirc specificlie modificnzioni. Infatti inibitori delln sintesi proteicn impcdiscono In fusionc cclliilnre e l'nccumulo di cn- zinii tipici dcl diffcrenzianiento muscolnrc ; se invece vicne inibitn In sintesi d i RNA poco prima delln fusione, i niioblnsti si foiidono egunlniente c si osservn anclic un inizinle auniento dell'nttivith cnzimnticn. I mioblrrsti vanno dunque incontro ad un processo di diflerenzicrzione durante il quale vengono sintctizzatc mncroniolecolc spccificlie, necessnrie per le niodifi- cnzioni strutturnli e biochiniichc legate n1la fiuione (SIIAISIIERG ct al., 1071). 1) stato anche osscrvnto (I'AFFE, 1071) clic qircsti cnmbiamcnti inizinno a partirc dal momento in cui le cellulc vcngono niessc in colturn e non dipendono d d h u mnturrzionc b preccdcntementc raggiuntn in vivo ; inoltre pcrcli6 questi cambiamcnti si vcrificliino in vifro, E necessario un pcriodo di tempo rclntivnmcnte costante. BIcscolnndo coltiirc nllcstitc in teinpi dirersi, si osserrn clic i mioblasti lianno proprictii individuali detcrmi~iate dnl pcriodo trnscorso i l l vifro : infatti si fondoiio solo quclli clic liniino gih coiiiplctnto il pcriodo di maturnzione. Se ncl tcrrcno di colturn la con- ccntrnzione di ioni c.~z+ i: bassn, lion si 11n fusione ; qualido i inioblasti vengono trasfcriti in tcrrcno normalc, si fondono cntro un intcrvnllo molto pih breve di quello riorrnnlnicnte necessario per In ninturnzionc. Significn cIie nncIie in assenza di Ca'+ si vcrificnno norninlnlente quei cninbin- xiienti clie rcndono possibile la fiisione, ma clic il processo specifico di stn- bilizznzione dci contntti ccllulari, di dissoluzionc clclle rncnihrnne, cte., dipcnde dnlln prcscnzn di Cn'f (SIIAINBERG ct nl., 1DGD). Viccvcrsn, 1110-

dificando il tipo di. sicro c In concentrnzione di cstratto cmbrionnlc nel terreno di colturn, si pub irnpcdirc specificntnnicntc e reversibiliiicnte la mnturnzione dci mioblnsti ; pcr talc proccsso la silitcsi tli DKII, piii che la

moltiplicazionc cellulare, sembra costitiiire un requisito cssenziale ( YAFFE, 1071).

Anche seeondo nltri Autori (COLEMAN e COLEJIAS, 10G8 ; BISCIIOFF e HOLTZER, 1970) 6 indispcnsabile che i mioblasti compiano in coltura almcno un ciclo moltiplicativo (con sintcsi di DR’A) pcr potersi fondcrc. JIa non vi B accord0 gcncrale su questo punto : per cs. BISCIIOFF e HOLTZER (19GO), incubando le colturc con Td+H fin dal niomcnto della semina, trovano circa il 25% di nuclei non marcati nelle prime fibre formate, c ritengono chc il fenomeno dipenda dalla presenza di mioblasti chc lianno gih completato i i t vivo il ciclo di prcparazione alla fusione, c che si fondono in coltura senza dovcr subire una ulteriorc maturazione.

Si pub tentare di intcrprctare qucsti dati contrastanti e contem- poraneamente di cliiarire il significato dcl period0 di maturazione clci mioblasti in coltura. I?, dimostrato (NASLOW, 1070 ; POSTE, 1071) che gli enzimi protcolitici usati per dissociare i tcssuti e per prcparare le colture vcngono ndsorbiti sulla supcrficie cellulare e vi restano attivi almeno per 24 ore. Oltre a provocarc danni durantc la dissociazione, che si manifestano con alterazioni strutturali c con variazioni della mobilitfi elcttroforetica delle ccllule, gli cnzimi inibiscono la stabilizzazione in coltura della matricc intcrccllularc. Le cellule non riescono pcr un certo tempo a ristabilire uno superficie normale per quanto riguarda struttura, composizione chiniica e carica clettrica, c ne risulta quindi altcrata l’adesione a1 substrato, Pin- terazionc rcciproca, l’inizio dclla moltiplicazione, etc. I1 siero inattiva gli enzimi ndsorbiti e favoriscc il ripristino dell’integritj della superficie cellularc : vi 6 un rapport0 diretto tra I’attivith antiproteasics di un dato siero e la sua capacit2L di stimolare l’adesione e la moltiplicazione delle celliile in coltura. I mioblasti ottenuti dissociando il muscolo con tripsina e utilizzati per allcstire le colture, presentano modificazioni della superficie cellulnre c alterazioni intracellulari chc comportano variazioni delln concentrazione e dclla morfologia dci microtubuli (Fiscn?rrAs, 1970) e diminuzione dcl contcnuto in RNA (Zasuso et al., 1070b) dovuta a perdita di ribosomi (IIOSICK c STROIIJIAS, 1071). Le condizioni iniziali vengono gradualmentc ristabilitc e solo allora si rcrifica In fusione (Zaxuso et al., 1070b ; LEVIS et at., 107la).

3Iniicano dati pih precisi sulle modificazioni dei mioblasti nclle prime fasi in coltura, mcntrc sarcbbc importante stabilire se la fusione dipende da particolari diffcrcnziazioni ultrastrutturali c / o dall’acquisizionc di pro- prietfi spccificlic di supcrficie. Per es. 6 noto che i mioblasti dci somiti possiedono, come molte nltre cellule embrionali, proccssi cigliari che si possono osscrvare per un certo tempo anclic nclle fibre neoformate (PRZY-

DYLSKI, 1971) ; in coltura i mioblasti sclieletrici sono molto mobili c I’inibizionc del moviniento impcdisce anclie la fusione (NANEROFF e HOLTZER, 1969). L’ipotesi di una .rclazionc tra prescnza di ciglia e differenziazionc b stnta ax-anzata per i mioblasti cardiaci (RASH et nl., 1969) c vale la pena di notarc che cellulc embrionali di riccio di mare dissociate. perdono lc ca- rattc~istiche ciglia e che vi B un rapporto precis0 tra ringgregazione ceIIu- lare e ricostituzione delle ciglia (AJrmrIYa, 1971). fi forse prcmaturo ipo- tizzare clic la moltiplicazione dei mioblasti in coltura sia collcgata con la necessith di ripamre, attraverso la duplicazionc dci ccntrioli e la lor0 tra- sforninzionc in corpuscoli basali, la pcrdita dclle ciglia provocata dnlla dissociazione iniziale del tessuto c clic la differenziazione dclle ciglia sia uno degli evcnti chc permettono l&fusionc. Ma non vi P dubbio clic il ciclo di sintcsi di DNA a1 qualc i mioblasti sono costletti prima della fusione i5 richiesto non tanto (0 non soltanto) pcr I’aumeiito del numero dcIIe cel- Me, quanto per riplistinarc, mediantc la trnsmissione delle informazioni genetichc specificlie per lc varie h s i del ciclo mitotico, I’integritit strutturalc e funzionalc della cellula.

I,e condizioni ambientali realizzate per ottcnere i mioblasti variano notcvolmcnte, c di conseguenza variano lc altcrazioni subite dalle cellule : per cs. il muscolo di ratto nconato vienc sottoposto a trattamenti prolun- gati con tripsina ed a concentrazioni rclativamente clcvate dell’enzima, cd in questo caso i mioblasti sono obbligati ad una maturazione in coltura, con almeno un ciclo di sintesi di DNA (YAFFE, 1971 ; LEVIS et al., 1071a). I1 muscolo di embrione di pol10 pub essere dissociato invccc mcdiantc un trattamento molto pih blando sicch6 parte dei mioblasti rccupcra in breve tempo Ia.sun intcgrita funzionalc, senza dover passarc in coltura zrttravcrso un ciclo di sintcsi di DNA (BISCIIOFF e IIOLTZEB, l O G 9 ; PICCINKI et al., 1070). Ma anclie i mioblasti di ratto possono fondcrsi senzn sintetizzarc DNA purch6 provengano da una coltura clie ha giit complctato il pcriodo di maturazione, e clie pub essere dissociata con un trattamcnto breve e a basse concentrazioni di tripsina (LEVIS et al., 1971a).

Scmplificando, Ic modificazioni clic riguardano il periodo di differen- zinzionc clie precede la fusionc dci mioblasti in coltura c che dipendono dal tipo di mioblasti usati, dal grado di differcnziazionc raggiunto dal muscolo GI vivo, ddle condizioni di coltura, etc., possono essere riferite ad in- terfcrcnze sulla ricostituzione dcll’integritii celIularc, in particolarc della membrana plnsmstica e dcllc proprieth di superficic, e sull’acquisizione di differcnziazioni specificlie chc sono in rapporto con la fusionc. La fusionc sarcbbe dunque strettamcnte dipcndcntc dalla maturazionc dei mioblasti e quindi dalla loro moltiplicazione ; tuttavia gli eflctti dcl Ca*+ e dci sieri

sulln miogenesi suggeriscono che in certi cnsi 6 possibile una dissocinzionc tra moltiplicnzione e fusionc.

B. Dissociazione trn niolliplicazione e fitsione Unn dissocinzione dclln moltiplicazione dci mioblnsti dnlla fusionc

k s h t n ottenutn dn Cos e SI~IPSON (1970) in colture di niuscolo delln coda di lucertola mantenute in un terrcno in cui unn pnrtc delle cellulc continuano a moltiplicarsi senza fondersi, nientre In nmggior parte vengono bloccate ncl pcriodo postniitotico. I n questo terrcno non-si hn dunque formazionc di fibre nnclic sc niolti riiioblasti si trovano proprio nclla fase in cui dovrebbero fondersi. Trasferite in un tcrrcno adatto, le cellule che crnno bloccate in G 1 si fondon0 c formano fibre di nspctto normale. Si possono mantenere n lungo lc ccllulc nel terreno clie non consentc la fusione ed effettunre ripetute subcolturc : i niioblasti compiono cosl nnchc pih di 180 cicli moltiplicativi senza pcrdcrc la capacith di esprinierc i l cnrattcrc Intcnte, cioi: possono forniare fibre in qualsinsi nioniento purclib trnsferiti nel tcrrcno adatto (Cos, 1908). La stessn conclusione si ricnva dai dnti gih citnti di SIIAINBERO et al. (19GD) : diminuendo il Caz+ nel tcrrcno di coltura i mioblasti continuano a nioltiplicarsi senza fondersi. L’effetto dipcnde dnl fatto che normnlmente il Cazf intcrngisce con i gruppi carichi delln mcmbrann, facilitando il contatto intercellulnre e quindi la fusione. Anclie in questo cnso i mioblnsti possono dividersi molte volte senzn fondcrsi, ma conser- van0 In capncith di diffcrenzinrsi nllorchd In concentrazione di Cnzf viene riportntn nl livello normale.,

Sono questi. gli escmpi di interfercnzc sulla fusione pih semplici dn interpretme ; nclh ninggior p a r k dei cnsi (RESSEGUIE, 1901 ; OKAZAKI e HOLTZER, 1905) lc nlternzioni della niiogencsi sono in rnpporto con fnttori complcssi prcsenti nel terreno di colturn (sicro, cstrntto embrionnlc). M n si riticne clie‘ onclie questi fattori ngiscnno n livello delln membrann plnsmatica grnzic nl loro contcnuto in ormoni, prcvcnindo gli effetti citolitici dovuti a1 turnover dei lisosomi (CAIIN, lDGS), o modificnndo la pernieabilith e quindi la concentrazione di spccifici metaboliti che regolano I’espressione dci gcni rcsponsabili del differenzinmcnto (LASH, 1968).

11 fatto clic la dissocinzionc t r i moltiplicnzioiie e fusione sin lever- sibile diniostra anclie che In capocith di differenzinrsi in u ~ i particolare tip0 cellulare pub essere trnsnicssn per diverse generazioni, aiiche sc resta inesprrssa. Diversi dati sperinientnli indicano clie fnttori nnibicntali possono impedirc l’cspressione completa dcllo stato diffcrenziato, pur csscndo ancora possibile In sintcsi in piceolc quantith di prodotti specifici, e si parla in questi casi tli a modulnzione o dell’cspressionc fenotipica (CAIIN,

1068 ; LAsIr, 1968 ; LASHER, 1071). Nel caso dci mioblasti, la possibilith di una u modulazione s della differenziazionc non pui, per ora essere vcri- ficata : dato iI carattere scelto per definire il differenziamento (comparsa delle proteine contrattili) e visti i limiti di sensibilith dei mctodi attual- mente ciisponihili, il mioblasto deve essere considerato in ogni caso comc una cellula 4 indiffcrenziata s.

Invece il principio della stabilith. della determinazione genetica trova proprio ncl differenziamento dci mioblasti scheletrici in coltura una di- mostrazione molto evidente. Sfruttando le diverse propricth di adesionc dei mioblasti e dei fibroblasti a1 support0 della coltura, YAFFE (1968) ha ottenuto popolazioni pure di mioblasti ed ha dimostrato che si possano mantenere indefinitamente colture potenzialmente capaci di fondersi e di diffcrenziarsi, purchC i mioblasti vengano subcoltivati prima dclla fusione. Sei ~ l i n e e s stabili di mioblasti sono state mantenutc in nitro per periodi variabili da 7 a 18 mesi, con un tempo di gcnerazione cellulare di circa 24 ore, scnza alterazioni del numero di cromosomi nC acquisizione di caratteri neoplastici. Durantc tutto questo period0 i mioblasti hanno conservato la capacith di fondersi e di formare fibre con caratte- ristiche normali (RIC~LER e YAFFE, 1070). Diversi caratteri dei mioblasti possono essere individuati in condizioni di coltura clonale, ciob seminando le cellule a bassa densith. in mod0 che ciascuna dia origine ad una colonia morfologicamente distinguibile : l’eficicnza di piastramento, la percentuale di colonic in cui si formano fibre, la morfologia delle colonie e quell? delle fibre, il momento in cui i mioblasti cominciano a fondersi, ctc., sono caratteri propri di ogni linea e presentano un’clevata stabilith. Le variazioni all‘interno dclla stessa linea dipendono da modificazioni non con- trollahili delle condizioni di coltura (stocks diversi di sieri e di terreni).

La possibilith di ottenere linec stabili c pure di mioblasti e di utiliz- zare i metodi di coltura clonale pcr riconoscere aspctti spccifici ed ercdi- tabili del differenziamento, aprc la via ad un tentativo di analisi delle basi genetiche delle varie tappe della miogencsi. Pcr ora si pub solo dire clie le cellule muscolari in coltura sono caratterizzate da una elcvata stabilits per quanto riguarda la dctcrminazione del carattere differcnziativo, c vi- cevcrsa da una estrema labilith nell’espressionc di questo carattcrc.

C . Ijiterfereizzc doviite. n ikllule eterotipiclie

Lc colture di muscolo schelctrico, fatta eccezione pcr le lincc stabili di niioblclsti di cui si i? appena parlato, comprendono sempre sia mioblasti che fibroblasti ; pcrcii, ogni approccio biochimico o anclie . citologico che non tenga conto delle differcnze tra i duc tipi cellulari e delle loro possi-

bili iiiterfcrciize, pub portare a conclusioni grossolanamente crratc. Lo studio delia miogcncsi con metodi di coltura clonale presents due importanti vantaggi rispetto alle colturc massive ecl agli studi in vivo: a) per- mette la separazione dci diversi tipi cellulari e rende percib possibili analisi biochimichc su di un sistcma omogeneo ; 3) permettc di determinare fino a clic punto i diversi tipi cellulari sono intcrdipendenti per la loro differenziazione.

11 prohlema & stat0 affrontato dn KONIGSnERG (1961, 10G3) il qude ha dimostrato chc la differenziazione del niuscolo dipende da un’intera- zioiie tra fibroblasti e mioblasti mediata da un prodotto specific0 dei fibroblasti, il collagene. Gli effetti sulla fusionc dei mioblasti e sulla differenziazione piovocati dall’uso di terreno (( condizionato D, cioi. di terreno pre- cedentemente utilizzato per colture massive di cellulc miogeniche (KO- NIGSBERG e HAUSCIIRA, 1066), dipcndono infatti dalln prcsenza di collagene ncl tcrreno condizionato. Gli stcssi effetti si ottcngono anchc estraendo e purificando direttamcnte il collagcne dai tendini della coda di ratto c spalmandolo sul support0 dclle colture (ILuscrrKa e I<oxmsnERG, 10GG). L’efficienza di piastramento, cio; il numero di colonie chc si svilnppano a partirc dn un dato inoculo cellulare, i. la stessa nelle colture normali cd in quelle condizionatc, ma in quest’ultimo cnso & molto maggiore il numcro di colonic riconoscibili come ~muscolari )) per la prcsenza di fibre striate contrattili. Le stesse cellule che in condizioni normali formano colonic di nspetto fibroblastico, subcoltirate su supporti condizionati, si fondono e formano fibre muscolari (HAuscIrIiA, 19G8). Percib le differenze . tra mioblnsti e fibroblasti corrispondono in gran parte a modificazioni di uno stcsso tipo ccllulare in coltura, ed i. impossibilc identificare lc cellule miogcniche in base a criteri morfologici, prima chc questc abbiano esprcsso un carattcre differenzintivo sicuro (fusionc, prcsenza di miofibrille). I1 comportamento dei mioblasti nelle colture clonali normali e condizionate 6 indicc anch’csso di un’elcvata stabilitj genetica dci caratteri differenz’ia- tiri e di un’estrcma Iabilitj dell’espressione fenotipica.

I risultati di Koxrcsnmm costituiscono anche l’esempio pih evidente della possibilitii di identificare fattori specifici prcseiiti nei terreni a eon- dizionati D, chc vengono usati per favorirc la moltiplicazione di diversi tipi ccllulnri in coltura. IIAUSCIIKA (1968) ha osscrvato che il colhgene prescnta un certo grado di specificit&: altrc protcinc come la sicroalbumina c la fibrina non stimolano la fusionc dei mioblnsti. Invece non c’i: specificith n6 di tessuto nC di specie aniniale pcr quanto riguarda I’origine del collagcnc. Non hanno cffetto i prodotti di idrolisi acid8 dcl collagene nb i peptidi liberati dalla collagenasi, quindi non si tratta di un cffctto a live110 di

rnctabolismo nutritivo ; k invece eflicace la gelatina (collagene denaturato) e cii, dimostra clie non 6 indispcnsabilc chc venga conservata la struttura periodica delle fibrille. I1 collagene accelera l’adesione dei mioblasti a1 substrato ed cscrcita poi un effetto specific0 sulla fusione. I1 meccanismo molecolare dcll’interazione mioblasto-collngene e le basi degli cffetti sulla fusione non sono noti, ma & probabilc che dipendano da una modificazione delle cariche elettrostatichc alla superficie del supporto della coltnra. f?, noto infatti che i contatti intcrccllulari c l’adesione delle cellule a1 supporto dipendono dalla distribuzione dei gruppi carichi sullc superfici e sono influcnzati da fattori che modificano lc intcrazioni elettrostatiche : per es. l’adesione degli eritrociti & favorita da un fattore tcrmo-labile presente nel siero, che B stato identificato col monomcro della fibrina prodotto durantc la coagulazione (GEORGE et al., 1071).

2 dificile stabilire fino a che punto il collagene & importante anche ncl differenziamento muscolarc in vivo : trattandosi di un prodotto cxtra- cellulare ~ S S O pub scnz’altro influire sulle interazioni basate su modificazioni di membrann (SLAVKIN, 1071). Un esempio si ha nclle cosiddette aindu- zioni epitelio-mesenchimali u tra divcrsi cpiteli primordiali cd i connettivi sottostanti, che hanno la caratteristica comune di produrre collagene. Cosl Is differcnziazione dcll’epitelio pancreatic0 nclla parte esocrina della ghian- dola richiede la presenza dcl mcscnchima sottostante, ma il diflcrenzia- mento avvicnc anchc sc i due tcssuti sono scparati da un sottilc filtro (KALLJIAN e GROBSTEIN, 1965). La prcscnza del mesenchima B necessaria solo nellc prime 48 ore ed in qucsto periodo le ccllule mcscnehimali pro- ducono fibrille di collngcne chc diffondono attravcrso il filtro e si accu- mulano tra le cellule epiteliali. Analoganicntc, nclle colture di cellule muscolari la presenza del collagcnc 6 ncccssaria nella fase di adcsionc, di moltiplicazionc c di fusionc dci mioblasti, ma non i: indispcnsabile pcr lo sviluppo delle fibre (HAUSCIIKA, 1068). L’andamento a bifasico u delle colture, cioE il passaggio da un periodo di maturazionc e moltiplicazionc dei mioblasti ad un pcriodo di differcnziazione, pu6 dipendere dalla produzione c dall’accumulo di collagcne da parte dei fibroblasti c dalla funziok determinante chc qucsto esercita sulla fusione, a partirc dal momcnto in cui i niioblasti hmno costituito (0 ricostituito) iina superficic ndatta:

Un effetto opposto sulla fusione 6 provocato da diversi tipi cellulari: SIIIAIADA (1968) per primo ha osservato ehe il morimento dei mioblasti in coltura, cssenziale per lo stabilirsi dci contatti interccllnlari e quindi per la fusione, viene inibito dallo presenza di cellule eterotipiche omo- o ctcro-specifiche. NAXEROFF e IIOLTZER (1069) hanno dimostrato chc il morimento e la moltiplicazionc sono inibiti sc i mioblasti vengono

seminati su substrati formati da tappcti confluenti di conclrociti o di cellule cpatiche, che hanno cessato di dividersi in seguito ad inibizionc da contatto. La miogencsi pub invece verificarsi se i mioblasti rcngono me- scolasti e scminati contcmporaneamente alle cellule cterotipiche, purch6 qucste non siano in proporzioni troppo elevate. Se sui substrati confluenti vengono seminati mioblasti chc lisnno gia compiuto alcuni cicli moltiplicativi in coltura c chc hanno quindi completato il pcriodo di maturazionc, la fusionc avviene egualmentc. Evidentemente i substrati di cellulc ctc- rotipichc inibiscono il movimento, la moltiplicazionc c quindi la maturazione dei mioblasti, ma non ne impediscono neccssariamentc la fusione. L’inibizione lion dipende da prodotti diffusibili ma richiede un contatto vero e proprio tra celIuIa e ceIIuIa ; usando substrati cellulari uccisi con liquidi fissativi, si dimostra chc I’inibizione non dipcnde dalla prescnza di ccllde vivc, bend dalla matrice intercellulare. Questa contienc mucopolisaccaridi ma anchc collagenc (SLAVKIN, 1071) ed & interessante notarc chc una analoga inibizione della miogcncsi i: stata notata in tutti quci casi in cui il rapporto fibroblasti/mioblasti risulta eccessivamcntc altcrato a favorc dci primi, o per le condizioni di coltura (ZANUSO et al., 1970s) o per il tipo di muscolo utilizzato (SAGGIORATO et al., 1970; D’APRILE et nl., 1071).

Si pui, dunque formulare l’ipotesi clie prodotti divcrsi dell’attivitj ccllulare, primo tra questi il collagenc, svolgano un ruolo cssenzialc di controllo e di rcgolazionc del differcnziamento muscolarc, stimolando o inibendo la moltiplicazione e la fusione dei mioblasti.

Altre interfcrcnzc si verificano nornialmente in diverse fnsi dcl cliffe- rcnziamento c contribuiscono a rcndcre il muscolo un sistema dotato di elevata capaciti di autorcgolazionc. Si i: gi5 accc‘nnato a1 fatto chc lc fibre prescntano un fenomcno di a saturazionc $ in rapporto a modificazioni dcllc propricth di mcmbrana (scomparsa di un antigene di superficic, formazione della mcmbrana hasale). Cib determina un carattcristico accre- scimcnto cca scalini )) del muscolo in quanto, dopo la formazione dclle prime fibre c la loro (( saturazione D, i mioblasti residui danno origiiic ad una scconda generazionc di fibre che si sviluppano sfasate rispetto alle prime, c cod via. I1 -fenomen0 6 particolarmcnte evidente nclla rigenerazione itz vivo (REZSIK, 1970) e contribuisce a regolarc l’accrcscimcnto dellc fibre ed i loro rnpporti reciproci ; in coltura le fibre si formnno in manicra tumultuosa c la membrana basalc compare abbastanza tardi ( ISIIIKAWA, 1970)’ per cui Ie fibre si anastomizzano c formano intrecci complicati che non si osscrrano mai in vivo. Ncllc fasi pi^ avanzatc della miogenesi, i miobiasti clic non si sono fusi e che sono localizzati o estcrnamente alle

fibre o sotto In mcmbrana basale (ccllule satelliti), ccssano di moltiplicarsi per unn inibizionc da contatto dovuta ad interazioni con i fibroblnsti o con le stcsse fibre. In questc condizioni cssi costituiscono una o riserva f i

clie viene uti~izzata per un nuovo ciclo rnoltipliiativo e differenzintivo, quando i rapporti intercellulari vcngono alterati (rigcncrazione in vivo ; tripsinizzazionc dellc fibrc per I’allestimento di subcolturc), scnza che sinno ncccssari pnrticolnri processi di sdiffcrenziazionc come si verifica invece nclln o riattirazionc u dci nuclei dellc fibre (v.. V.F).

D. Effetti della BUdR sulla miogenesi La BUdR inibisce il clifferenziamento dei mioblnsti mentrc non ha

npparentcmentc alcun cffetto sullc fibre gi9 formate. Qucsto analog0 d o - genato dclla Tdr ricne incorporato nel DNA dci mioblasti, com’t: dimo- Strat0 dall’aumcnto di peso molccolare del DhTA (STOCIiDALE el d., 19G4), cialla marcatura dci nuclei dopo trattamcnto con BUdR-311 (CoLEJrAN et nl., l0GO ; BISCHOFF c HOLTZER, 1070), dnll’effetto antagonista cserci- tnto dnlln Tdr (COLEMAN et al., 19’70). L’effctto 6 rcversibilc : se i mioblasti chc hanno incorporato BUdR e che continuano a moltiplicarsi senza fondcrsi vengono trasferiti in tcrrcno frcsco, dopo alcuni cicli moltiplicntivi sono in grado di forniarc fibrc muscolari di aspctto normalc. Eyidentemente la BUdR inibiscc I’esprcssione ma non altcrn In stabilith dei caratteri diffcrcnziativi. fi sullicientc I’incorporazionc (( unifilnrc D dclln BUdR nel DNA (cioL. per un unico ciclo di sintesi), perch6 sia inibita la fusionc ; d‘altrzr partc i mioblnsti possono continuare n moltiplicnrsi in prescnzn di BUdR anchc per periodi molto proltingati (25 gg) e conscrvnno ancorn In cnpn- cit& di diffcrcnzinrsi clop0 csscrc stati trasfcriti in tcrrcno nornialc. L’efTctto dclla BUtlIi. non clipcnde dalln sun nzionc mutagena, nC In ricomparsa della capwit5 diffcrcnziativa 6 dovutn a sclczionc di eventuali mioblasti che non hanno incorporato il precursore. Trn gli altri analoghi delle basi nzo- tatc, solo i derirnti dcsossiribonucleosidici contencnti una base pirimi- dinica alogcnntn in 3 provocnno g1i stcssi effctti sulla rniogcncsi (CoLEiras el at., l9G0 ; BISCIIOFF c IIOLTZER, 1070).

L’intcrpretazionc proposta sia da HOLTZEIL clic da COLEMAX Z: ba- snto sul fatto clic In BUdR inibisce In diffcrenziazione di diwrsi tipi ccllulari in colturn : ccllulc muscolnri, cartilagince, amniotiche, inimuno- competenti, pancrentichc, eritropoietichc, ctc. Si riticnc chc In prescnza di BUdR ncl DNA blocchi lc funzioni (( di IUSSO D (sintesi di protcinc contrattili, di condroitin-solfato, di ncido inluronico, di anticorpi, di zimo- gcno, di cmoglobina, ctc.), ma non la sintesi dclle proteine necessnric per la moltiplicazionc cellularc. 31s l’ipotesi di un blocco selcttivo della tra-

scrizione dci geni che controllano i caratteri differcnziativi richicde una seric di condizioni chc sono assai poco probabili : per es. si dovrebbe am- mcttere clie certc regioni di inizio ’dells trascrizionc, che sono ricche in piriniidiiic (SZYBALSKI it aZ., 10GG) c nelle quali potrebbc venire incorporata preferenzialmente la BUdR, siano essenziali per I’espressione dei geni chc regolano lc funzioni B di lusso D ma non per quella dei geni chc controllano le funzioni -0 essenziali u. Oppure questi ultimi dovrebbero esscrc for- tcmente ridondanti, per cui sarcbbe dificilc inattivarli tutti contcmporaneamente, ma scmmai B vero il contrario, ciot! clie sono ridondanti i geni legati a1 differenziameiito (LASIIER, 1071 ; CRIPPA, 1071). Inoltre nnche a saturando g il DNA con BUdR, cosa che si ottiene mantenendo per niolti cicli nioltiplicativi le cellule in prcsenza dell’analogo (BISCIIOFF e IIOLTZER, 1070), la divisione cellularc c lc funzioni 4 essenziali u lion risultano inibite.

L’inibizionc che si osserva dopo incorporazione B unifilarc u dellrt BUdR ncl DNA clovrcbbc poi indicarc clie C suficientc chc l’analogo sia prescntc in uno solo dei due filanienti di DNA, ed indifferentcmcntc nel- l’uno o ncll’altro, perch6 vcnga altcrato I’RNA neosintetizzato : infatti entrambe le cellule figlie risultano inibite. M a perell6 qucsto sia possibile, sono nccessari mcccanismi di trascrizionc basati sulla complcnicntazione tra tre basi, cioi: le due basi dcl DNA dovrcbbcro specificare entrambe quella dcll’RNA ; meccanismi di qucsto tipo sono stati proposti in passato ma non sono accettati in base ai dati spcrimentdi pih recenti (LEVIS et al., 1067, 1008; RICIIARDSON, 1060). InAne non si capisce come i mioblasti clie hanno incorporato BUdR per un numero eccczionalmente elevato di gcnerazioni possano rccuperare la capacitj di differenziarsi, dopo alcuni cicli moltiplicativi in assenza dcll’analogo : sia i dati relatiri a1 pcso molecolare del DNA, sia le autoradiografie dopo incorporazione di BUC~R-~H indicano che I’analogo B stato diluito ncl nucleo ma non dimostrano clie esso i: stato completameiitc eliminato ; n6 si vede come potrcbbe esserlo se & vero che il DNA C nictabolicamente stabile. I n altrc parole, sc basta l’incorporazionc 0 unifilare u di BUdR nel DNA per inibire il differenziamento, solo I’eliminazione complcta dcll’analogo dovrcbbc pernietterc il recupero dells capacitj differeiiziativa.

L’ipotcsi di una inibizione selettiva dclla trascrizioiie apparc dunque difiicilmente sostcnibile. fi invecc possibile clie l’incorporazionc di BUdR impedisca la duplicazione di particolari geni oppurc blocchi altri nieccanismi che regolano l’esprcssione dello stato differenziato. La prima ipotesi si basa sugli cffetti della BUdR sul differenziamento (sintesi di condroitin- solfato) (lei condrociti in coltura. In queste cellulc vi i: un pcriodo critico, associato con la mitosi e/o con la sintcsi di DNA, durantc il quale I’incor-

porazionc di BUdR inibiscc la diffcrcnziazione ; anchc dopo qucsta fase si pub avcrc incorporazione di BUdR nel DNA, ma qucsta non provoca effctti sul diffcrcnziamento. La sintcsi di DNA nella fasc criticn prcsenta carattcri particolari : 6 particolarmcntc scnsibilc a1 livcllo di timidina- monofosfato cd inoltre pub csserc u sfasata n rispctto alla duplicazionc normale, cio6 pu6 avvcnirc nclle fasi G 1 o G 2. Infine i condrociti sintctizzano piccolc quantith di condroitin-solfato gib prima delIa Vera c proprin differenziazionc ; qucsta si manifcsta con l’aunicnto dclla sintesi dopo il periodo critico, e non i! necessariamentc collegatn con In ccssazionc dclla moltiplicazione (LASIIER, 1071). Si riticnc percib chc la diffcrcnziazione dei condrociti consista ncll’csaltazionc mediante amplificazionc genica c nclla stabilizzazionc di un carattere precsistentc, piuttosto clie nclla comparsa di un nuovo carattere o ncll’attivazionc di un carattere prima latente (LASII, 10G8). L’amplificazione gcnica verrebbc realizzata ncl periodo critico, in rapport0 alla duplicnzionc ripetuta di tratti spccifici di DNA: Ie intcrfercnzc prorocatc dalln BUdR smcbbero do+utc all’inibizionc dcll’amplificazionc gcnica c per qucsto l’cffctto si osscrrcrehbe csclusiL-amente nel pcriodo critic0 (~,asIrEI1, 1071).

Conclusioni analoghc possono m e r e ricavatc dai dati di MIURA c WILT (1971) : nellc cellule critropoietiehe dcll’embrionc di pollo coltiratc in vitro la sintesi di cmoglobina inizin dopo 12 ore cd 6 prcccdutn da sintcsi di DNA. I1 diffcreiizianicnto vicnc inibito dalla BUdR solo se questa & incorporata ncllc prime G ore di sintesi di DNA, ma non si ha inibizione sc I’incorporazionc ha luogo ncllc sei ore successive, che pure prcccdono Ia sintcsi dcll’cmoglobina. Anchc in qucsto tipo di cellule la sintcsi di DNA & indispcnsabilc perch& abbia Iuogo Ja diffcrenziazione (PAUL c HUNTER, 1938). In qucsti casi si riticne che la comparsa dci cnratteri differenziativi dipenda dell’amplificazione, in particolari fasi dcl ciclo cellularc, di carattcri preesistcnti, la cui espressionc fenotipica era poco o affatto rilcvabilc prima dell’amplificazionc (PAUL, 1008 ; CAIIS, 1068 ; LASHER, 1071).

L’incorporazionc di BUdR, clie pub provocare anclie dissocinzionc tra duplicnzionc dcl DNA c ciclo ccllularc e nlterazionc ,dclla riorgnniz- zazione dci cromosoini (BERKOWITZ ct al., 19G8), potrebbe bloccarc un mcccanismo complcsso corn’?! quello dell’amplificazione, senza invecc in- terfcrirc sulla duplicazionc norinale dcl gcnoma. Dato poi chc I’amplificazionc sembra esserc sotto controllo di spccifici gcni (RESDEL, I%%), potrcbbc non csscrc ncccssaria l’eliminazione dells BUdR da tutto il DNA ; baste- rebbc chc I’analogo vcnissc diluito c scomparissc da quci tratti specifici, pcrch6 I’amplificazionc e di conscguenza In diffcrcnziazione vcnissero ripristinate. C’i: da aggiungerc chc ilcl DNA dcllc cellule di mammifcri in

coltnra esistono siti prcfcrcnziali di incorpornzione della BUdR ed nltri chc iiivccc richicdono la prcsenza di Tdr, e che la BUdR si pub trovare lo- calizzata anche in polinucleotidi a basso peso molecolarc, apparcntemcnte non associati a1 DNA dci cromosomi (BERKOWITZ et nl., 1968). Anche il DNA ridondantc in ccrti casi t? stato isolato sotto formn di compost0 a basso p.m. chc, nnchc se di origine nuclenre, verrcbbc trascritto solo dopo csserc migrnto a live110 .citoplasmatico (BELL, 1OGO).

Si pub dunquc proporrc un modello in cui lc intcrfcrcnze provocate dalla BUdR sul differcnziamcnto dipcndono dall’incorporazione dell’analogo a livelio dci geni clic regolano l’amplificazionc, oppure direttamente a li\-cllo dci gcni amplificati. C’C per6 da stabilire se il modcllo, che si basa su risultati ottenuti s u altri sistemi cellulari sin applicabile anchc a1 diffcrcnziarncnto muscolarc.

Innanzitutto no11 esistono dati sicuri sull’csistcnza di un period0 critic0 di sintesi di DNA nei mioblasti, ncccssario per il diffcrenziamcnto, durantc il qualc lc ccllule snrcbbcro specificntamente sensibili all’azione della BUdR. I mioblasti possono diffcrenziarsi nnclie dopo un unico ciclo moltiplicativo in coltura, per cui l’inibizionc & stata sempre rcalizzata trattando le cellulc con BUdR fin dalla seminn. PIETSCII c 3Ic COLLISTER (10G5), usando la fleomicina, un antibiotic0 clic blown la duplicnzionc dcl DNA ma non la trascrizionc n t la sintcsi protcica, hanno osscrvato che nella rigencrazione del niuscolo sclielctrico csistono tre fasi di sintcsi di DNA e chc solo inibcndo In prima di qucste fasi si impedisce In rigcncrnzione. Tuttnria I’impossibilith di precisarc le corrclnzioni tra Ic diverse fasi di sintcsi di DNA e gli aspetti citologici della rigenerazione, non permctte di trarrc conclusioni sicurc.

Altri dnti per6 fanno pensarc chc anclic ncl muscolo siano possibili fenomcni di amplificazione gcnica collcgati a1 diflerenziamento. & stato ipotizzato da PELC (1DG.E) che in diversi tcssuti differcnziati, con cellulc ’che Iianno ccssnto di dividersi (nnclic nel muscolo liscio, strinto c cnrdiaco), vi sin sintesi di DNA (( metabolico o. Ncl pr‘occsso 6 intcressato il 2% dcl DNA ccllularc, clic corrispondc alla quaiititit coiiivolta ncll’amplificazionc che si vcrifica durantc la formazionc dci puffs nei cromosomi politenici. Percih PELC riticne clic anche nci Vertebrati I’nmplificnzione intercssi solo pochi gcni lcgati nllc funzioiii spccializzate. Con mctodi biocliimici di fra- zionamcnto 6 statn trovata nel muscolo schcletrico c cardiaco di topo una frazionc di DYA a basso p.m. chc non dcriva da dcgrndazionc dcl DNA cromosopico ; inoculando Tdr-W ncll’animnlc adulto si trova clie questa frazionc ha attivith specifica particolarmente elcvata, anche se le cellule dcl muscolo cardiaco e scheletrico hanno ccssato di diridcrsi (STitous rt

al., 1067). Piti rcccntementc BELL (1969) ha purificato da muscolo scheletrico embrionalc un DNA a basso p.m., con la stessa temperaturn di fusionc e la stessa dcnsith del DNA nucleare, ma localizzato nel citoplasma. Qni csso si’trova associato ad RNA ncosintetizzato, c forma complcssi chc comprcndono anchc subunit& ribosomali o polisomi. BELL ha proposto un meccanismo in cui ccrti tratti di DNA, amplificati selettivamente, pas- sercbbcro ncl citoplasma e qui formerebbero complessi con enzimi, RNA c ribosomi, a livello dci quali trascrizionc e traduzione avverrebbero quasi contcmporaiicamcnte.

Infinc vanno ricordati i dati di MARTINUCCI et al. (1970), clie in colturc di muscolo scheletrico di ratto e di pollo hanno trovato percentuali significative di nuclei marcati nelle fibre, dopo intervalli di tempo molto brcvi ddla somministrazione di Tdr-311. Essendo orrnai stabilito che i mioblasti si fondono solo in G 1, dopo un intervallo relativamente lungo dalla finc del period0 di sintesi dcl DNA, quei risultati non ppssono pih csscrc interpretati come un’indicazione che la fusione pub aver luogo anchc in G 2. Possono invecc indicare chc nella fase immediatamente sue- cessiva alla fusione si vcrifica una qualche sintesi di DNA ; dato che la duplicazionc normalc dcl DNA nellc fibre B bloccata, potrebbc trattarsi della replicazione di tratti limitati del genoma, l e p t a ad un processo di amplificazione.

Ma gli effetti dclla BUdR sulla fusione dei mioblasti possono essere riferiti ad un meccanismo completamcnte diverso. La BUdR provoca, a seconda dclle dosi impicgnte, effetti diversi : a dosi elevate inibisce anche la moltiplicazionc e la sintesi dcl DNA (BISCHOFF e HOLTZER, 1070 ; CO- LEMAN et al., 1970), probabilmente per un meccanismo di feedback ncgativo, simile a qucllo provocato da conccntrazioni clevatc di Tdr. A dosi inferiori, eon lc quali lion si ha inibizione della moltiplicazionc ma blocco re- vcrsibile dclla sintesi delle molccole a di lusso g, insorgono importanti altcrazioni niorfologiche su diverse cellulc in coltura (IIOLTZER et nl., 1968 ; ,

~IIURA c \YILT, 1071). Lc ccllule appaiono ingrossate ed appiattitc, lianno una supcrficic anclie 5-10 volte mnggiore dcl normalcy e mantcngono scarsi contatti intercellulari. ribbassando ancora le dosi, gli effctti morfologici ten- doiio a scomparirc, m a non 6 affatto dimostrato clie essi siano del tutto dissociabili dall’inibizionc del dircrcnziamcnto. Questc altcrazioni fanno pcnsarc .z modificazioni della mcmbrana plasmatica, la cui funzione it essenziale iiei mioblasti in rapport0 a1 processo di fusione, m a B importante in gcnernle in tutti i proccssi di differenziazionc basati su fenomeni di regolazione gcnica coiitrollnti anchc dalla concentrazionc intraccllularc di

COLEMAX et! ffl., 1960, 1070 ; BISCITOFF C IIOLTZEB, 1070 ; h S H E R , 1071 ;

specifici metaboliti, e quindi d a h permeabilith dclla membrana. Dato che il diflercnziamento muscolare pu6 essere rilevato solo ncllc fibre, l’effetto della BUdR potrebbe consistere nell’inibizione specifica della fusione, dovuta a particolari modificazioni a livello di membrana.

& questa I’indicazione che si ricava da una breve nota di SANGER e HOLTZER (1970), che hanno usato un inibitore della citodieresi (citocn- Insinn) che provoca In formnzione di ccllule binucleate. 3Iioblasti trattati in questo mod0 formano fibre binucleate provviste di miofibrille e dotate di attivith contrattile ; lo stesso si verifica se si trattano con citocalasina mioblasti clie hanno incorporato BUdR durante un unico ciclo di duplicazione del DNA. CioC i mioblasti trattati eon BUdR, che normalmente non sarebbero in grado di fondersi e di differenziarsi se lion dopo che l’ana-

. logo b stato diluito, si differenziano normalmente se vengono artificialmcntc indotti a formare cellule binucleate. I1 dato b stato intcrprctato dagli Autori come un’ultcriore prova che la RUdR inibiscc la trascrizione dei geni responsabili delle funzioni Q di lusso IB, e come segno di una possibile com- plementazione tra genomi alterati quando questi si trovano nello stcsso citoplasma. Ma & evidentc clic la eomplementazione riguarda semmai la capacita di fusione dei mioblnsti: nelle colture trattate con BUdR e con citocalasina si formano infatti fibre contenenti fino a 10 nuclei, che deri- van0 dalla fusione di pih fibre binucleate. Stando cosi le cose, dovrebbe nnchc risultare definitivamente insostenibile I’ipotesi della mitosi 4 critics 0,

con relativa deviazione dei mioblasti dal normnle ciclo moltiplicativo prima della fusionc. I n queste colture infatti i mioblasti che hanno incorporato BUdR e non sono stati subcoltivati in terreno normalc, si differenziano senza che neppure la divisione si completi, solo in quanto nelle fibre binucleate cessa la sintesi di DNA. evidente l’analogia con gli escmpi citati di differenziazione di mioblasti mononucleati, nei quali la moltiplicazione ccssa in seguito ad inibizione da contatto.

L’ipotesi di un’azionc della BUdR sulla membrana plasmatica si basa anche su altri dati. ScrrunEnT e JACOB (1070) lianno utilizzato cellule di ncuroblastoma di topo che possono cssere indotte a differenziarsi mediante modificazioni delle condizioni di coltura : l’espressione della differenziazione dipende dalla sintesi di niicrotubuli c di protcinc specifiche e viene indotts alterando i rapporti tra le ccllule ed il loro supporto. Lo stsso tipo di differenziazionc pu6 esscre indotto trattando con BUdR, anche in assenza di moltiplicazione cellulare e quindi scnza chc l’analogo possa venire incorporato nel DNA. Gli Autori ritengono die un’alternzione della membrana plasmatica e della permcabilith provochi modificazioni dei sistemi di regolazione ed induca indirettamente la differenziazione.

e noto che la Tdr & un cofattore nel metabolismo dci carboidrati ed b quindi possibile che la BUdR alteri la sintesi dei carboidrati associati alla mcmbrana plnsmatica. Inoltre nella formazione di detta membrana intcrvengono glicoproteine e mueopolisaccaridi la cui sintesi comports anchc la formazione di nucleotidi, generalmente derivati dnll’uridinn. k anche nota la presenza di liporibonucleoproteine nelle membrane ccllulari ed i: stato discusso il possibile ruolo dell’RNA in qucsti complessi (SIIAPOT e DAVIDOVA, 1071). I n definitiva i! possibile che l’alterazione della sintesi di alcuni costituenti della membrana plasmatica ad opera della BUdR o dei suoi derivati, prodotti dagli scambi nueleosidici, provochi un cambia- mento delIa struttura e deIle proprieth di superficie della celluln c di conseguenza determini una modificazione dell’espressione fenotipica. I1 rapido turnover dei componenti della membrana plasmatica potrebbe spiegare la rapidith con eui la BUdR inibisce la differenziazione e la scomparsa del- I’effctto quando I’analogo & ancora presente a livello di DNA.

Un’ultima conferma i: offerta dall’inibizionc selettiva dclla fusione dei mioblasti in coltura, dopo incorporazione di Td+H (LEVIS et al., 1070). Anche qui l’effetto dipende pih chc dalla presenza dcl prccursore rndioattivo a livello nuclearc, da effetti secondari sui sistcmi di membrana, che possono esserc provocati anche da altri tipi di radiazioni ionizzanti. Gli cffetti dell’autoirradiazione vengono ridotti modificando fattori ambientali (sicro, estratto embrionale, collagene) che favoriscono i contatti interccllulari c agiscono s u h membrana plasmatica (BIASCIII et d., 1071 ; LEVIS et nl., 10’71b).

L’esame delle interferenze dclla BUdR sulla miogenesi ci ha portato a discuterc meccanismi importanti pcr la regolazione del diffcrenzinmento muscolare. I1 diffcrcnziamento del museolo schelctrico in un sistema sem- plificato corn’& quello delle colturc monostratificate offre la possibilith di chiarire questi meccanismi, a patto che si utilizzino interferenze la cui azione sia chiaramente identificnbile, c purchC si detcrmini con precisione fino a che punto le fasi del processo diflerenziativo sono dissociabili una dall’altra. Sar& forse possibile affrontarc per questa via anche il problema dei tumori muscolari che, pur prcsentando sia in vivo clie i 1 2 vitro meccanismi normali di regolazione nelle fasi successive nlla formnzione delle fibre (contenuto in DNA corrispondente a1 livello post-mitotico ; nicnte mitosi nC sintesi di DNA dopo la fusione ; presenza di miofibrille solo nellc fibre), sono caratterizzati da scarsa differenziazione (NAMEROFF et al., 1070 ; REZXIK et al., 1070). In questo caso scmbra infatti mancare qualche controllo specific0 a livello di membrana, pcr cui la moltiplicnzione dci mioblasti risulta dissociata dal normalc processo di fusione.

E. Intcrfercim sit1 iliffcrciizinmeizfo delle j b r c

Si B visto che lc fasi pih complessc della miogenesi awengono dopo la fnsione dei mioblasti c costituiscono un process0 a tappe delle quali sarebbe importantc stabilirc Sinterdipendenza. tinche qui il problema pub esserc affrontato studinndo gli effetti di sostanze clie intcrferiscono su fasi specifiche del differenziamcnto, ma purtroppo D questo proposito i dati sono estrcmamente carenti. DE LA HABA et al. (1968) hanno osservato’che i mioblasti di muscolo sclicletrico in coltura non si fondono se il terreno non contiene siero. L’nggiunta di sicroalbumina risulta inc~icace, mentre con insulina si ottcngono fibre polinucleatc che perb dopo alcsni giorni degenerano ; sc si aggiungc anche somatotropina (che da soh, in assenza di siero, non ha alcun effetto) si ha un’ulteriore stimolazione della formazione di fibre. Lc fibre formate in prcscnza dei due ormoni, pur avendo miofibrille birifrangenti, 11011 presentano striatura trasversale, ed il livello della glicogeno-sintctasi, cnzima normdmentc sintetizzato dopo la fusione, B molto ridotto.

La formazionc clelln striatura trasrersalc e la sintesi di glicogeno- sintetasi sono dunque parametri diffcrcnziativi dissociabili non solo dalla fusione dei mioblasti, ma anche dalla comparsa delle miofibrillc. I due caratteri non vengono ripristinati in presenza di idrocortisone (clie previenc solo In degenerazionc delle fibre) o di altri ormoni ; sono invecc ripristinati se le colturc vcngono incubate in terreno contcnente siero, anchc sc dia- lizzato o digcrito con pronasi o riscaldato a 1OOoC. Evidentemente nel sicro sono prcscnti divcrsi fattori capaci di indurre il differenziamento completo della fibra, mentre alcuni ormoni controllano solo fasi particolari del process~ . fG intercssantc notarc che sia in v b o (FISCFI~IAN, 1070) clie in d r o (FIRKET, 1967) la linea Z, che detcrmina la comparsa dclla striatura tra- sversalc, dcrivn probabilmentc dalla mcmbrana plasmatica della fibra cd ha inizinlmcntc I’aspetto di granuli densi agli elcttroni probabilmentc contenenti glicogeno. Anchc una specializzazionc del sistema T, caratterizzata da strutture tubulari alveolari ad orientamcnto prevalentementc esngonale, 6 stata attribuita a fcnomeni di alveolazione della mcmbrana plasmatica indotti da sostanzc presenti nel terreno di coltura (ISIIII~AWA, 1968).

Particolari tappe del differcnziamcnto delle fibre possono esscrc dunque controllate dal siero c dall’cstrrrtto cmbrionale, i cui effetti vengono in gcncrc riferiti ad interazioni tra gli ormoni che contengono e la membrana plasmatica ( C a n s , 1968 ; LASH, 1968). Ma l’azione degli ormoni sul differenziamcnto dipcndc da interazioni a lirclli divcrsi del kistema di regolazione che non coinvolgono solo la membrana plasmatica (TURKIN-

GTON, 1971). Per esempio, nel case clcll’insulina c tlella somntotropina il sito d’azione potrcbbe essere a livello della membrana, per quanto rigiiarda la stimolazione della fusione dei mioblasti, ma i: siciiramente diverso per quanto riguardn gli cffetti sulla formazionc e sdl’organizzazionc de& miofihrillc. Nel muscolo i i t vivo In somatotropina stimola la sintcsi di RNAm e di RNAr probnbilmente per un’azionc diretta sulla RNA-polimerasi (FLORISI e BREUER, 1966). L’effctto dell’insulina vicne invece attribuito (HEI~RAIANN d al., 1970) all’attivazione dei ribosomi in rapport0 alla sintcsi di specifici fatt tori di inizio, della traduzionc, simili a qnelli trovati da IIEYWOOD (1970s) nei polisoini pcr In miosina (v. 0 V1I.C). Infine, l’aiimento dclla sintesi di RNA ncl muscolo ad opera dcl tcstostcrone sembra dipendere da una modificazionc della capncith di stampo del DXA (BREUER c FLORIXI, 1966). Pcrcib Ie interferenze sul diffcrenziamcnto dclle fibre, in questo caso dovute a stimoli di natura orinonale, sono ricondu- cibili a meccanismi moIto diversi di regolazionc a Iivcllo cli trascrizione oppure di traduzione.

La formazione dei sistcmi di mcmbranc sarcoplasniaticlie h stata stu- diata in vitro da divcrsi Autori (EZERMAN e ISIIIKAIVA, 1967; SIIIMADA et al., 1067 ; ISIIIKAWA, 10GS), ma non si b tcntato di collcgarc lo sviluppo del sistcma T c quello dcl reticolo sarcoplasmatico eon particolari propricth fisiologiclie clic compaiono nel corso della miogencsi, cosa che pure dovrcbbc essere tccnicamcnte rcalizzabile utilizzando le colturc in monostrato. I fattori che inducono in coltura modificazioni della strnttura tipica dellc triadi e del sistema T non sono stati identificati nC i: noto il significato funzionale di tali repcrti. fi cliiaro in\-ecc che il sistcma cli membrane e tubuli snrcoplasmatici non svolgc nlcun ruolo nclln formazione c nell’organizzazione delle rniodbrillc, neppure quando qucstc assuniono il tipico ordinamento csagonale ; questo fatto introduce un’ulteriore possibilith di discriminare tra fasi diverse della miogcncsi, poncndole in corrclazione con nltrcttanti meccanismi di controllo.

FISCIIJIAS (1970) ha studiato il processo di rinssociazione dclle fibrille dei mioblasti cardinci : quando questi vcngono dissociati con tripsina lc miofibrille vengono disperse, i filamcnti sottili e spessi appaioiio orien- tati a caso e la linea Z scompare. Se i mioblasti vengono incubati in prcscnza di un inibitore della sintcsi proteica, entro 2-3 ore essi riacquistano la capncith contrattile e le miofibrille si riassocinno, mcntre la linen Z si ricostituisce solo parzinlmentc. In qucsto caso pcrcii, la formazionc di miofibfille da filamenti preesistenti non richiede sintesi protcica, e I’assunzione dell’ordinamento esagonale delle miofibrillc i: indipcndente dalla de- posizione preliminare dci coniponenti della linea Z. Neppure nei mioblasti

scheletrici l’organizznzionc delle miofibrille t! legata alla presenza dellc linee 31 e Z ; qucst’ultima sembra neccssaria per la crcscitn in lunghezza delle miofibrille, chc awicne mcdiante aggiunta di nuovi sarcomeri.

& possibilc dunquc che alcune tappe della miogcnesi avvengano con un meccanismo automatico di u montaggio b, come si osscrvn per le subunit& pesanti e leggcrc della miosina chc, sintetizzate ciascuna da un diverso RNAm monocistronico c da uno spccjfico tipo di polisonii, si associano spontancamcnte fra di lor0 (Low et d., 1071) ; e anchc per i monomeri dclla miosina c dcll’actina, che, purificati e incubati k vitro in opportune condizioni, si aggregano formando filamcnti spessi e sottili simili a quclli prescnti nellc bande 11 ed I (cf. FISCII~IAN, 1070).

F. Reversibilitci drllo sfnfo diflerenzinto

La possibilitj di realizzazione dell’intcro process0 ontogenetico da parte di un nucleo cellulare diffcrenziato di Vertcbrato & stata dimostrata dai classici espcrimcnti di GURDOX (cf. GURDON e WOODLAND, 1070), che ha ottenuto individui adulti di Xenopua trapiantando un nucleo di iina ccllula dell’epitelio i&estinale in una ccllula uovo il cui nucleo era stato inattivnto mcdiante irradiazionc. Bla pih sempliccmcnte, in altri sistemi celliilnri si osscrvn chc lo stato diffcrcnziato non t! stabile, per csempio nei condrociti & possibilc iina o sdiffcrcnziazionc )) cd una 0 redifferenziazionc )), cnrattcrizznte da scomparsa e ricomparsa dclla sintcsi di condroitin-solfato c d a altcrnzioni morfologiche, in rnpporto a modificazioni dclle condizioni di coltura (CAIIS, 1968).

Ncl cnso dcl muscolo schelctrico il problems 6 orviamcnte piii complcsso poich6 In cliflercnziazione it accompagnata da fusione cellularc c da eessazione dclla sintesi di DXA, ed una cvcntuale reversionc richiederebbc la segregnzione dei nuclei della fibra c la ripresa dell’sttivitj moltiplicativa. La rigenerazionc in vivo dcl muscolo scheletrico, carattcrizzata dalla comparsa di mioblasti mononucleati, dalla loro moltiplicazionc c fusionc con formazionc di iiuore fibre muscolari, dovrebbe poter fornirc iina risposta a1 problemn ; ma proprio I’originc dci mioblasti costituiscc il pomo delln discordia tra gli studiosi della rigencrazione.

Per molti Autori infatti it scontato chc i mioblasti derivano dalla rinttirazionc dcllc cellule satelliti le cui carattcristiclie sono state rivistc recentcmentc (MUIR, 1970 ; SIrmrQ, 1070 ; ISIIIKAIVA, 1970). La loro percentuale rarin n scconda della specic animalc c dcl tip0 di muscolo c tende

. a decrcsccrc nel corso dcllo sviluppo. Indubbiamente si tratta di cellule che per la loro localizzazione si trovaiio nclla condizione idealc pcr riccvere segnnli, in rnpporto con le condizioni funzionali c di organizzazione della

fibra: per es. le giunzioni che in certi casi sono statc notate tra fibra c cellule satelliti (MUIR, 1970) possono permettere un controllo tramite co- municazioni accoppiate del tipo di qiielle che si verificano tra i mioblasti cardiaci (v. 5 VI). Un danno alla fibra pui, provocarc disaccoppiamento ed influenzare le cellule satelliti, che vcngono stimolate anche a distanza considerevole dalla zona della lcsione (SIIAFIQ, 1070).

Sicuramente solo alle cellule satelliti debbono esserc riferiti i rcperti di figure mitotichc c lc prove di sintesi di DNA ehe, fino a non molto tempo fa, venivano attribuiti ai nuclei delle fibre, a causa dell’inadeguatezza delle tecniche disponibili (Moss e LEBLOND, 1070). E probabilmentc ddle cellulc satelliti vicne il principale contributo alla rigenerazione in quci muscoli che ne sono provvisti in altn percentualc anche a sviluppo avanzato. Tuttavia la possibilita che anche i nuclei della fibra si distacchino circon- dati da un PO’ di citoplasma e formino ccllule mononucleate, & statn in- dicata da STEEN (1970), die ha trapiantato frammenti di fibre muscolari di Asolotl, contenenti nuclei riconoscibili perch6 triploidi c marcati con Tdr-SH, nella zona di rigenerazione di un muscolo dcllo stesso animale, ed lin trovato nuclei marcati c triploidi ncllc fibre rigencrate. Ma gli escmpi pih convincenti della rcvcrsibilith della differcnziazione muscolarc sono do- cumeiitati da REZNIK (1069, 1070) che ha studiato la rigcnerazionc nel muscolo dcl topo c dcl coniglio adulto. In questo caso i nuclei della fibra, as- sieme ad un alone di citoplasmn poco differenziato c privo di miokbrille, si scparano in segiiito nlla formazione di vcscicole che derivano dnlln membrana plasmatica c dai tubuli rigonfiati del rcticolo sarcoplasmatico c che si fondono per formare una nuova membrana divisoria. I mioblasti cosi originati passano attravcrso uno stodio di ccIlule satelliti ancora comprese a1 di sotto dclla membrana basale della fibra, c poi si libcrano e assu mono l’aspetto di mioblasti maturi, simili n quelli presenti nella tarda embriogcncsi, con citoplasma abbondantc e pih diffcrcnziato. Infine si dividono c si fondono clando origine allc move fibre dcl muscolo rige- ncrnto.

Effettivamcnte 6 dificile spicgare la rapidit& con cui aumentano i mioblasti nella rigenerazione, solo in base alla presenza dcllc ccllulc satelliti cd a1 loro tempo medio di generazione, per cui REZSIK ritiene che i mioblasti originino esclusivamcnte dai nuclei dclla fibra, passando attraverso uno stndio in cui assumono In locnlizzazionc tipica delle cellulc satelliti. u n a a rinttivazione D dei nuclei della fibra viene ammcssa, sd l a base dcl loro aspetto a1 microscopio elettronico, anclie da qucgli Autori che ritengono clic i mioblasti originino esclusivamentc dalle ccllule satelliti (SIIAFIQ, 1070). 8 probabile che i duc processi, considerati in niter-

nativa, concorrano a h rigenerazione in proporzioni diverse a seconda dcllc condizioni e del tipo di muscolo.

Gli Autori che hanno affrontnto (molto marginalmcnte, bisogna rico- noscerlo) questo problema nel eorso dclla miogenesi in vifro, lianno concor- dcmcnte escluso un contributo alla forinazionc dei mioblasti d s parte delle fibre prcscnti nel muscolo utilizzato per allestire le colture (KOXIGSBERG e HAUSCIIKX, 1965 ; COLEJIAS, 1970 ; STOCKDALE. 1070), ed hanno anchc negnto la possibilith clie fibre dill‘erenziate in coltura possano dare originc a nuovi mioblasti (BI~CIIOFF e IIOLTZER, 100 ; CoLE3us, 1070). La eon- clusioiie si basa su diverse osservazioni : a) pamllelamente allo sviluppo del muscolo irt vivo, quindi con I’sumcnto dellc fibre c la diminuzione dei mioblasti, aumcnta la dificoltii di allestire colture di ccllule dissociate (& possibilc ottenerc differcnziazione in colture di cspianti) ; b) quanto pih sviluppata b una coltura muscolare tanto minore & il grado di differenziazione che si ottienc tripsinizzando Ic cellule e allestendo una subcoltura ; c) fibre differenziate in coltura, isolate con metodi di micromanipolazione, non si riattaccano a1 support0 e non sono in grado, neppure sc tagliuzzate, ‘

di dare origine a nuovi mioblasti. Conclusioiii opposte sono state ottenute nel nostro Inboratorio, dovc

il problcma B stato affrontato da divcrsi punti di vista. Innanzitutto vn notato chc in vitro I’altcrnativa alla sdiffcrcnziazione dei nuclei dellc fibrc b rapprcsentata, pih clie dalla moltiplicazionc di evcntuali cellule satclliti, da quelld dei mioblasti non necessariamentc associati allc fibrc, che rcstano prcscnti in pcrccntualc notcvolc (5-15%) anchc nclle fasi pih avanzatc di coltura.

La diminuzionc dclla eapacith diffcrcnziativn clic si osserva dopo ri- pctuti pnssaggi in coltura dipende non tanto dalla perdita clci mioblasti gi& fusi, ma da una diminuzionc dcll’attivith prolifcrativa di tuttc lc cellulc, fibroblasti compresi, clic i: caratteristica comune delle colture lion stabilizzate (ZANUSO et aZ., 1070a). I n conse,wenza della proporzionc ec- cessiva in fibroblasti c per le interferenze chc qucsti provocaiio sulla moltiplicazionc e sulla fusionc dci mioblasti, dopo alcuiii passaggi in coltura si osscrvhno mioblasti mononucleati differcnziati, clie lianiio ccssato di sintctizzare DNA. Sc questi vengono subcoltivati in prcscnza di mioblasti a fresclii o di’ inodo clic nc vcngono aumentate lc probabilith di incoii tro c di fusione, cssi sono in grad0 di riprenderc a moltiplicarsi c formano fibre (SAGGIORATO et d, 1970 ; LEVIS et al., 1071a) : quest0 & gib un primo csempio di reversibilith della diffcrcnziazionc anchc se riguarda ’

mioblasti mononuclcati. Ma anchc i nuclei derivati sin dalle fibre prcsenti ncl inuscolo in vivo (D’APRILE ct al., 1071), sin de quelle formatc in coltura

(ZANUSO et al., 1WOb ; LEVIS et al., 1071a) possoiio ricostituire mioblasti c ripetere il processo diffcrenziativo formaiido nuove fibrc, purclid lc fibre vengano minutamente disgrcgate e ridotte a frammenti mononmleati, purchC le a cdlule o cosi ottenute vcngano seminate ad inoculi molto densi, e purchC il support0 delle colture vcnga acondizionatoo con collagenc o con fibrina. La prova pih convincente B stata ottcnuta scparando mediante centrifugazione in gradientc di saccarosio frazioni quasi pure di fibre polinucleate, nelle quali i mioblasti contaminanti sono riconoscibili perch@ mancati con Tdr-311 e sono molto scarsi (5-10%) rispetto ai nuclei lion marcati delle fibrc. Da qucsta frazione vieiie preparata una sospcnsionc di frammenti mononucleati, costituiti da un singolo mionucleo con un alone di citoplasma, che danno originc in coltura 8 mioblasti che si moltiplicano e che poi si fondono per formare nuove fibrc. In base ai dati autoradiografici risulta clic il 5 0 4 0 % dei nuclei delle fibre possoiio csscrc a riattivati 1) in questo’ modo.

L’influcnza del trattamcnto enzimatico wato per dissociarc le fibrc & in questo cnso particolarmente evidente: i nuclei dcrivati dalla loro frammentazionc passano obbligatorianicnte attravcrso una fase di sintesi di DNA preceduta da sintcsi di RNA, e si moltiplicano una o pih voltc prima di essere in grado di fondersi. Anchc l’aumento di circa trc volte del rapport0 RNA/DNA clic si osserva prima della fusionc, indica chc i niioblasti originnti dalla scgrcgazione (lei nuclei dcllc fibre debbono subirc importanti modificazioni prima di csscrc in graclo di fondersi nuoramente (LEY’IS et d., 1 g ~ l a ) . Un problcmn pnrticolare, clie non si pone per le cellule satelliti niunite di ccntrioli e a volte di corpuscoli basnli associati a c i g h (Mum, 1070), riguarda la scomparsa dei centrioli n e h fibre (Pazr- DYI.SRI, 1 D ’ i l ) c la iiecessitk clic questi si riformiiio durantc Is ricostituzione dei mioblasti a partirc dai nuclci dclla fibrs. Pcrb i centrioli possoiio formarsi e,x izouo, colnc si osscrra iicllo sviluppo dcllo Xciiopus quaido, a110 stadio di neurula, ic cclIule divcntnno improvvisamcntc cigliate ed i ccntrioli clic danno originc ai corpuscoli basnli si formnno ncl giro di due ore c iion originano dalla clrrplicazione di ccntrioli prcesistenti (STEIXSIAS, 1968).

In gcncralc la sdiffcrcnziazionc 6 accompagnata da una ripresa dcl- I’attivit8 moltiplicativs ; percib 11011 stupisce che nel inuscolo il proccsso sia caratterizzato dalla perdita dcll’organizzazione sinciziale, clic 6 incorn- patibilc con la sintcsi di DXA e eon la mitosi. Anclie in altri sistcnii in rigcncrazionc la sdifferenziazione consiste nella pcrditrr dei prodotti associati nllo stato diffcrcnziato c ncll’acquisizione di proprieta nuclcari c citoplasmatiche adatte alla divisione cellulare (riprcsa dclla sintesi di DXA c di

RNA, ingrossamento dei nuclei e modificazioni .dcllo stato della cromatina, aumento della basofilia citoplasmatica, etc.).

Per quanto riguarda il muscolo, possiamo concludere che il diffcrenziamento dei nuclei delle fibre B reversibile ma che 2: stabile In loro determinazione genetics : infatti non solo 2: fisso.il tipo di differenziamento a1 quale le cellule mirscolari vanno incontro nello sviluppo normale, ma anche quell0 che esse sono evcntualmente in grado di ripetere.

VI. DIFFEREKZIAJIEKTO DEI 3IIORIASTI CARDIAC1 IN COLTURA

I caratteri niorfologici e funzionali delle cellule cardische in coltura sono stati rivisti recentemente da DE HAAX (1968). Nonostante il cuore embrionalc sia formato, soprattutto m i primi giorni, da una popolazione quasi’pura di mioblasti con poclic cellule cndocardiche, ~ S S O d& orfgine a colture in cui sono presepti due tipi cellulari morfologicamente distinguibili : cellule fortemente rifrangenti, affusate o arrotondate, identificatc come mioblasti ; e cellulc appiattite, di forma triangolare o stellats, poco rifrangenti, identifieate come fibroblasti. Anclie partendo dallo stesso ma- teriale, le proporzioni tra i due tipi cellulari rariano in rapport0 alla durata del trattamento usato per dissociare il tessuto, all’uso di terreni c di supporti normali o condizionati, alla densitii dell’inoculo cellulare, alla tensionc di 0, etc. Anzich@ trattarsi di popolazioni cellulari diverse 2: percih probabilc clic ci si trovi di fronte ad aspctti divcrsi di adattamento di un unico. tipo cellulare. thelie nelle colture di muscolo cardiac0 t. possibile scpararc i due tipi di cellule, in base alln divcrsa velocith con cui adcri- scono a1 support0 della eoltuv, quindi con un metodo di sclezione che non ne altera Ie proprietj funzionali (POLINGER, 1070). I mioblasti presentano rarc figure mitotiche, mentre i fibroblasti si dividono attivamcnte ; in condizioni opportune circa 1’80 % dei mioblnsti corninciano a contrarsi spon- taneamcntc fin dalle primc fasi di coltura, nientre solo 1’14% delle cellulc fibroblastiche si contraggono (DE HAAS, 1968). h e h e questc proporzioni varinno a seconda dcl metodo di dissociazione c delle condizioni di colturn.

Una prima distinzionc rispetto ai mioblnsti schcletrici consiste nel fatto chc l’attivith contrattile e le niiofibrillc striate compaiono nci miohlasti cardiaci senza clie questi si fonclano; anzi in questo caso la

. fusione costituiscc un ercnto molto raro (P~ZYBYISKI c CIILEBOWSKI, 1970). La secondn. differenza importante B rappresentata dnl fatto che nei mioblasti cnrdiaci non vi t. incompatibilith tra differenzinmento e molti-

plicazionc. Inizialmente in vivo non erano state osscrvate figure mitotiche a carico di mioblasti prowisti di miofibrille (SFIAFIQ et al., 10G8) cd ern stato suggerito clie ncI cuore emtrionale foise prcscnte iinn popolazionc di cellule indifferenziate che sarebbero state le sole in grado di moltiplicarsi. Invcce JIAXASEK (1968) non ha trovato alcuna indicazione dell’esistcnza di un o pool b di cellule indifferenzinte nel miocardio dell’cmbrione di pollo, cd ha osservato solo tinn variabilitb del numero di miofibrille, indicc di un diverso grad0 di diffcrenziazioilc tra cellula e cellula. I mioblasti in mitosi non prcscntano segni di sdifferenziazionc, cioi: non vi b diminuzione delle miofibrillc nelle cellule che si moltiplicano. fi stato confermato rcccntemente (WEINSTEIN e IIAY, 1070) chc mioblasti cnrdiaci diffcrenziati in vivo sono capaci di sintetizzarc DNA e di dividersi.

Anclie in coltura b scmbrato inizialmcnte clie ci fossc inconipatibilith tra diffcrenziazione e mitosi c clie i mioblasti differenziati fossero deviati dal normale ciclo moltiplicativo (RUJIERS e RIEKE, 1067). Pih reccntemente i: stato invcce dimostrato clie ncppure in coltura vi B antagonism0 tra differenziazione e moltiplicnzionc nci mioblasti cardiaci, e clic i: anche possibilc ottcncre fibrc polinucleatc ibride, originate dalla fusione di mioblasti cardiaci eon mioblasti schcletrici (PRZTBPLSKI e CIrumowsKr, 1070). Qucst’ultimo dato i: in contraddizionc con osserrazione precedenti (YAFFE c FELDSIAX;, 1065) sulle quali ci si era basati per sostenere l’assoluta spc- cificitj dci mioblasti a h fusionc. Questi risultati nprono anche una via cstrcmamente utilc per indagnrc Ic intcrazioni tra mioblnsti cardiaci (cnpaci di moltiplicarsi anche sc cliffercnziati) e mioblasti schclctrici (chc invcce cessano di ciividcrsi nl momcnto de11a diffcrcnziazionc), quando i due tipi cii ccllule forninno fibrc polinuclcatc ibridc.

I n definitiva si riticne che l’antagonismo tra differenziazionc e moltiplicazione, chc carattcrizza il muscolo scheletrico, non rappresenti invece una condizione csscnziak per il muscolo cardiac0 (DE IIaas, 1068 ; CA- XEROX e JETER, 1071). C’k pcrb da tenerc prcscntc che i mioblasti cardiaci differcnziati hanno comunquc un’attivitj moltiplicntivn ridotta, a1 punto chc la initosi e la sintcsi di DNA sono consideratc cventi molto rari. Anche il differcnziamento dci mioblnsti cardiaci B dunque accompagnato da un rallcntamento dcll’attivith moltiplicativa; evidcntemcnte ncl muscolo sclielctrico intcrviene la fusione a rendere piii nctto l’antagonismo tra Ie due fasi, in quanto stabilizza la ccssazionc dclla sintesi di DNA e dclla moltiplicazione.. A parte l’aspctto specific0 rappresentato dalla fusione, lc differenze tra i due sistenli appaiono meno nctte se si considerano anche gli csempi cii rcvcrsibilith del diffcrcnzinmcnto ncl muscolo scheletrico, c

la possibilitj clie in determinate condizioni anclic i mioblasti scheletrici si differenzino scnza fondersi.

Per molti aspetti ultrastrutturali la differenziazioiie dei mioblasti cardiaci mononuclcati i: simile a quclla delle fibre scliclctrichc polinucleate. Vi sono tre tipi di filamenti riconoscibili : quelli sottili di actina e quclli spessi di miosina sono associati in fnsci di miofibrille, con b a d e A, I e Z (CEDERGRES c HARARY, 19G-l; \T’CISSTEIN e HAT, 1070) ; inoltre sono preseiiti 6 filamcnti intermedi u, noii associati alle miofibrille, analoglii a quelli trorati nel myscolo sclicletrico. Anche nei mioblasti cnrdiaci la li- nca Z origina d s un materialc dcnso agli elettroni, inizialmentc localizzato in prossiniith della membrann plasma tica ( CEDERGI~ES e IIAI~ARS, 1qCr-l)

1970). I mioblasti cnrdiaci hanno spesso, come quclIi schcletrici, ccntrioli . associati n ciglia (PRZYBYLSKI, 1071), ed & stato proposto clie questc svol- gin0 un ruolo di controllo dci rapporti tra mitosi e diflcrcnzinniento (RASH et al., 1969).

I mioblasti cardiaci sono strettamcnte collegati tra di loro mediante diflcreiiziazioni dclla membrana plasmatica (quadri di cliiusura, giunzioni) che assomigliano ai disclii intercalati preseiiti ncl cuore adulto, e sidle quali sono inseriti i fasci di miofibrille delle due cellule eontigue. La funzionc di queste strutture i: bcn documentatn : i mioblasti, clie si contraggono inizialmente in manicra asincrona c con ritmo divcrso, quando vcngono a contatto sincronizzano la loro contrazionc. Qunndo In coltura diventn con- fluentc, si stabiliscono dci centri ((( pnccmakers I)) clic regolano la contrazionc di m a ccrta regionc, cd evcntualmente tutte le ccllule del monostrato si contraggono in maniera sincrona. La sincronizzaaione richiede un intimo contatto intercellulare ed il ritnio i: determilinto dalla cclluln clie si contrac pih rapidamente ; quando nelle colturc pih avanznte l’attivith coiitrattile tcnde a diminuire, il ritnio pub cssere ripristinato se si aggiun- gono mioblasti (( freschi 0. G o s n I u (1970) ha dimostrato che la sincronizzazione avvienc anchc quando due mioblasti non sono in contatto diretto ma sono collegati tramite una o duc cellule cterotipiclie, per cs. fibroblasti di un ceppo stabilizzato i i t vitro. La capacith clie lianno le ccllule di diversi ceppi di a mediarc 1) la sincronizzazione dclln contrnzione di due mioblasti non dipende dalla trasmissione di dmwioni meccaniclic, clie si verifica nnche con cellule inattire, bensi dalla trnsmissione di un potcn- zialc ritmico di depolarizznzione clic assomiglia ai potciiziali postsinaptici delle giunzioni ncuro-muscolari. Qucsta trasmissionc si rcalizzn appunto grazic a particolari giunzioni cridenziatc a1 microscopio clettronico, chc non si osservano quando due mioblasti sono connessi twmitc unn cclluln

e non r i sono rapporti evidenti tra polisomi e miofilanicnti (I‘ ’ ISCIIJIAN,

incapace di sincronizzarc In contrazione. Si trattri di rcgioni in cui IC mem- branc plasniatichc sono in iiitirno contatto tra di loro (u tight junctions n), c che permettono un passaggio rapido di ioni da una cellula all’nltra.

I1 fatto clie strutture di qucsto tipo siano state osscrvnte mche in cellule lion eceitabili, sulle cui membrane non si registrano potcnziali di azione ritmici, fa pensarc ehe csse svolgano un ruolo nella regolazione di sltre attivitj ccllulari. Per cs. nci fibroblasti stabilizzati in uitro, giunzioni di questo tipo si formano niolto rapidamente (3’-10’) quando le colttire divcntnno confluenti c si ha inibizioiie da contatto (FLAXMAS et al., 1 9 0 ) : proprio tramite queste differcnzinzioni della mcmbrnna plkmatica potreb- bcro rcalizzarsi quelle interazioni ccllulari die portano all’inibizione dcl movimento e dclla divisione cellulare. Sc fosse confcrmata I’esistenza anchc nel muscolo scheletrico di giunzioni analoglie, finora osscrvate solo occa- siondmente tra mioblasti (REZSIK, 1070), tra fibre contigue poco sviluppate (KELT,Y c ZACIIS, 1969) e tra cellulc satclliti e fibre (NUIR, 1970)’ potrcbbe esserc attribuito ad esse un ruolo importante nei processi chc dctermi- nnno I’nrresto delln sintcsi del DNA durantc In fusione dci mioblasti, cd in quelli clie determinano la (t stimolazione n .dellc ccllule satelliti e dei nuclei dclh fibra durante la rigcncrxLione.

Sono stati iden tificati alcuni fattori clic influenzano l’espressione fenotipicn dei mioblasti cardiaei in coltura. Per es. DE HAAX (1968) ha tro- vsto che, tra i diversi fattori nmbientali che possono far variare la percen- hiale di cellule capsci di contrarsi, il pib cficnce 6 rappresentato dalla concentrazione di ioni K+. Con concentrazioni’ottimaIi, il50-GO % dellc cellulc si contraggono spontaneamentc ; a conccntrazioni inferiori le cellule degenerano, mcntre a conccntrazioni maggiori In pcrccntuale diminuisce e l’effetto B di breve dmata. L’azione del I<+ non i? specifica ma indiretta, cd i? in rapport0 a variazioni anchc minime di pressionc osmotica nell’ambiente di coltura : qucste determinano modifieazioni del movimento, della capaeitg adcsiva a1 substrato, dei eontatti interccllulari. I1 massimo differcnziamento si osserra quando tutta la superficie periferica di una cellula I: in contatto con Ie ccllule adiacenti ; numentando la pressione osmotica del tcrrcno, la superficie di contatto si riduce cd anche la differenzinzione, cioi? In percentuale di cellule eontrattili, diminuiscc.

N t r i dati confcrmano l’importanza ehe rircstono, per la diffcrenziazionc anche dei mioblasti cardiaci, fcnomeni incdiati dalla supcrficie cellulare: ILRXRS et al. (1OG6) hanno osser\rato clie la prcsenza di lipidi c di acidi grassi ncl siero 6 indispensabilc per il mantenimcnto dell’attivith contrattile, e ritengono clie la richiesta sirt collegata a1 ruolo clic questi composti svolgono nelle funzioni di membrana. I mioblasti possono eon-

tinuare a contrarsi e conservano i normali caratteri differenziativi, nnehe a livello ultrastrutturale, in assenza di siero, purchC a1 tcrreno vcngano aggiuntc misccle di peptidi c glucosio (AJIBORSKI et al., 1970). La ricliiesta di peptidi probabilmentc t! legata all’effetto clie questi lianno sulla sintesi dei mucopolisaccaridi extraccllulari, e di riflesso sulla permcahilith e sulla distribuzione delle carichc elcttrostntichc della membrana ; il glucosio sarebbe necessario per mantenere una data pressione osmotica elic regola, come si t! visto, i contatti intercellulari tra mioblasti.

In altri casi la modificazione dell’espressione fcnotipica non sembra invcee dipendere da proprietj di membrana. Per es. il cortisolo stimola la contrazione c fa ricomparire l’attivitii contrattile anchc in colturc e sdif- ferenziate n, chc non si contraggono pih e clic hanno perso la caratteristica morfologia niioblastica. I1 meccanisnio d’azione noii i: cliiaro ; comunque I’ormone provoca una riduzione della sintesi proteica senza alterarc la per- meabilitj cellularc agli aminoacidi c senza inibire la sintesi dell’RNA (SEALER c Nc CARL, 1071). Anche I’nctinomicina-D stimola I’attivitb eon- trnttilc dei mioblasti cardiaci, mentre fa degenerare le ccllule fibroblastiche (YAFFE e FELDUAN, 1964). Se si trattano colture differcnziatc con una dose chc inibiscc totalmente la sintesi dell’RNA, I’incorporazione di aminoacidi marcati snhisce dnpprima una rapida riduzione e poi si mantiene per 48 ore ad un livello costantc ; durante tutto qucsto periodo resta invariata .la percentuale di mioblasti chc si contraggono (BIc CARL e SIIALER, 1969). Solo pih avanti la sintesi proteica ccssa dcl tutto e si riducc anclic l’attivitb. contrattile. Se si trattano niioblnsti e sdifferenziati n, che hanno eessato di contrarsi, gli effctti a livello macromoleeolare sono gli stessi, ma parados- salmentc la pcrcentuale di cclIulc che si contraggono passa dallo 0% n quasi il 100% durante il periodo inizialc di riduzione della sintesi proteica e diminuisce pih tardi, quando la sintcsi proteica t! totalmente inibita. La spiegazionc pih semplicc E che . le proteinc legate all’nttivitj contrattile siano sintetizzate da RNAm a vita relativamcnte lunga ; percib nclle colturc differenziate l’inibizione della siiitesi dcll’RNA per qualchc tempo non Iia alcun effctto. Inoltre scmbra csservi antagonism0 tra funzioni u di lusso n, clic dipcndono da RNAm a vita lunga, c funzioni u esscnziali u, Ic- gate invccc ad RNAm a vita breve. Nci mioblasti (( sdifferenziati n vengono sintetizzatc proteine molto diverse, in quantith prcvalente rispetto a quelle specifieatnmcnte legate alla contrazionc ; queste ultime non possono accu- mularsi, organizzarsi, o pih scmplicemente rinnovarsi. In questo caso la ricomparsa del carattere diffcrenziativo dipendcrcbbe da un’inibizione che colpiscc inizialmcnte solo le funzioni lcgate all’esistenza di stampi a vita breve, c clie quindi seleziona i prodotti dcgli RNAm stabili.

Nel muscolo cardiac0 l’esistenza di RNAm stabili per le proteine contrattili 8 mcglio documcntata chc in quello sclieletrico. Qui inoltre sembra possibile un approccio a1 problema dclla modulazionc dcll’espressione fenotipica, che e stato affrontato soprattutto dn I.IARARS con lo studio dei rapporti tra funzioni dei mioblasti cardiaci (capacitb contrattilc, attivitii dell’adcnosin-trifosfat~si miosinica, contrattilith dei modelli di acto-miosina, etc.), aspctti metabolici (quozientc respiratorio, cnzimi glicolitici, os- sidazione degli acidi grassi) e modificazioni dclle condizioni di coltura (cf. HARARS et al., l9GG ; SERAYDARIAN et al., 1968).

Infine, un articolo recente (CAMPBELL et at., 1971) dimostra la possibilitb di studiarc in coltura il differcnziamento anclie del muscolo liscio : anche in questo caso le cellule si diffcrcnziano scnza fondcrsi, prcsentano i soliti tre tipi di filamenti (quelli di actina compaiono per primi), lianiio polisomi senza relazioni evidenti con i miofilamenti, e quadri di chiusura simili a quelli dei mioblasti cardiaci.

VII. LIVELLI DI REGOLAZIONE DEL DIFFEREn’ZIAilIENTO 3IUSCOLARE

L’idea che la compnrsa di una determinata proteina nel corso del differenziamento dipenda dall‘attivazione, in un pnrticolare momento, dei geni clie controllano la sintcsi dcl corrispondente RNAm, costituisce evidentcmente una semplificazione estrema. La competenza, ciok la poten- zialitg per un dato tipo di differenziazione, cambia nel corso dello sviluppo e si riflette anclie nel tip0 di RNAm trascritto, ma negli organismi superiori i: regolata da molteplici fattori : dalle condizioni del DNA-stampo, dal numero di copie di geni disponibili, dai meccanismi di,trasporto nucleo-bito- plasmatic0 per I’RNAm, dal niimcro dci ribosomi, dallc condizioni clie determinano la vita media dell’RNAm, dalla presenzn di fattori capaci cli attivare i ribosomi, etc. .

Per quanto riguarda il differeiiziamento del muscolo, possinmo distingucrc tre aspctti principali, chc comportano meccanismi distinti di regolazione a livello macromolecolare e clie conviene esaminarc separatamente: a) la cessazione della sintesi del DNA (regolazione della duplicazione) ; 6) le modificazioni della sintesi dell’RNA (regolazione della trascrizione); c) la comparsa delle proteinc del sistema’contrattile e le modificazioni dci sistcmi polisomali (regolazione dclla traduzione). Una discus- sione su questi punti si basa in gran parte sui risultati relativi all0 sviluppo del muscolo embrionale in vivo ; solo da poco infatti si sono corninciati a studiare a livello macromolecolare i meccanismi di controllo dclla mioge- iiesi anche in coltura.

A. Rcgolnzione dclln dii~ilicazioiic

Uno degli enzimi pih direttamente coinvolti nella sintesi del DNA i: ovviamcnte la DNA-polimerasi : nel muscolo dell’embrionc di pollo I’at- tivita dell’enzima diminuisce di 100 volte tra il 100 giorno ed il momento della schiusa (STOCKDALE, 1070). Come in altri sistcmi eellulari, la maggior parte dcll’attivith si ritrova nella frazionc surnatantc ; scparando diverse frazioni cellulari non si ottengono indicazioni di una possibilc segrcgazione della DXA-polimcrasi in qunlchc organu!o ccllulare, clic possano spiegarc la diniinuzionc dell’attivit8 enzimatica. Pcrd a 10 giorni, quando il muscolo & costituito prevalentemente dn mioblnsti clie si moltiplicano, l’attivith B sensibilmente piir elcratn nclle frazioni sedimcntabili ed it pih bassa nella frazione surnatante rispetto a quanto si osserva n 20 giorni, quando invcce prcvalgono le fibre. Cioi., c’i. uno spostamciito dell’attivith enzimatica dallc frazioni chc contengono i nuclei alla frazione solubile, chc si verifica pa- rallelamentc alla fusionc dci mioblasti ed alla ccssazione della sintesi di DNA. Pcrcib & possibile chc si verificlii una migrazione nucleo-citoplasmatica della DNA-polimerasi dopo la fusione, andoga a quella osservata in altri tipi ccllulari in rapport0 alla diminuzionc della sintesi dcl DNA (KEII:, 1965 ; LOEB e FASSLER, 1070).

Non sempre per6 vi B una correlazionc quantitativa tra sintcsi di DNA ed attivith della DNA-polimerasi, per cui la duplicazionc pub non dipendere solo dalla quantith di cnzima presentc. KOKNBERG (1969) ha proposto chc la duplicazionc avvcnga tramitc un meccanismo che richiede I’intervcnto sia della DNA-polimerasi clic di una nucleasi, e si trovano esempi di variazioni cicliche dclla DNasi eon periodi di massima attivith coincidenti con la fase di sintcsi del DNA (SCIIONIIERR ef nl., 1070). Le nucleasi probabilnicnte -partecipano alla regolazionc della sintesi del DNA alterando la struttura dello stampo prima o duraiitc la duplicazionc (p. es. (( aprcndo o i siti clic permettono I’inizio dell’attivith dclla DNA- polimerasi). I n questo caso il livello minimo di DNasi nelle fibre muscolari (STOCKDILE, 1070) potrcbbc rcnderc impossibilc la duplicazione, anche sc la DNA polimerasi fossc ancora prcscnte nel nucleo.

Altri cnzimi coinvolti nella siiitesi dcl DNA prcscntano rariazioiii ncl eorso dcllo sviluppo muscolnrc : per cs. le fosfatasi clic attaccano i nucleotidi con Tdr aumentano nettamentc nella fase in cui prevalgono le fibre (STOCKDALE, 1070). Qucstc fosfatasi intcrfcriscono sill sistema di incorporazione dci precursori utilizzati dnlla DNA-polimcrasi, ma non 6 cliiara la funzionc die svolgono nella regolazionc clella sintesi del DNA dopo la fusionc. Potrcbbero comunquc u niascliernrc o una sintesi residua c ridotta

di DNA da parte dci nuclei delle fibre (associntn per escmpio n fcnomeni cli amplificazionc gcnicn), rendendo difticile la messa in cvidcnza di incorporazione di Tdr csogena. rinclie l’attivi t5 della glucoso-6-fosfato-deidro- gennsi clie intervicne nelln sintcsi del ribosio e dcl desossiribosio, diminuisce brnscamente con lo sviluppo delle fibre (LOVE et al., 1DGD). Inrcce la timidilato-chinasi, piir diminuendo lie1 corso dcl differcnziamento del muscolo, scguc la diminuzionc della sintcsi di DXA con un ritnrdo di 8-0 gg (SCIIOLL ct al., 1DGS).

Pn notato clic in uiuo, per la notevolc asincronia eon cui si vcrificn la formazione dclle fibre, 2. clifticilc ricavare correlazioni precise tra varin- zioni enzimnticlic e particolari stadi differenziativi. In coltura la formazionc dcllc fibre ha luogo in mnnicra notevolnicntc sincronn e In diminuzionc dcll’attivitii specifica del DNA, dopo incorporazione di Tdr-W, risulta ben collcgata alla fase di fusionc dei mioblasti, clie puh esscre anticipata o ri- tardata p. cs. modificnndo l’inoculo ccllularc iniziale (CELOTTI ct d, 1070). L’attivitii della DNA-polimerasi 6 inizialmcnte bassn nclle colturc, forse perch6 I’cnzima vicnc perso o inattivato durante la tripsinizzazione del muscolo, aumcnta nelln fnsc di moltiplicazione dei mioblnsti c diminuisce dopo la fusionc (O’NEILL e ST~~OIIJIAS, 10GD). In una frazione formata da ccllule mononuclcatc l’attivitii della DNA-polimcrnsi risuIta nettamente pih altn rispetto x quella rilerabile in una frazione costituita prcvnlente- mcnte da fibre, nin anchc in qucst’ultimn permane mi ccrto livcllo di nttiritk

La possibilitA di una sintesi residua di DNA dopo la fusionc, disciissa in un prcccdentc parsgrafo, rivcste grandc importanzn perch6 pi16 cssere collegata n fcnomcni di nmplificazione gcnicn csscnziali pcr I’cspressionc dello stato dimercnziato. Forme diverse cli DNA-polimcrasi trovatc nei Bnttcri (Posrrma c CAVALIERI, 1071) c probnbilmente prcscnti anclie negli Eucarioti ( V‘ESTISRGAARD, 1070), possono esserc alla basc dclla duplicazionc selcttiva di clctcrminati gcni, soprattutto quando la duplicnzionc norninle dcl gcnoriin 6 bloccnta, comc avricnc nclla fibra niuscolarc.

Un fcnonicno dcl tutto particolare 6 costituito dnlla ripresa della siiitcsi dcl DNA nclle film muscolari in coltiirn, dopo infezionc con virus oncogcni (I‘AFFE c GEIISIIOS, 10G7 ; FOGEI. e DEFESDI, 1067 ; LEI< ct al., 10G8). Lc fibre sono rcsistcnti nll’infczionc, probabilmciitc per la prcscnza clclln membrnnn bnsalc o per nltrc proprieth di supcrficic, ma la fusionc con un mioblnsto infettnto dcterminn iina riprcsn della sintcsi del DNA locn- lizzata prima iici nuclci piii vicini a1 punto di fusionc, c poi gcnernlizzata n tiitti i nriclci dclln fibra. Sin ncl cnso di virus n DXA (YAFFE c GERSIIOS, 1937) chc di virus a RNA (ILIIGIIS, 1970) riene ripristinata la sintcsi

di DNA cellulnre, che k preceduta dnlla sintesi dell‘nntigcne di superficie (antigene T). In alcuni casi l’infczionc virale induce anche una riprcss della mitosi clic per6 si arrests alla metafase (YAFFE c GERSIIOK, 1967; YAFFE, 19GO), forse per la mancanza di centrioli nelle fibre. Ma B stata avanzata onchc l’ipotesi clie la sintcsi di DNA nelle fibre comprendn parti limitate del genoma ccllulare, essenziali pet la rcplicazionc virale ma insuficienti per una duplicazione completa c quindi per la mitosi (KAIGrrx,

1970). I1 fatto che la ccssazione della sintesi di DNA dopo la fusione sia si-

curamcnte rcvcrsibile, anche sc per cause patologiclie, fa pcnsarc che nella miogenesi normale il fenomeno non dipenda dalla scomparsa o dall’inat- tivazione della DNA-polimerasi o degli altri enzimi interessnti a1 metabolismo dei precursori degli acidi nucleici: tanto pia clie i mioblasti si fondono poclie ore dopo I’ultimo ciclo di sintesi di DNA c portano nella fibra enzimi che con ogni probnbilitj sono ancora attivi, cppure ogni ill- teriore duplicazionc vicnc immediatamente bloccata. Si pu8 formillare I’ipotesi che l’introduzionc di particelle rirali in unn fibrn, realizzata tramite la fusione con un mioblnsto infettato, ripristini quelle condizioni r ipardanti la struttura dello stampo c/o i suoi rapporti con la DNA- polimerasi, che vengono alterate al momento della fusione e dalle qunli dipende la cessazione delln duplicazionc.

fi utile a qucsto proposito sottolineare alcuni nspetti carattcristici dcll’inibizione dn contatto, clie si verifica in colturn particolarmente in alcunc linec cli cellulc di mammifcri stabilizznte. Questa i: carattcrizzata dall’inibizione dei movimcnti cellulari, dalla diminuzionc dclln sintesi di RNA, dnlla ccssnzione dclla sintcsi di DNA c dc11a moltiplicnzione, nccom- pagnatc dn modificazioni iiltrastrutturali, per es. dalla diminmione dci polisomi c dalln condensazione della cromatinn, che sono cvidentemente in rapport0 con I’alterata attivitii metabolica del nucleo (DULBECCO c STOCKER, 1970 ; GAIL c BOOSE, 1071). Le membrane dclle cellule contigue . in certi casi formano rapidamelite giunzioni pnrticolari clie possono limi- tarc il movimento e la divisione ccllulare in maniera meccanica, o anchc in seguito ad interazioni elettrostatichc o molecolari (F~asirax ct nl., 10GD). L’inibizionc del movimento 2 strettamcntc lcgatn alla dcnsith ccllu- Iarc ma lion dipende dalla diminuzionc di o fattori di locomozione D prcsenti ncl terreno di coltura, bensi da propricth clie le ccllule manifestano nl momento del contatto c clic si accompagnano a modificazioni carattcristiche della membrans plasmatica. Per es. il fenomeno di e ruming s, carattcriz- zato dcr produzionc di espansioni supcrficiali, viene inibito e deterniina l’inattirazionc del sistema locomotorio. Fibroblasti trasformati nicdiante

virus oncogcni non presentano il fcnomeno dell’inibizione da contatto, hanno velociti di collisione simile a quclla dci fibroblasti normali, ma I’adc- sione intercellularc t? molto pih dcbole cd instnbilc (GAIL c BOOSE, 1071).

L’importanza che rirestono le interazioni di superficie in questi fc- iiomeni t? dimostrata anelie dal fatto ehe, se si alterano i contatti interccllulari in mod0 clie Ie ccllulc prescntino dclle supcrfici parzialmcnte li- bere, vengono ripristinate sia I’attirith motoria chc quclla moltiplicativa e di sintesi del DNA. I1 segnale per la revcrsione dcll’inibizione sembra dato da modificazioni della membrana plasniatica cIic portano all’attivazione di geni spccifici e poi alla ripresa dei proccssi metabolici c dclla mitosi. DUL- BECCO e STOKER (1970) ritcngono chc l’intcrazionc topografica tra cellula e cellula abbia un effetto inibitorio diretto, realizzato mcdiante spccifici siti di interazione, oppure un effetto indiretto, dovuto all’inattirazione dei siti recettori per i fattori di crescita presenti iicl siero. L’inibizione della sintesi di DNA dipendc da cventi intracellulari che sono controllnti da interazioni tra la mcmbrana plasmntica c fattori diflusibili prescnti ncl terreno di coltura; solo quando le cellule vcngono a contatto si vcrificano modificazioni della mcmbrana e delln permeabilith clie le rcndono sensibili a questi fattori di inibizionc. Si tratta di fattori che agiscono inibeiido la sintesi di RNA, chc precede la duplicazionc dcl DNA c In niitosi (YEII

Anche il fenomeno di stimolazione della sintcsi di DNA c dclla moltiplicazionc in colturc confluenti, provocato da sostanze diverse, t? mcdiato da alterazioni della membrnna plasmatica. Per es. I’aggiunts di sicro fresco a colture chc prcsentano inibizione da contatto, stimola la riprcsa delln divisionc ccllulare, e questa & preceduta da una succcssione cronologica di cvcnti die vanno dall’attivazione preliminarc della sintcsi dcll’RXA, alla riprcsa dclla sintesi protcica, e poi alla sintesi di DNA cd alla mitosi (Cus- SISGIIAN c PARDEE, 1000). La ripresa della sintesi di RNA non dipende da un aumento dclla velociti di sintesi, ma da un eKetto sull’assunxionc dci prccursori (Ur e fosfato), cvidcntcmcntc legato a modificazioni della permeabiliti. L’assunzione dci precursori t? elevata nclle colturc no11 confluenti, diminuisce durante I’inibizione da contatto, ma rinianc alta sc le colture confluenti vcngono infettate con virus oncogcni.

Pcr quaiito riguarda piii dircttamclitc il mcccanisnio dc~~~azionc l-iralc, qunndo ccllulc di renc di topo clie prcscntano inibizionc dn contatto \-en- gono infettate con virus polioma, I’cvcnto iniziale L= rnpprcscntato dnlla sintcsi di RNA per la formazione di un antigene tumoralc di superficie (antigene T). Questo altera le proprietj di membrnnn e fa scnttnrc nltri proccssi chc portano sccondariamcntc all’attivazionc delln sintesi dcl DXA

C FISHER, 1969).

c dclla duplicazione dcl cromosoma ccllularc, ncccssaric per la rcplicazione dcl rirus (\:IL c KARA, 1070). DULBECCO (1070) ha confermato che molte funzioni ccllulari vcngono danneggiatc in seguito all’inattivazionc di particolari fattori localizzati sulla membrana plnsmatica, dove sono accessibili anclic alle grossc molccole prcscnti ncl siero, die esercitnno una funzione sta1)ilizzatricc scnza dover pcnetrarc ncl citoplnsma. L’infczione v i d e modificn qucsti fattori di superficie numcntandone la stabilith cd elimi- nando o riduccnclo la funzionc del sicro. L a membrann plasmatica ha un ruolo non solo nclln morfologia c ncl movimento cellulare, ma nclla so- pravvivcnza, nella mitosi c iiclla catena di reazioni chc rcgolano la sintcsi dcl DXA; I’induzione dclla sintesi di DXA ccllularc da partc dcl virus non sarcbbe clic un ancllo di una catcna clie coinvolgc altrc funzioni cellulari c clie sembra dctcrminata inizialmentc dn modificazioni dclla strut- turn dclla menibrnna c dclla sua pcrmcabilith.

Per tornarc alle modificazioni che carattcrizznno il differcnziamento inuscolare, si puh ritcncre cIie i mioblssti si muovano e si moltiplicliino at- timmcntc fintantochh i rcccttori situati sulla mcmbrana plasmatica sono nclln condizionc di esscre nttivnti dai fattori prcsenti ncl tcrrcno di coltura. Qualido i mioblasti rengono a contntto tra loro o con altrc ccllule, i rcccttori vcngono bloccati e la sintcsi di DKA e la nioltiplicazionc sono inibitc. Sc i rnpporti topografici tra i mioblnsti sono ndatti, si rcrifica la fusionc, altrimcnti i mioblasti rcstano mononuclcati. In cntrambi i casi si vcrificn la ccssazione dclla duplicazione clic dipcndc innanzitntto da modificazioni dcl DNA-stampo. Altcrazioni anchc grossolanc dclla fornia c dclln struttura dci nuclei, con aumento di condcnsazionc della cromatina, si asscrvano ncl corso dcllo sviliippo muscolarc, soprattutto durantc la fusione cici mioblasti cci il successivo di~crcnzianicnto d c h fibrc (XtncrroK c WOLFF, 1968 ; F~scrnras, 1970). Tali modificazioni lion clipendono dallo stato di contrazionc dclle fibre, m a sono in rapport0 eon variszioiii dclla conccntmzionc ionicn intracellulare (FIMXK~. c SCIIISKO, l Z ) G D ) , e possono C S S C ~ C provocatc dn variazioni dclla struttura e della permesbilith dclla mcnibrana pltisniatica iiel moniento in cui si stnbiliscono i contatti tra i mioblasti (0 tra mioblasti c cellulc ctcrotipiclie).

Modificazioni dell’ambicntc ionico hanno indubbiamcntc una grandc influcnza sulla struttura c sull’attivith di duplicazione c di trascrizione dclla cromatina nuclearc, perclih ne regolano il grado di condcnsazione c pcrclie confcriscono spccificith alle intcrazioni tra DNA c proteinc basiclic (LEZZI, 1070). Ncdinntc mcccanismi di questo gcncrc, nci mioblasti si pui, rcrificarc un arrcsto dcl ciclo di dcspiralizzazionc clcl DNA in G 1, gih ncl momcnto in cui si stnbiliscono i contatti interccllulnri e quindi prima della fusionc

vera c propria. Dopo la fusione, I’inibizione dclla sintesi del DNA rcrrcbbc stabilizznta in conscgucnza di modificazioni di struttura dcllo stamp0 (per cs. inattirazione dei siti d’inizio dclla duplicazionc) c /o dell’altcrn- zionc dci rapporti tra stampo e DNA-polimerasi (per cs. migrazionc dcl- l’cnzima nel citoplasma), ma probabilmentc non per l’inattivazionc o per la riduzionc delh sintesi dcgli enzimi intcressati a h duplicazionc. 12 vcro che le variazioni dcll’ambicnte intraccllulare prorocano anclie una rcstri- zione dclla trascrizione : anzi il prinio aspetto macromolecolare dell’inibizione da contatto b rapprescntato proprio dalla diminuita sintcsi di RNA. Lc variazioni dell’attivitj degli enzimi coinvolti nclla sintcsi del DNA, che si osservano lie1 corso del diffcrenziamento muscolarc, possono dunquc riflcttcrc sempliccmente la diminuzioiie gcnerale dclla sintesi di RNA.

La a riattivazione D dei nuclei dclle fibre dipcnde da modificazioni in- verse n quellc appena schematizzatc, clie sono provocate da alterazioni dclla membrana plasmatica xicl corso dclla rigcncrazione in viuo, oppurc quando le fibre vcngono tripsinizzate e dissociate per allestire colturc c subcolture. I n questi casi, come nclla reversione dcll’inibizionc da contatto, la ripresa dclla sintcsi di DNA dovrcbbe essere preccduta da sintesi di RNA, cioi: dalla rinttivazione preliminare della trascrizione. Cib i: stato dimostrato per lo meno per quanto riguarda la ricostituzionc dci mioblasti a partire dai nuclei dcllc fibre (LEVIS et nl., 1071a).

Riassumcndo, anche la riprcsa dclla sintesi di DNA nellc fibre infettate con virus pud csserc attribuita n modificazioni iniziali della permca- lilith, simili a quclle clie i T-irus determinano $11 ccllule sottopostc ad inibizione da contatto. ScnonchC ncllc fibre In condizione si rcalizza solo per il tramitc dclla fusioiie con mioblasti infettati, cvidcntemcnte irisensibili ai mcccanismi che normalmentc inibiscono la sintcsi di DKA dopo la fusione. 2 probabile chc questi mioblasti portino nclla fibra i fattori chc se- condariamentc determinano la riprcsa dclla sintcsi di’ DNA anclie iici liu- clei gi8 fusi.

13. ltegolaziorzc dclln frmcriziortc

Un approccio allo studio dci meccanismi clie rcgolano la trascrizione nello sviluppo muscolarc &we partirc dall’analisi dcllc variazioni quantitative c qualitative dell’assunzionc dci precursori dcll’RNd, dclla sintcsi dci divcrsi tipi di RNA, dcllc funzioni dci vari cornponcnti dcl sistcma di tr‘ascrizionc.

I nuclei dclle fibre in coltura risultano niolto mcno marcati, dopo incubazione con Ur-311, rispctto ai nuclei dci mioblasti (YAFFE c FUCIIS, 1967). I1 fcnomeno non dipcnde da divcrsa pcrmcaliilit8 a1 prccursore o

da differciize del 4 pool fi nucleosidico intracellulare delle fibrc c dei mioblnsti FUR^^ e CELOTTI, 1071), bensi da una diminuzione effettiva della sintesi di RNA dopo la fusionc. Si tratta con ogni probabilit5 di una riduzione della sintesi di RNAr eom’it provato ddla minore sensibilitk al- I’actinomicina dclle fibre, rispetto ai mioblasti mononucleati (YAFFE e FELD~IAW, li)G4), dalla diminuzione dell’attivit8 specifica dell’RNA macromolecolare (prevalentcmentc RNAr) dopo la fusione (CELOTTI ct al., 1070)’ dal minor turnover dci ribosomi n e k colturc differenziate rispetto a qt~ellc formate prevalcntementc da niioblasti (NORSE et al., 1071). La diminuzionc dclla sintesi di RNAr subito dopo la formazione clelle fibre i? tanto pih sigiiificatira, se b vero chc, proprio iielle coppie di mioblasti impegnati nel processi di fusione, il contcnuto in RNAr it niaggiore rispetto ai mioblasti clie non lianno coniinciato a fondcrsi (Ross et nl., 1070). Per- cib i processi metaboliei che accompagnano la fusione dovrebbero esserc caratterizzati da un aumento della sintesi di RN&, mentrc subito dopo In fusione detta sintesi vienc sicuramcnte ridotta.

Variazioni dell’incorporazioiic di Ur-3II ncl corso dcllo sviluppo muscolarc sono state osscrvcrte aticlic in vico (NAncrIocq 1066) : nell’embrione cli pollo si ha una diminuzionc niolto nctta della sintesi di RNA in corrispondenza dcl period0 in eui si formano le fibre, e la marcatura dei nuclei dei mioblasti it scnipre maggiore rispetto a quella dei nuclei delle fibre. Le modificazioni di nspetto del nuclco e del nucleolo nel C O ~ S O dello sviluppo dclle e e h k muscohri (MAI~CHOK c WOLFF, l0G8 ; RSCIIMAN, 1970 ; S~IETASA et nl., 1970) fanno pcnsare che, anche in uiuo, dopo la fu- done venga ridotta prevalentemente la sintcsi di RNAr. rinchc I’incorporazione di P32 nell’RNAr dei polisomi diminuisce man mano che aumcnta il differcnziamcnto del muscolo (I~EYWOOD c N\VAGWU, 1000):

In realtj maneano informazioni precise sulk rariazioni dclla sintesi dei dirersi tipi di RNA 1x1 corso della miogcncsi ; alcune indicazioni possono esserc ricavatc indirettaniente in base ai dati sull’nttivith dci nuclei isolati in vifro (la muscolo il; fasi diverse dell0 sviluppo, c sulle proprietii della RNA-polimerasi ( J ~ A I ~ C I I O K e WOLFF, 10G8 ; IIERRMAXN el nl.,’ 1070). Le variazioni di attivitii dclle RNA-polinierasi JLg2+- e Mn2+-dipendenti, confermano clic nella fase in cui il muscolo it ricco di cellulc mononucleate si ha sintesi prevalente di RNAr, mentre quando prcralgono Ic fibre polinuclcatc la sintesi di RKrlr diminuisce c prcvale la sintesi di un RNA simile a1 DNA per composizionc in basi (RNAm ?). La sintesi coinplessiva di RNA climinuisce ncl corso del differcnziamcnto e, dato che diminuiseono sia In RNA-polimcrasi solubile clic quclla associnta alln cromatina (MAR- cxioK, 1070)’ il fenomcno xion dipendc da una minorc solubilizzazione dcl-

l’enzima ma da una diminuzionc effettiva dell’attivit& c/o della concentrazione della RNA-polimerasi.

I1 significato dellc diverse forme di RNA-polimerasi trovate nel muscolo resta da chiarirc ; RNA-polimcrasi clie diffcriscono per il tip0 di DNA-stampo o di condizioni ioniche richiesti, per la localizzazione, per le condizioni di solubilizzazione, per il tipo di inibitori ctc., sono state identificatc in sistcmi cellulari divcrsi (ROEDER c RUTTER, 1970 ; HORCEN e GRIFFIN, 1071 ; CIIELALA et al., 1971). La possibilitii clie lc diverse RNA- polimerasi svolgano una funzione nclla diffcrcnziazionc, per es. selezionando i tratti da trascrivere, non b dimostrata. Tuttaria nei Battcri altcrazioni strutturali della RNA-polimcrasi sono associate ad un fcnomeno simile alla diffcrenziazionc, cioh a1 passaggio dalla fase vegctativa a quella .di sporulazione (LOSICK et nl., 1970) ; anche la forma delle spore pu6 csscrc altcrata in rapporto a modificazioni della RNA-polimerasi (Do1 et al., 1970).

Ma anchc R questo proposito (come ncl caso clei rapporti tra duplicazionc e DNA-polimerasi) va dctto clie non senipre le variazioni dclla sintcsi di RNA sono direttamcntc imputabili a variazioni dcll’attivitti o del lirello della RNA-polimerasi. Altre possibilitj non possono essere scartate R priori : per es. modificazioni della disponibilitj dello stampo, variazioni dell’attivith della RNasi, prcscnza di inibitori della RNA- polimerasi o di cnzimi chc intcrferiscono sul metabolismo dei precursori dcll’RNA. Per es., BREUER c FLORINI (10GG) hanno suggerito che l’aumcnto della sintesi di RNA ncl muscolo ad opera dcl testosterone dipcnda da una modificazionc dclla capacith di stampo del DNA, mcntre l’aumento provocato dalla somatotropina sarcbbe dovuto ad unn alterazione della RNA- polimerasi stessa (FLORISI c BREUEII, 19GG). Le variazioni dclla sintcsi di RNA durantc il diffcrcnziamcnto muscolare possoiio anclic essere corre- late con un aumento delle frazioni di istoni ricclii in arginina (BOPFA e VIDALI, 1971). In ogni caso esse sono in rapporto con modificazioni di struttura dcl DNA-stampo provocatc dallc nltcrazioni della permeabilitii della membrana plasmatica e delld concentrazionc ionica intraccllularc, discussc nel paragrafo precedentc.

C. Regolazione delln iradii-* *lone I1 controllo della sintcsi proteica a lirello di traduzionc pu6 dipen-

dere cla fattori divcrsi : dalla stabilith (vita media) dcll’RXAm, dalla SUR

capacitii di legarsi con lc subunit5 ribosomali (inizio della traduzione), dalla vclocith di lettura (allungamcnto dellc catene polipeptidichc), dalla libcrazione dellc molccolc sintctizzatc dai coinplessi polisomali.

Negli Eucarioti la vita media dell’RNAm b in gencrale pih l u n p che m i Batteri (alcunc ore inrece chc poclii minuti). Ncllc ccllule indifferenziate, la cui condizione pub esscre confrontata con quella dei nattcri nelln fase di crcscita csponenzinle, I’attivitj genica I! sottoposta ad unn regolazionc notcvolmente flessibile che si realizza prevalentemente tramite un controllo a livello di trascrizionc, accompagnato dn un turnover rclativamente rapido dcgli RNAm ; invece nelle cellule differenziate, come nei Battcri durante la sporulazionc, il controllo avviene prevalentcmente a livello di traduzionc c l’espressione stabile di particolari geni si nccompagna alla sintesi di RNAm a vita media relativamcntc lunga.

Nella dogcnesi in coltura I’esistenza di RhTAni a vita lunga & stata proposta per spiegare sia la stabilitir della deterniinazione, per es. il fatto che cellule relativanientc indiffercnziate come i miobIasti possono moltiplicarsi indefinitamcnte conservando pcrb la capacitg di fondersi e di formare fibre muscolari (YAFFE, 1968) ; sia perch6 I’csprcssione dello stato differcnziato (sintesi delle proteine contrattili) 6 accompagnata dn una nctta diminuzione della sintcsi di RR’A (COLEJIAN e COLEMAN, 1968 ; CE- LOTTI et al., 1070). Effettivamentc, colture fqrmate da mioblasti in moltiplicazionc dcgcnerano rapidamentc se trattntc con dosi di actinomicina chc inibiscono la sintesi di RNA ; anclic nelle colture pih avanzate le cellule mononucleate degencrano, mcntre le fibre differenziate resistono per parec- chic ore a1 trattamento. L’effctto lion i: dovuto ad una divcrsa permeabilith all’inibitorc : con tccnichc nutoradiografiche 6 stato osservato chc m i mioblasti si ha inibizione istantanea sia della sintesi di RNA che di quella protcica ; anche nelle fibre cessa istantancanicntc In sintcsi di RNA, mentre la sintesi proteica pub ancora continuare per un certo tempo (YAFFE c FELDMAN, 1964).

La possibilith che le fibre niuscolari conscrrino le lor0 propricth morfologiche e funzionali, anclie in assenza di sintesi cs novo di RNA, pcr In prescnza di una frazione stabile di RNAm non i: stata pcrb confermata mediantc tccniclie biochimiche pih prccise. COLEMAS c COLESIAX (1968) non hanno osscrvato alcuna particolare rcsistcnza delle fibre a1 trattamcnto con actinomicina e dai loro dati risulta clie la sintcsi protcica b inibita dc11’80-00% entro 16 orc dal blocco della sintcsi dell’RNA, sia nci mioblasti che nelle fibre. Bnchc il profilo polisomale del niuscolo differcnziato b vivo risulta alterato dopo 20-24 ore dnll’inibizione della sintesi dcll’RNA (Scow e,BEr&, 1964). Lc diffcrenzc sono in parte dorutc a1 fatto.clic i mioblasti di ratto usati da YAFFE e quclli di pollo inipicgati da COLESIAS sono di- vcrsamente sensibili all’actinomicina, com’i: diinostrato da uno studio cam- parato degli cffctti dell’inibitore sui due tipi di colture (FURLAN c CELOTTI,

1971). Tuttavia in entrambe le specie si osserva una sintesi residua di proteine, dopo inibizione della sintesi di RNA, simile, per entith e per durata, nei mioblasti e nelle fibre (CELOTTI et nl., 1071). Cib significa che la vita media degli RNAm corrisponde m i due tipi di cellule muscolari.

k dimostrato che RNAm di diversa stabilitii possono coesistere nello stesso citoplasma e che nelle ccllule differenziate solo quelli che caratterizzano lo stato differcnziato sono pnrticolarmente stabili ( KAFATOS c REICII, 19GS). I dati relativi agli effetti dell’actinomicina sulla miogenesi in coltura dimostrano percib che andlie i mioblasti svolgono funzioni spccializzntc e che gli RiYAni sintetizzati dopo la fusione sono simili, in quanto a sta- bilit8, a quelli presenti in altre cellule differenziate.

Indicazioni pih precise sulla stabilitii, degli RNAm spccifici per le proteinc contrattili sono state ottenutc in colture di mioblasti cardiaci (JIc CARL e S I r A m R , 1969) : in questo caso I’inibizione della sintesi dell’RNA provocata dall’actinomicinn, inizialmcnte stabilizzn o addirittura esalta il carattere differenziativo (per cs. provoca la ricomparsa dell’attivith contrattile sc i mioblasti erano u sdifferenziati a). Analogamente in cellulc pi- gnientate in coltura, trattate coil dosi di actinomicina cIie inibiseono pra- ticamente del tutto la sintesi di RNA, si osserva un aumento della sintesi di melanina e dell’attivith della tirosinasi (WHITTAKER, 19GS), cio6 di quei caratteri diffcrcnziativi i cui RNAm sono relativamente stabili (hanno una vita media di 12 .ore, simile a quella trovata per Ic ccllule mmcolari in coltura). I1 fenonleilo pub essere spiegato sulla base di meceanismi di reprcssione e di de-reprcssione proposti per i mioblasti cardinei (JIC CARL e SIIALER, l9G9 ; SIIALEI~ e ,\Lc CARL, 1971), ma clie risultano particolarmcnte complicati. Gli RKAm stabili oppure i loro prodotti, ciob le proteinc contrattili, dovrcbbero esscre inibiti da rcpresssori la cui sintesi dipende da RKAm a vita breve; bloccando la sintesi di qucsti ultimi mediante I’actinomicina, si verificlicrcbbc la de-repressione della sintesi o della traduzione degli RNAm stabili.

JLa si pui, proporre un altro meccanismo, clie ha il vantaggio di essere molto pih seniplice, in cui la regolazione dell’esprcssionc fcnotipica dipelide in ultinia crnalisi da una competizionc dei diversi RXAm a livello di traduzionc. Lo a sdifferenziamento a, che si accompagna a sintesi dcllc proteine c essenziali a, pub dipendcre dalla traduzione prcferenzialc dei relativi RNAm a vita breve, in seguito a diffcrenze quantitative a livcllo di trascrizione c/o di traduzione. In questa situazione, gli RNAm a vita lungn per Ic proteine G di lusso 9 vengono egualmente tradotti, ma i carattcri differcnziativi no11 vcngono cspressi perchi: quantitativamente svantaggiati rispetto ai caratteri u essenziali )). Una modificazionc della sintcsi dell’RNA,

per es., l’inibizioiie provocatn dall’actinomicina, altera In competizionc t ra i due tipi di RNdm e pub spostare l’equilibrio a farore degli stampi a vita liingn, detcrminando cosi la coniparsa dei caratteri differenzia- tiri.

In effetti, sin nei condrociti (LASIIER, 1071) clie nelle cellule pigmentate in coltura (WIIITTAKER, lDGS), lo (( sdiffcrenziamento o 6 comunquc nccom- pagnato da sintesi a livclli minimi dclle protcine (( di lusso )). Nel muscolo, come si i: insistito piii volte, In prcscnza di piccole quantith di proteine contrattili, per cs. nci mioblasti sclieletrici prima dclla fusione oppure in quelli cardiaci (( sdifferenziati D, pub lion cssere rilevabile per i limiti di sensibilith dei metodi a disposizionc.

Sono gih stati presi in csamc altri mcccanismi di rcgolazione clie possono coiicorrere con quell0 ora proposto, per es. modificazioni alln duplicazione (amplificazione dei gcni per il differenziamento) e alla trascrizione (sintesi prcferenzialc degli stampi pcr le proteinc contrattili). Una regolazione basata su diffcrenze qualitative oltrechC quantitative, ovvia- mcntc 6 possibilc aiichc alla traduzione, come risulta dai lavori ormai classici di IIEYWOOD, che ha seguito ncl corso dello sriluppo del muscolo in vim In comparsa dei polisomi per le protcine contrattili, lie ha isolato gli RNAm corrisponclenti ed lin identificato alcuni fattori responsabili del- I’inizio delln traduzione.

Utilizzando muscolo embrionalc, clie prescnta bassi livelli di RNasi c polisomi prevalentenicntc non associati allc membrane, si possono isolare complessi formati dn 55-70 ribosomi, spccifici per la sintcsi dclla niiosina (HEYWOOD ct nl., 10G7). Nel muscolo di embrioiie di pollo di 14 giorni, oltre a questa classe di polisomi pesanti, si rinvcngono polisomi formati da 20-30 unith responsabili dclla sintcsi dell’actina, e polisomi pih lcggeri (4- 10 unith) che sintctizzano prevalcntcmcnte tropomiosina (HEYWOOD e RICII, 10G8). I polisonii pih pesanti sintetizzano solo la subunith maggiore della miosina (p.m. 200.000), il cui RNAm 6 monocistroiiico (HEYWOOD e NW’AGWU, 10G8) ; la sintesi d c l h subunit& minore (p.m. 17-35.000) & regolata da un diverso RNAm, pure csso mo~iocistronico, associato a polisomi leggeri formati da 4-0 unith (Lorn ct aZ., 1971).

I polisomi per la subunith maggiorc delln niiosina aunicntano nel eorso dello sriluppo muscolare parallclamcnte all’aunicnto dclle fibre. La velocith di traduzione calcolats sulla base dci dati ottenuti nei sistemi i n viiro (I~ERRJIAKN et al., 1970) i: in accortlo eon quclla trovata in base ad un’analisi del ciclo dei ribosonii ncl muscolo embrionalc di pollo (ICABAT e RICII, 10GD), e corrispondc alla vclocith di traduzione calcolata ariche per altre molccolc proteiclie.

h importante stabilire se gli aspetti del differenziamento chc vengono presi in esame, in questo caso la comparsa clelle diverse proteine dcl sistema contrattile, costituiscono un insiemc omogcnco, cio& se si tratta di eventi clie compaiono e si modificano in manicra tra di loro simile; oppurc sc ciascuno prcsciita un particolare andamento nel corso dello sriluppo. Nel primo caso si pub pensare ad un meccanismo di controllo comune, n livello di trascrizione elo di traduzione. ;\la se inrece esiste un coordinamento temporale tra i diversi eventi, per esenipio sc le proteine del sistema contrattilc compaiono in un ordine spccifico lie1 corso dello sviluppo dclla fibra e sono fra di loro in rapporti quantitativi ben determinati, si pub anche immaginare un sistcnia in cui il livello di una data pro- tcina regola la tappa successiva. I n base ai dati di microscopin elettronica (F~sc~nras, 1070) cd ai profili polisomali (HEYWOOD e RICII, 1908), questo sembra appunto il caso dcll’actina, dclla miosina e della troponiiosina die ncl corso dclla miogcncsi compaiono ncll’ordinc indicato, chc vcngono sintctizzate ad opera, di RNAm monocistronici, e chc fra di loro hanno rapporti quantitativi ben dctcrniinati.

Pcrb non 6 noto il meccanismo con cui le protcine neosintetizzate, o Ic loro subunit& polipeptidiehe, polimerizzano e si associano nell’ordinc carattcristico in cui si ritrovano nei sarcomeri maturi. In generale a1 microscopio elettronico, pur csscndo possibilc riconosccrc i grossi complessi polisomali clie sintctizzano la miosina, i polisomi non appaioiio in rapporto n6 eon i niiofihmenti n6 con le miofibrillc. solo LARSOS et nl. (10GO) hanno osscrvato -polisomi associati alla banda A cd lianno proposto che i filamcnti della miosina si allunghino quando i monomeri sono ancora associati ai ribosomi ; ma in questo caso si tratta di polisomi di dimensioni re- lativaincnte modestc ed i. poco probabile clie cssi siano idcntific a b’l’ I I con i grossi eomplcssi respoiisabili delIa sintcsi dcIh miosina. Invccc II~rwooD (1070a) ha osservato che se i polisoini delh iniosina vciigono trattati con RNasi, si formano molti dimeri oltre a ribosomi liberi, ed lia suggerito chc cib sia in rapporto col fatto clie due subunit& polipeptidiche adiacenti possono nssociarsi prima di liberarsi dal coniplesso polisomale.

Fenomeni di questo tipo possono avere, come si & dctto, una grande iiiiportanza ncl regolarc la succcssionc della comparsa sia delle diverse protcine contrattili, sia delle diverse subunith di m a stessa molecola. Un’idea dclla complcssith dei fattori die possono concorrere ad una regolazione di questo tipo si pub ricarare dal confronto con quanto avviene nella sintcsi dell’emoglobina (cf. PAUL, 1968). In questo caso esiste una sostanza (cri- tropoietina) chc stimoh particolari ccllulc derivatc dal sistcma emopoietico. .a sintetizzare cmoglobina, probabilmente indticendo la formazionc cli un

RNAm a vita 111qa. JIa la vclocitg di sintesi dell’emoglobinn dipcnde anchc dalla presenza di eme che 6 a sun volta controllata dnlln disponibilith, c quindi dalla sintesi, del silo precursore, l’acido 6-aminolerulinico. e molto probabile clie I’eme si associ alle singole cntenc polipeptidiclic dcll’emoglobinn man mano clie questc vengono sintctizzatc c clie ne detcrmini il distacco dai polisomi. Percib, nonostante un ormonc specific0 intervengn nel regolare le prime tappe della sintcsi dell’cmoglobina, qucsta I: anclie con- trollatn, a livello di traduzione, dalla disponibilitj di nltri composti chc contribuiscono a formarc la complessa molccols finale.

Nel muscolo, I’identificazione di una categoria bcn precisa di polisomi intcressati alla sintesi della miosina ha anclie pernicsso di isolnrnc e carattcrizznrne I’RNAm. Questo 11s un p.m. che corrisponde a quello teorico per un polinucleotide responsebile della sintcsi delln subunit8 maggiore della miosina ; purificato ed usato in un sistema in vitro csso determina I’incorporazione di aminoacidi in una proteina che ha molte delle proprietj specifiche di quella subunit8 (HEYWOOD c NW~~CIYU, 1969). I1 sistema offrc la possibilith, finora forsc unica, di annlizznrc i meccaiiismi di sintesi, di trasporto e di attirazione di bcn determinati RNAm in fasi diverse del differenziamcnto, e pui, contribuirc a fornire un quadro complcto c precis0 del controllo dcllo sviluppo muscolarc sia a livello di trascrizionc che di traduzione.

Un primo risultato n questo riguardo i: offcrto dall’osserrazione clie anclie ribosomi eterologhi, purificati da reticolociti di.pollo, sono in grado di sintetizzare niiosina in prcscnza di RNAm ottenuto dai polisomi dcl niuscolo ; B perb nccessario privare i ribosomi dei rcticolociti di particolari fattori protcici, dissociabili a forze ioniclie elcvatc, c aggiungere fattori analoghi ottenuti dai ribosonii dcl muscolo (HEYWOOD, 1069). Questi fattori, simili n quclli trovati nci sistemi bnttcrici, dctcrniinnno I’interazione tra 1’RNAm c la suburiith ribosomalc minore e sono quindi responsabili dcll’inizio della traduzionc (HEYWOOD, 1970s). L’RNAm della miosina c quello della tropomiosina si Icgano ai ribosomi anche ctcrologhi solo in prescnzs dci u fattori d‘inizio ottcnuti dai ribosomi niuscolari, ma anclie 1’RNAm dell’cmoglobina pub lcgarsi ai ribosonii muscolnri (privati dei loro fattori d’inizio) se sono presenti i fattori ottcnuti dai ribosomi dci rcticolociti (HEYWOOD, 1070b).

Questi fattori, clie IIEYWOOD ha identificato con dei polipeptidi e chc ha scparato in tre frazioni, sono dunque spccifici per un dato tipo ccllu- lnre. Essi dctcrminano il ricoiioscimcnto dcgli R N h i da parte dci ribosomi omologlii c svolgono un ruolo cssenzinle ncl diffcrenziamcnto in quanto, sc vengono sintctizzati in Inomenti particolari dello sviluppo, possono

controllarc I’inizio della traduzione di dcterminati RNAm c quindi regolarc l’esprcssionc di un dato carattcrc diflcrenziativo. Un controllo di questo tipo, rcalizzato attravcrso la sintcsi di fattori di inizio c I’attivazionc dei ribosomi, c clic porta ad una stimolazione della sintcsi protcica, pro- bnbilmentc si vcrifica nel muscolo nci opera dell’insulina (cf. HERRNASN

JIa c’2: anclie la possibilita clie i fattori d’inizio ribosomali siano specifici, in uiia stessa cellula, per dcterminati RNAm ; in questo caso il loro ruolo nclla stabilizzazione del differcnziamento risultcrcbbc ancora maggiorc, pcrc‘lib potrcbbcro liniitarc in ogrii istante il tipo di proteinc sintetizzate, selezionando i divcrsi RKAm prcscnti.

La possibilit& di utilizzarc colturc di cellulc muscolari pcr atliontare problcmi relativi a1 controllo delln sintcsi dellc protcinc contrattili 2: stata sfrnttata solo inolto rccentcniente. Sono stati ottcnuti profili polisomali simili a qiiclli osscrvati in v i m cd 2: stato dimostrato che i polisonii per la miosina sono prcscnti ncllc colturc con fibre polinuclcatc, cioi: compaiono solo dopo In fiisionc dci mioblasti (;\IORSE ct nl., 1071). Data la possibiliti di scguirc mcglio la sintcsi dei dircrsi RNA durantc lc fasi della-miogenesi in coltura, pcr il niiglior sincronismo con cui queste si susseguono rispctto d o sviluppo iu uico, clovrebbe csscre possibilc stnbilirc sc la sintesi delln itiiosina c dellc altrc protcinc contrattili clipcnclc dn unn attivazionc dci gcni corrispondcnti, clic si vcrifica solo dopo la fusionc, cioi: da un controllo qualitativo dclla trascrizionc ; oppurc sc 6 in rapporto con I’attivazionc dci ribosomi c eon la selczionc di particolari RNAm, cia; con un controllo dclla traduzionc sul tipo di qucllo g i i discusso.

In colturn 6 nnclic possibilc analizzarc con rclativa facilitj il lire110 n cui agiscono fattori clie intcrfcriscono sulln miogencsi. Per es. si lia uiia pcrdita del 50% i n ribosomi c polisonii qunndo il miiscolo vicnc dissociato per allestirc Ic colture, e profdi polisomali alterati carntterizzano anche lc primissinie fasi della miogenesi in vitro (HOSICK e STROIIMAK, 1971). Evitlcntcmcntc questc alterazioni so110 in rapporto con gli cflctti delln tripsirin sulle ccllulc muscolari c spiegano perch6 6 generalmcnte neccssario 1111 pcriodo di maturnzioiic c di nioltiplicazione prima clie i mioblasti siano in grado di fondersi in colturn. In seguito, la pcrcentuale di polisonii nuniciita niolto rapiciamcnte, prima clic si abbia sintcsi cs novo di RXAr, c dopo 1s fusione non si ha pih aumcnto dci ribosomi, mcntre la pcrccntiialc di polisomi rispetto ai ribosomi libcri apparc eccczionalmcntc ck!vata sc confrontata a qunnto si osserva i l l vico (IIOSICK c STROIIJIAS,

1971 ; NOILSE el d., 1071). II trasfcrimcnto di colturc difkrcnzintc cia un tcrrcno complcto ad

ct nl., 1970).

uno pih povcro provoca una rapids dissociazionc dci polisomi in monomcri, che 5 rcversibile anche se si inibisce la sintesi c s novo di RNAr (IIOSICK e STROIIMAS, 1971). Xcntre nel muscolo in uiuo i monomcri rapprcsentano una riserva di subunith che vcngono utilizzatc ncl ciclo polisomalc, e l’esclusionc di ribosomi da una partecipazione dirctta a1 ciclo rappresents un meccanismo importante per la differcnziazione (KABAT c RICH, lOGO), sembra dunque chc in coltura, in situazioni caratterizzate da un adatta- mcnto a condizioni nutritivc scmplificate, si vcrificlii un ciclo diretto di dissociazione-riassociazione tra polisomi e ribosomi.

In base a differenze di questo tipo sarh forsc possibile chiarire un ultcriore meccanismo di rcgolazione della traduzione, basato sull’csistcnza di fattori clie ncl corso dclla miogcnesi in uivo dcterminano la rapids ricostituzionc dei ribosomi a partire dallc subunith ribosomali prima che queste si associno agli RNAm, e clie portano quindi alla formazione di un (( pool )) cli ribosomi inattiri per la sintcsi delle proteinc.

VIII. coscLusIosI

Ncll’esnminare i divcrsi aspetti dello sviluppo del muscolo in coltura si t? cercato, per quanto possibilc, di fornirne un’interprctazione basata sul principio clie il diffcrcnziamcnto ccllulare t! costituito da una successione di modificazioni qualitative c quantitative cli sintcsi macromolecolari. Tencndo presente qucsta impostazione, possiamo or8 rivcderc in manicra molto scliematica Ie varie tappc della niiogcnesi, indicando le principali carcnzc sperimentali clie nc impediscono una corrctta interpre- tazionc. Sarii quindi possibile stabilire il contributo clie un sistcma particolare qual’h il muscolo in coltura pub e potrii fornire alla conosccnza dci meccanismi gencrali clie regolano il differenziamento.

Senibra suficientemente p ron to chc non esiste un singolo cvcnto a critic0 )) da assumcre come causa di un process0 complesso quale il differenziamcnto mmcolare. L’idca di una mitosi a critica 8 Sara anclie eficace per sclicmatizzare le differenze tra due fasi cosi diverse quali la moltiplicazione dei mioblasti ed il differenziamcnto dcllc fibre, ma non dice assolu- tamcntc nulla sui mcccanisiiii inolecolari clie detcrininnno le diffcrenzc in qucstione. Esistc invccc una scrie coordinnta di eventi (( critici D, ciascuno dci quali puB csscrc detcrmiiiantc pcr la tnppa succcssiva, clalla quale vicnc cventunlmcnte dissociato mcdinnte intcrfcrenze di tipo divcrso. La possibilith di individuarc la natura di tali intcrfcrcnzc e di risalire, anclie se in manicra spcsso ancora approssimata, nl loro mcccnnismo d’azione,

B scrvita a cnrattcrizzarc alcunc fasi del diffcrcnziamento muscoIare, cllc possono essere cosi schcmatizzate.

1) La maturazione e la moltiplicazione dei mioblasti in colturn Sono in rapport0 alla neccssith clic nc vcnga ricostituita l’integrith strutturalc e funzionalc, alterata dai trattamenti usati per dissociare le cellulc. Si tratta in particolare di ripristinare quelle proprieth di supcrficic chc rcndono possibile il process0 di fusione e che sono specifiche, in quanto il riconoscimcnto avvienc esclusivamente tra inioblasti scliclctrici e si verifica in una fasc beu precisa del ciclo niitotico. Ma il carattere diffcrenziativo dei mioblasti B gih determinato in v i m , ncl moniento in cui lc cellule vcngono prclcvate pcr csscrc messc in coltura. Anchc sc non i: possibilc individuare paramctri biochiniici o iiltrastrutturali esclusivi per il mioblasto, esso svolgc coniunque funzioni spccializzatc chc si concludono con la fusionc ; tali funzioni sono mediate da RKAm a vita mcdia rclativamcnte lunga, analoghi a quclli esistenti in cellulc differenziate. 3) La determinazione dei caratteri tliflercnziatiri Z: cccezionalmcnte stabile ncllc ccllulc muscolari in coltura : essa vicne conscrvata anclic dopo un numero molto clcvato di divisioni ccllulari c non pub quindi dipendcrc da RNdm a vita lunga sintetizzati nclle fasi iniziali del period0 moltiplicativo. 0 questi RNAm vengono prodotti continuamente, ma ne viene impcdita I’esprcssione ; oppure la loro sintcsi I! successira alla fusionc. Viceversa l’cspressione fcnotipica dei caratteri diflcrcnziativi 8 estremamentc labile. La maggior partc dei fnttori chc intcrferiscono sulla nianifestazionc del differcnziamento, agiscono inibcndo la €usione mediante modificazioni delle proprieth di mcmbrana c quindi dellc interazioni ccllulari. dlcune interfercnzc si vcrificano nnchc normalmcntc tra i dircrsi tipi cellulari prcscnti ncl muscolo e confcriscono a qucsto sistcnia un’elevata capncitj di autorcgolazione. 8 ) La fusione, c quindi la niultinuclearith, sono lc condizioni chc normnlmcnte rendono possibile la manifestazionc dci caratteri differcnziativi, ma non iic rapprcscntano 1111 rcquisito cssenziale dato chc anche mioblasti mononucleati possono diffcrcnziarsi. Coiidizione esscnzialc & la ccssazione della sintcsi di DXA cromosomico, doviita ad altcrazioni dello stampo, e accompagnata sccondariamcntc da variazioni dcl sistcma dcgli cnzimi per In du- plieazione. Le modificazioni della membrana plnsmatica c della sua permeabilith, legate allc intcrazioni ccllulari clic si rcrificano durantc la fusione oppure nell’inibizione da contatto, provocano rariazioni ionichc dcl- l’ambicnte intraccllulare chc si riflcttono sullc condizioni dcl nuclco, quindi clclln cromatina e dcgli enzimi associati. La ccssazionc della sintesi di DNA B rcmrsibile in condizioni particolari, qudi I’infczione virale e la ricostituzionc di mioblasti incdinntc scgrcgnzionc di nuclei dnlle fibre. C’Z: nnclic

la possibilith che in condizioni normali vi sia una sintcsi residua di DNA (( mctnbolico )) nclIe fibre neo-formate, lcgata a fcnomeni di nmplificazionc genicn. 4) I1 legame tra differenziazione e cessazione della sintesi di DNA cromosomico e clovuto alla riduzionc delh sintesi dellc proteine qssenziali, clic nccompagna l’nrresto clclla divisionc cellulare. Senza dover ricorrerc a niodclli di rcprcssionc c di de-repressione, la comparsa dci carntteri dif- ferenziatiri pub dipcndcre da una competizione, a livcllo di traduzione, degli RNBni per le fiinzioni u cssenziali o e di quclli per le funzioni 4 di lusso )), regolntn dn rariazioni quantitative dclla trascrizionc e da differcnzc della vita media (lei rispettivi RNAm. Vi sono indicazioni, anche se molto va- glie, clie dopo la fusionc si verificano modificazioni delln duplicnzione (am- plificazioiic genica) c &lla trnscrizione (sintesi prcfercnziaIc cIi dcterminati RNAni), resc possibili anche da variazioni dei sistemi dclle DNA- cd RKA-polinierasi. Una rcgolnzione a livcllo di duplicazionc c/o di tra- scrizioiic pu6 csscre alla base dclle rariazioni, niolto ben documentate, a lircllo di traduzione (comparsn dei polisomi pcr le proteinc contrattili in deterniinatc fasi dcl differcnziamcnto ed in una successione ordinata). h anche probabile una regolazione rcciproca, coordinata, tra fasi diverse del diil’ercnzinmcinto, soprattutto per quanto riguarda i rnpporti trq Ic diverse proteine contrattili, i loro mononieri c le loro subunit&. Infinc certc tappe possono avvcnire medinnte mcecanismi di montaggio nu tomatico, clic non richicdono pnrticolari sistcmi di rcgolazionc genica. 5 ) Esistono sicuramentc mo(1ificnzioni qualitative (lei sistemi di rcgolazione nnclic a livello di traduzione, com’h provnto dall’esistenza di fattori clic dcterminano I’inizio dclla sintesi protcicn c clic attivano i ribosomi in pnrticolari fasi dello sriluppo. Questi fattori lianno sicuramentc iin’clcrata specificit& cellularc cd c~-entnalmente unn cnpacith di riconoscimento per i diversi RNdrn, nnchc cli una stessa cellrrla. Pcrcib essi controllano l’esprcssionc dci carntteri differcnziatiri dcterminaiido il tipo di proteine sintctizzatc, mediarite unn selczione dcgli stnnipi prcsenti in una dntn fnsc dcllo sviluppo. Un ulteriore nieccnnismo di rcgolazione a lirello di traduzionc vicnc forse realizzato medianic l’esclusionc dei ribosomi dal ciclo polisomale, con con- segucnte liniitazionc c spccializzazionc dclln sintesi protcicn.

Alcunc di qucstc conclusioni possono scmbrare premature sirlln base dci (Inti spcrimentali attualmcntc disponibili. ALn nnche se risultasscro tuttc validc, nc dcrivercbbc comiinquc ILn qiindro largnmcntc incompleto e dif- ficilc (In nnnlizzarc nlln liice dci modelli proposti per In rcgolazionc dcl differcnziamcnto ncllc cellulc superiori (BRITTEN e DAVIDSOS, 1900). Per qucsto motivo i dati rclativi all0 sviluppo del inuscolo lion vengono gcne- ralmentc prcsi in esamc quando si discutono gli aspctti gciierali ed i mec-

canismi molccolari dclla differcnziazionc (hIoxRoY, 1968 ; PAUL, 1968 ; CAIIN, 19G8).

Le carcnze principali rispctto ad altri sistemi cellulari mcglio noti, c gli indirizzi per i quali maggiormente si avvcrte la nccessitZL di un appro- fondimento sperimcntale, sono csscnzialmcntc i sew enti. 1) nccessario individuare altri paranictri differcnziativi dato che quclli finora utilizzati (presenza dcllc protcinc contrattili) possono non esserc rilevabili in particolari stadi (p. es. nei mioblasti) a causa dei limiti di scnsibilith dei metodi impiegati. Di consegucnza risulta impossibile per, ora affrontare il problema dclla modulazione dello stato differenziato, come viene fatto invece con akri tipi ccllulari (LASH, 1908 ; WHITTAKER, 1008 ; LASIIER, 1971). Solo per i niioblasti cerdiaci in coltura un approccio di qucsto tip0 t5 stato iniziato negli ultimi tempi. 3 ) Le conosccnze intorno alln. composizione della membrana plasmatien, intorno alle interazioni cellulari c intorno alle modificazioni strutturali c funzionali della superficie cellularc che ne sono alla base (FURSIIPAX e. POTTER, 1008 ; WARREX, 19GO ; SLAI~K~X, 1971), dovrcbbcro costituire il punto di partenza pcr affrontare il problema delIa specificit& clel riconoscimento tra mioblqsti, c delle conseguenze clie la fusione e Ic interazioni tra ccllule diverse del sistema muscolarc provocano sull’attivitii mctabolica dclla ‘fibra. 8 ) Mentre in altri sistemi ccllulari che si dilrcrenziano sin in vivo clie in vifro si conoscono le variazioni qualitative della sintcsi dcll’RNA (DARSELL, 1OG8 ; BURDON, 1971 ; THRASIiER, 1971), i mcccanismi di trasporto dell’RNAm do1 nuclco a1 citoplasma cd i sistemi chc regolano la disponibilith di RNAm e di ribosomi per‘la sintesi proteica (TYLER, 1907 ; DENIS, 10G8 ; FI~ICKIXGER, 1071), qucstc informazioni sono assolutamente carenti per quanto riguarda il muscolo. Pcrcij risulta dif- ficile discriminarc tra mcccanismi di regolazionc a livcllo di trascrizione c di traduzione. 4) Altrcttanto carenti sono i dati sui rapporti tra diversi aspetti diffcrenziativi’ e proprieth funzionali della fibra, clie pure potreb- bcro cssere individuati in vifro sfruttando p. es. interfercnze di tip0 or- monale, il cui meccanismo d’azione nci sistemi di regolazionc genica comin- cia ad cssere chiarito (TURKIXGTOS, 1071). 5) Nel differenziamcnto musco- Iarc sono molto vaghe lc iiidicazioni relative a fenomcni di amplificazione gcnica, la cui importanza come mezzo per acquisire specializzazioni funzionali & stata riconosciuta per divcrsi tipi cellulari (BIRNSTIEL et d., 1071 ; C R I P P ~ , 1071). Ma ncl eorso del diffcrenziamcnto muscolare non sono note ncppurc le modificazioni qualitative del DNA-stampo che hanno un ruolo piti gcncrale nella rcstrizionc dclla trascrizione (LEZZI, 1070 ; PAUL, 1970). 6) I dubbi che fino a poco tempo fa hanno caratterizzato gli studi.sulla re- vcrsibilitii dcllo stato differenziato ncl muscolo, hanno anche impedito di

nffrontarne lc basi a lircllo biochimico, come invece 6 stato fatto con altri modelli sperimentali (GUI~DOX c WOODLAND, 1970).

JZolto dunque resta da fare su ciascuno di questi punti per arrivare ad una visione piti organica dci meceanismi di regolnzione del differenziamento muscolare. JIa il fatto di potcr cominciare ad inquadrare alcuni aspetti, chc dal punto di vista deserittivo possono sembrare separati, in un sistcma di cventi collegati organicamcnte a livello molecolare, fornisce gi8 fin d’ora il metodo per una prima ricostruzione, anche se approssimata, di un process0 estremamente complieato quale il differenziamento muscolarc.

UIBLIOGRAFIA

A~rnonsm R. L., DIETRICII 31. e A ~ ~ n o n s ~ r G. F., 1970 - Effect ofpepfides on aninial cells in culture. 1. Illaintenance of beating heart cells. Esptl Cell Rcs., 03 : 42’7485.

AXEXIYA S., 1071 - Relafionship beireen cilia formafion and cell association in sea urchin embryos. Exptl Cell Res., G4 : 227-230.

IlassLcEn R., 10G2 - Elude de l’augnientafion du nombre de noyaux dans des bourgeons mtcsculaires cull ids in vitro. Obsemations sur le vivant, dosages njtophotomefriques et histoazibradio~raphics. 2. Annt. Entwickl. Gesch., 113 : 181-205.

UCLL E., 1969 - I-DNA: its packaging info I-sonies and its relation f o protein synthesis during differentiation. Nature, 22% : 320328.

nERIiOVIT2 A., SIJIOX E. 11. e TOLIVER A., l9GS - DNA replicntion in the absence of cell division i n RUdR-FUdR treafed ZleLa cells. Exptl Cell Rcs., 33 : 497-503.

UIANCIII V., LEVIS A. G. e 3IAnTINUCCI G. B., 1071 - Some facfors injluencing hybridi- zafion 01 rat and ckick myoblasts in vitro. Boll. Zool., 83 : 201-220.

BIRSSTIEL 31. L., CUIPCEASE 31. e SPEIRS J., 1971 - The ribosomal RNA cistrons. Prop. Xuclcic Acid Re$. 3101. Biol., 11 : 881-389.

I~ISCIIOBF R. e HOLTZER H., 1968 - Tile eflect of mitotic inhibitors on miyogenesis in vitro. J. Cell Biol., 36 : 111-127.

BIS~IIOFS R. e HoLmn €I., 1969 - .Mitosis and the processes of differentiation of myoge- nit cells. J. Cell Biol., 41 : 188-200.

BISCIIOIT R. c IIoI.TzEn II., 1970 - Inhibifion of niyoblast fusion nffer one round of DNA sgnthesis in 5-bromodeoquridine. J. Cell Biol., 44 : 134-150.

BOFFA L. C. e VIDALI G., 1971 - Acid-extraclable proteins jrom chick embryo tnusclc nuclei. Characterization of histone and studies on histone acefylation. Biocliim. nio. phys. Acta, 236: 269-209.

UREUER C.. B. e lkonrm J. R., l9GG - Effects of amrnonium sulfate, growth hormone, and testosierone propionate on ribonucleic acid polgnierase and chromatin activifies in rat skeletal muscle. Ilioclicmistry, 5 : 3867-3865.

BRIITEN R. S. e DAVIDSOX E. II., 1905 - Gene regulation for higher cells: a theory. science, 163 : 319-357.

BURDON R. H., 1071 - Ribonucleic acid maturation in animnl cells. Prop. Nucleic Acid Res, Bfol. Biol., 11 : 33-79.

CAEN R. D., 1908 - Factors affecting inheritance and expression of diflerentation : some

methods of analysis. In : The Sfabilitg of the Diflerentiated Sfafe. X i . Urspxung ed. ; pp. 5 8 4 4 . Springer, Bcrlin.

CAJIERON I. L. e JETER J. R., 1971 - Relationship beticeen cell proliferation and cyt,,- diflerentiation in embryonic Chick fissues. In : Decelopmentnl Aspects of the Cell Cycle. I. L. Cameron, G. 31. Pndilla, A. 31. Zimmermiln eds. : pp. 191-122. Aca- dcmic Press, N.Y.

CAMPBELL G. R., UEIIARA Y., NARK G. e BURNSTOCX G., 1971 - Fine sfructrcre of smooth ?nrrscle cells grown i n tissue culture. J . Cell Biol., 49 : 21-31.

C m m G n m B. e HARnnY I., 1904 - I n vitro studies on single healing rat heart cells. VI. Electron microscopic studies of single cells. J . Ultrastruct. Rcs., 11 : 4 2 8 4 4 2 ,

C ~ ~ o r r r L., ZANUSO G. e LEVIS A. G., 1970 - rileicni aspetti del nielabolismo degli acidi mcleici durante la iniogcnesi in vitro. Boll. Zool., 3? : 483484.

CELOITI L., FunLAN D., ZANUSO G. c LEVIS A. G., I071 - Rclationskip betxeen protein and nucleic ackZ synthesis during niuscle diflerenfiation in vitro. In prcpamzione.

CIIELALA C. A., IIrnscunExN L. c Tor.nm 11. IS., 1071 - I,itercon~ertiLleforiiis of Esclleri- cliia coli R.V.4 polymerase. Proe. A-atl Acad. Sci., 08 : 152-151.

CIIuncri J. C. T., 1970 - A model for inyogenesis using fhe concept of the satellite cell seg- ment. I n : Regeneralion of Striated dluscle, and dlyogenesis. A. Mauro, S. A. Sliafiq, A. T. 3Iilliorat eds ; pp. 118-121. Esccrptn Medice, Amsterdam.

COLEXAN J. R., 1970 - The source of myogenic cells for culture. I n : Regeneration of Striated Jfuscle, and Jfyogensis. A. JIauro, S. A. Sliafiq, A. 1’. Milllorat cds ; pp. 232-236. Excerpta JIcdica, Amsterdam.

COLEXAS J. R. e COLCXAN A. W., 1008 - Xuscle differeiitialion and inacroniolecular sgta- fliesis. J. Ccll. Fhysiol., 72 (Suppl. 1): 19-34.

COLCJ~AN J. R., COLEMAN A. W. e HARTLINE E. S. ,II., 1009 - A clonal study of the re- cersilrle inhibition of muscle differentiation by the halogenalcd thymidine analog 5- bromodcozyuridine. Devclopm. Biol., 19 : 507-548.

COLEMAN A. W., COLEMAN J. R., ICANKEL D. e WERSER I., 1970 - The recersible control of animal cell diflerentiation by the tlrymidine analog, 5-lromodeoxyuridine. Espt l Ccll Res., 59: 319-328.

COOPER 11‘. G. e KOSXGSBERG I. R., 1961 - Stcccinic dehydrogenase activity of rnuscle cells grorun in vitro. Esptl: Cell Res., 23: 578-581.

C o s P. G., 1068 - In vitro myogenesis of promuscle cells from fhe regenerating tail of fhe lizard, Anolis carolinensis. J. Morpliol., 126 : 1-18.

Cox 1’. G. e SIJIPSON S. 13. JR., 1070 A i~zicrophotoiiielr~c study of tnyogenic lizard cells gromn in vitro. Developm. Biol., 23 : 433443.

CRIPPA M., 1971 - L’atnpli’cazione genica come tnezzo per acquisire specializzmioni Eel- Ittlari, Boll. Zool., qucsto stcsso volume (Atti dcI Simposio).

CuNsmcnAx D. D. e PARDEE A. U., 1969 - Transport changes rapidly initiated by se- serum addition lo (L contact inhilrited B 3T3 cells. Proc. Katl Acad. Sci., 0%: 1040-1060.

D’APIIILE P. N., LEVIS A. G. c SAGGIORATO R., 1071 - Capacitd di~erenriatiz+a in vitro del niuscolo pettorale di pollo, in fasi diverse dell0 sciluppo embrionale e in condizioni d i collura dicerse. Act3 Embryol. Esp., 2: 137-155.

DARNELL J. E., 1908 - Ribonucleic acids from animal cells. Bact. Rev., 32 : 262-200. DE HAAN R. L., 1968 - Emergence of form and function in the enibyonic heart. I n : The

Emergence of Order in Dmeloping Systems. 31. Locke ed. ; pp. 20s-250. Acadcmic Press, N.Y.

DE LA HABA G., COOPER G. 11’. c ELTISG V., 1908 - .lIyogenesis of striated mltsc~c in

vitro : Iiornioiie and serwn sequiremenfs for the decelopment of glycogen synthetase in myotubes. J. Cell. Pliysiol., 72 : 21-25.

DENS €I., 1908 - Role of messenger ribonucleic acid i n embryonic derelopnient. Adv. Jlorphogen., -6 : 115-150.

Dor R. H., BROWN L. R., RODGERS G. e IIsu Y., 1970 - Bacillus subtilis mutant altered in spore morphology and in RNA polymerase acfioify. Proc. Natl Acad. Sci., GO : 40 MlO.

DULUECCO R., 1070 - IZehnvior of tissue culture cells infected z i th polyoma virus. Proc. Nntl Acid. Sci., 67: 1214-1220.

Dur.a~:cco R. e STOKER 11. G. P., 1970 - Conditions determining initiation of DNA synthesis i n 3T3 cells. Proc. Net1 Aced. Sci., 60 : 205-210.

EMJIART E. W., IZOXINZ D. R. c MIGUEL S., 1903 - The localization and distribution of ~lyceraldeliyde-3-pliosphate dehydrogenase in inyoblasts and deceloping muscle 3- bers groming i n culture. Histochem. Cytochcm., 11 : 207-217.

EZERJIAN E. B. e ISIIIIiA\VA H., 1967 - Difierentiafion of the sarcoplasntic reticulum and T system in deoeloping chick slicletal muscle in vitro. J. Cell niol.. 33: 405-420.

FIllliET H., 1907 - Ultrastructural aspects of myojbril formation in cultured skeletal inuscle. Z. Zellforscli., 78 : 313-327.

FrscnmN D. A, 1970 - The synthesis and assembly of myojbrils i n embryonic muscle. Current Topics in Devclopm. Biology, 5 : 285-280.

F L ~ ~ A N B. A., REVEL J. P. e IIAY E. D., 1909 - Tight junctions betzceen contact inhibited cells in vitro. Erp t l Cell Rcs., 38 : 488-443.

FLICIiIN3ER R. A., 1971 - Cell division and transcription in dcoeloping frog embryos. I n : Derelopmental Aspects oj tlre Cell Cucle. I . L. Cameron, G. 11. Padilla, A. &I. Zim- mermnnn eds ; pp. 161-190. Academic Press, N.Y.

FLORINI J. R. c BREUER C. I?., l9GG - Amino acid incorporation infoprotein by cell-free systems from rat skeletal muscle. V. Effects of pituitary grosth hormone on actiuity of ribosomes and ribonudeic acicZ polymerase in hypophpectomized rafs. Biochemi- stry, 5 : 1870-187G.

FOGEL >I., 1905 - Sunfhesis of a n antigenic material ( R A N ) in rat cells cultured i n vitro and in rat organs in vivo. Exptl Cell Rcs., 40 : 365-352.

FOGCL 11. c DEFENDI V., 1907 - Infection of muscle cultures from various species with oneogenic DIVA viruses (SV 40 and polyoma). Proc. Nntl Acad. Sci., 58 : 967-973.

FaaNsE 11'. W. e Scur~ico W., 1969 - h'uekar sicape in muscle cells. J. cell Biol., 42 :

IQJRLAN D. c C E L O ~ I L., 1971 - Alcunc indicazioni s ldk prescnza di RN.4 messaggcro a a vita lunga a nel differenziamcnto miiscolare i n vitro. Boll. Zool., qucsto stcsso volume (Atti del Simposio).

FURSIiPAN E. S. e POTTER D. D., 1968 - Lo-~resista~icejutictions betzceen cells in embryos and tissue culture. Current Topics in Developm. Biology, 3 : 95-127.

GAIL 31. 11. c B o o m Ca. W., 1971 - Density inhibition of mobility in 3T3 jibroblasts and their SV 40 fransformants. Exptl Cell Rcs., 6 5 : 15G-102.

GEORGE J. N., WEED R. I. c REED C. F., 1071 - Adhesion of human erythrocytes to glass: fhe nature of the interaction and fiie effect of serum and plasma. J. Cell. Pliysiol., 77:

Gcnxen E. W., GLICK >f. C. e WAREEX L., 1070 - Membranes of animal cells. V. Biosyn- thesis of flie surface membrane during the cell ojcle. J . Cell. Pliysiol., 73 : 276-280.

320-331.

51-00.

Gosrrnra I<,, 1070 - Formation of nexuses nnd electrotonic fransmission befzceen myocardial and F L cells in monolaycr culture. Esptl Cell Res., 63 : 12G-130.

GURDON J. B. e WOODLAND 11. R., 1970 - On the long-ierm confrol of nuclear activity during cell differenfiation. Current Topics in Developm. Biology, 3 : 39-70.

HARARY I., 3Ic CARL R. e FARLEY B., 1000 -Studies in vitro on single beafing rat heart .cells. IX. The resioration of beating by serum lipids and fatty acids. Biochim. Bio-

HAUSC~KA S. D., 1008 - Clonal aspects of muscle development and the stability of thi differentiated state. In : The Stability of the Diflerentiafed Stnte. 11. Ursprung ed. ; pp. 37-57. Springer Verlng, Berlin.

HAUSCIIIU S. D. e ICosIcsnEnc I. R., 1900 - The influence of collagen on the development of muscle clones. Proc. Natl h a d . Sci., 65 : 119-120.

HEnnxmN H., H ~ Y W O O D S. nl. e 3Lmcnoir A. C., 1970 - Reconstruction of muscle development as a sequence of mncromolecular synthesis. Currcnt Topics in Dcvelopm. Biology, 5 : 181-234.

HEYWOOD S. M., 1909 - Synthesis of tnyosin on heferologous ribosomes. Cold Spring Har- bor Symp. Quant. Biol., 3% : 799-803.

I k Y W O O D s. AI., 1970tl - Formation of the initiation comp1e.z using muscle ntesscnger RNAs. Ahture, 223 : G9G-GgS.

HEYWOOD S. 31.. l07Ob - Specificity of m R N A binding factor in eukaryotes. Proc. Natl Acad. Sci., 67: 1782-1788.

HEX-WOOD S. >I,, Domnos R. M. c RICII A, 1967 - The identijication of polyribosomes synthesizing myosin. Proc. Nntl Acad. Sci., 67 : 1002-1009.

HEYWOOD S. BI. e R I C ~ A., 190s - In vitro synthesis of native myosin, actin, and fropo- myosin froin embryonic chick polyrfbosomes. Proc. Nntl Acnd. Sci., 59 : 50&597.

IIIxwooD s. 31. c hTivacmu 31., 1908 - De nouo synthesis of myosin in n cell-free system. Proc. Natl Acad. Sci., 60: 229-236.

HEYWOOD S. 31. e N~YAGWU BI., 1909 - Partial characterizaiion of presumptive mg’osin messenger ribonucleic acid. Biochcmistry, 8 : 3839-3815.

HoLTmn II., 1900 - Afutiially exclusice activities during myogenesis. In : Exploratory Concepts in Nuscular Dystrophy and Related Disorders. A. T. Jlilhorat ed. ; pp. 57-03. Excerpta Medic3 Intern. Congress Ser., n. 147; Amsterdam.

HOLTZER €I., BknsruLL S. JI. c FINCI; H., I957 - An analysis of myogenesis by the use of fluorescent antimyosin. J . Iliophys. Biochcm. Cytol., 3 : 705-721.

IIoLTzsIt IT., BISCIIOFF R. c CIIACKO S., 1008 -Activities oftire cell surface during muoge- nesis and chondrogenesis. I n : Cellular Recognition. R. Smith, R. Good eds ; pp. 19-25. Appleton Century-Crofts Inc., N.Y.

HORGEN P. A. e GRIFFIN D. €I., 1971 - Specific inhibitors of the thrfe R N A polyme- rases from the aquatic fungus L3lastocladiella eniersonii. Proc. Nntl Acad. Sci., 0% :

IIOSICK 11. L. e STnoIrxaN R. C., 1971 - Clianges i n ribosoaie-polyribosonie balances ia chick muscle cells durinz tissue dissociation, development in culture. and exposure to simplijed culture medium. J . Cell. Physiol., 77 : 145-150.

I ~ B A T D. c Rrcn A., 1909 - The ribosomal subunit-polyribosome njde in protein synflie- sis of embryonic skeletal muscle. Biocliernistry, 8 : 37423749.

I ~ F A T O S F. c. e RErcn S., 19G8 - Sfability of differenfiation specific and nonspecific messenger RNA in insect cells. Proc. Xatl Acad. Sci., GO : 1558-1405.

I ~ ~ I C I I N 31. E., 1070 - Induction of D N A synthesis in skeletal muscle by oncogenic viruses.

PIIYS~ ACh, 115: 15-22.

838-311.

In : Regeneration of Striated Muscle, and Ngogenesis. A. JIauro, S. A. Shafiq, A. T. JIilliorat. eds ; pp. 212-250. Esccrptn Medica, Amsterdam.

I(nr.wrax P. e GROUSTEIX C., 1905 - Source of collagen at epiiheliomesenchgmal inferfaces during inductive interaction. Developm. Biol., 11 : 109-183.

KEIR 11. X, 1905 - DATA polymerares from mammalian cells. Prop. Nucl. Acid Res. Jlol. Biol., 4 : S2-10s.

KELLY A. 31. e ZACKS S. I., 1009 - The histogenesis of rat intercostal muscle. J . Cell Biol.,

I<OSIGSUERG I. R., 1900 - The diflerentiation of cross-striated innyofibrils in short-term cell culture. Esptl Ccll Rcs., 21 : 414-420.

I~OXIGSUERG I. It., 1901 -, Cellular differen tiation in colonies dericed froin single cell platings of freshly isolated chick embryo nlzrscle cells. Proc. Natl Acad. Sci., 47:

4 2 : 135-153.

18GS-lS72. KOXIGSDERG I. It., 1903 - Clonal analpis of nigogenesis. Science, 140 : 1273-1284. KOSIGSBERG I. R., fiICELVAIN hT., TOOTLE 11. C I k R R X A N N I€., ISGO - The dissocia-

bility of deoxgribonuclcic acid sgnthesis froin the daelopmenf of nztclfinuclearity of inuscle cells i n culture. J . Biopliys. Uioclicm. Cytol:, 8 : 333-313.

I<OSIGSUERG I. R. e HAUSCIIKA S. D., 1905 - Cell and tissue inferactions in the reproduction of cell type. In : Reproduction : illolecular, Sirbcellular and Cellular. 11. Locke ed. ; pp. 813-290. Amdemic Press, N.Y.

K O R N ~ E R G A., 1909 - Acfize center of D N A polginerase. Science, 103 : 1410-141s. KURTTI T. S. e BROOKS 31. A., 1970 - Grosth and differentialionof Lepidopteran 111go-

blasts in vitro. Esptl Cell Res., GI : 407412. I ~ E D A A., an no^^ R. L. e L.4NGJIAN J., 1905 - dluscle profeins in tlie cliick myoloine exa-

mined by the immiinojluorescent method. J . Embryol. Exptl Morphol., 19 : 103-202. ISIris;AwLi XI., 1968 - Formation of clnborate netrrorks of T-s&stcnz tubules in cultured ske-

lcfal miiscle rcitlr special reference to the T-system formation. J . Cell Biol.,' 38 :

ISIIIKAWA If., 1970 - Satellite cells i n developing micscle and tissue culture. In : Regene- ration of Striated Afrcscle and Xyogenesis. A. AIauro, S. A. Shafiq, A. T. AIilliorat eds ; pp. 107-179. Escerpta Medica, Amsterdam.

ISIIIIZAWA If., I~ISCIIOFF R. e IroLTzER II., 1908 - Jfitosis and i)iteri?iedinte-sizedpIa- ?Rents in deoeloping skeletal mtiscle. 3. Cell Biol., 38 : 538-555.

IsrrrrcAwLi If., EISCITOFF R. c IIOLTZER II., l9GO - Forniation of arrowhead complexes with Iieacy nicrom~osin in a variety of cell fgpes. J. Cell Biol., 43 : 318-825.

LARSON P. P., IIUDGSON P. c WALTON J. II., 1009 - Illorpkological relationship of polyribosome and niyosin filaments in dmeloping and regenerating skeletal muscle. Xaturc,

LASII S . W., 1908 - Phenotypic expression and differentiation : in vitro chondrogenesis. In : The Stability of flit Diflerentiated Stafe. I€. Ursprung cd. ; pp. 17-21. Springer, Berlin.

LasrrEn R., 1971 - Studies 011 ccllular proli/eration and cliondrogensis. In : Decelopmental Aspects of the Cell Cycle. I. L. Cameron, G. 11. Pndilla, A. 31. Zimmcrman eds ; pp. 223-241. Academic Press, N.Y.

LEE I€. II., ILirGrrx 11. E.,c EBERT J. D., 1908 - Induction of f hp fd i f i eya fZ incorporation in niultinucleuted myotubes by Rous sarcoina virus. Int. J. Cancer, 3 : 120.

LEVIS A. G. c DE ~ ' A D A I A., 1903 - Arucleic acid and profein synthesis in nitrogen mustard induced giant cells in vitro. Esptl Cell Rcs., 33 : 207-216.

ma-. --- . 11GS-1109.

LEVIS A. G., DAXIELI G. A. e PICCIXHI E., 1005 - Nucleic acid syntltcsis and the mitotic cycle in nitrogen mustard treated mammalian cells in culture. ATatum, 2Oi:

LEVIS A. G., I i n s ~ r ~ ~ o v ~ c V. e ERRERA M., 1007 - A rapidly labelled RIV.4 associated rcifli D N A i n IZeLa cells. Biochim. Biopliys. Actn, 1/13 : 577-505.

LEVIS A. G., I ~ S M A X O V I C V., BRTJNFAUT If., SZAPARY-\\’XNCIXLXANS D. e EI~RERA X., 1008 - RX.4 transcription in IIeLa cells. In : Biochemistry of Ribosomes and JIes- senger RN.4. R. Lindigkeit, P. Langen, J. Richter eds ; pp. 313-352. Akademio Verlag, Berlin.

LEVIS A. G., PICCINSI E., JIAIITINUCCI G. B. e ZANUSO G., 1070 - The inhibitor9 effects . of iriliafcd thymidine on the differentiation of rut myoblasfs in culture. Riv. niol., 63: 309410.

LEVIS A. G., Zaxuso G . e CELOTTI L., 1071a - The origin of ingoblasts and the dediffe- tenfiation of mulfinucleafed muscle fibers in vitro. In preparazione.

LEVIS A. G.; SAGGIORATO R. e Zaxuso G:, 1071b - E’ucfors influencing iire inhibitory action o j tritiated flryniidine on myogenesis in vitro. In preparazione.

LEZZI M., 1950 - Differential gene actication in isolated cltromosomes. Int. Rev. Cytol., 29: 127-168.

LOEB L. A. e FASSLER B., 1970 - Infracellrrlar migration of DlVA polymerase in early dmeloping sea urchin embryos. Bioeliim. Biopliys. Acta, 217 : 60-55.

Losxcr; R., SnoREssTmx R. G. e SOXEXSIIEIX A. L., 1970 - Structural alteration of RX.4 polymerase during sporulalion. Nature, 227 : 910-913.

LOVE D. S., STODDARD F. S. c Cnasso J. A, 1009 - Endocrine regiflalion o j embryonic niuscle decelopment ; hormonal confrol of D N A accumulation, pentose cycle acfivity and niyoblast proli/erafion. Dewlopm. Diol., 20 : 503-582.

Low R. B., \‘OURXAIiIS J. N. e Rrcii A., 1971 - Idenfifcution of scparafc polysomes uctice in the synthesis o j the ligltt and henry chains o j myosin. Bioclicmistry, 10 : 1813-1818.

~ I A C COSXACIIIE €I., ESESCO 31.e LEBLOND n., 1904 - The mode of increase in the number o j skeletal mrrscte iiticlei in postnatal rat. Amer. J. Anat., 114 : 245-2523.

~IANASEIZ. I?. J., 100s - Xitosis in dewloping cardiac niuscle. J . Cell Biol., 37 : 191-190. MANNER G., 1071 - Ccll division and collagen sgntltesis in cultured $broblnsts. Esptl Cell

JfARCIIOIi 11. c., 1900 - rfia autoradiograpicic observation of Piucleotide incorporation in deceloping muscle cells. Esptl Cell Res., 43 : 214-210.

JIARCIIOK A. C., 19iO - Studies of muscle decelopmenf. 1’. The activity of soluble and dtro- niatin-bound lZArA polymerase jroni embryonic chick niuscle nuclei. Esptl Cell Res., 03: 201-204. - *

AIARCUOI~ A. C. e WOLFF J. A., 1008 - Studies o j muscle decelopmnf. IV. Some churacte- ristics of R S A polymerase acfivify i n isolaterl nuclei jroin dewloping clticb nitiscle. Biocliirii. Biopliys. Actn, 133 : 37s-393.

MARTISUCCI G. U., LEVIS A. G., I’ICCISSI E. e SAGGIORATO R., 1070 - dfyoblast fusion and flte niitotic cycle during niirscle rliffcrenfiation in vitro. Acta Embryol. Esp., 1 : 59-77.

NASLOW n. E., 1909 - Cell specifcity in the formation od mullinucleafed striated aiuscle. Enptl Cell Res., 54 : 381-800.

SIASLOW D. E. 1070 - Eiectrokiiictic surfaccs of trypsi)a-dissocic~~ed embryonic eltick liver cclls. Esptl Cell Res., 01 : 20G-270.

008-010.

Rcs., 69 : 49-00.

HCCARL R. L. c SEALER R. C., 1909 - The effects of actinorngcin D on protein synthesis and beating in cultured rat heart cells. J. Cell BioI., 40 : 850-854.

~ I I S T Z B. e ~ ~ I ; E R 11'. I\'., 19G7 - Normal nzaninialian muscle diflerentiafion and gene control of isoeitrate dehgdrogenase synfhesis. Proc. Natl Acad. Sci., 48 : 592-598.

JIIUI~A 1'. c WILT F. II., 1971 - The effects of 5-broniodeoxgvridine on poll; sac eryihro-

;\LOSROS A., 1908 - Sistemi di regolazione nello sviluppo embrionale.' Boll. Zool., 33 :

MORSE R. I<., I f E R R X A S N I€. e IIsrwooD S. 3L., 1971 - Exfractioia with Triton X-100 of active poIysonies jrom utono~ager cultures oj embryonic' muscle ceils. Uiocliim. Biophys. Acta, 232 : 403-409.

;\Loss F. P. e LEBLOXD C. P., 1970 - A'ature of dividing nuclei in skeletal muscle of grozeing rats. 3. Cell Uiol., 44 : 4594G2.

Muin A. E., 1970 - The structure and distribution of satellite cells. In : Regeneration of Sfriuied Muscle, and Jfyogenesis. A. Akuro, S. A. Shafiq,*A. T. Milliorat eds ; pp. 91-100. Excerpta' Alediw, Amsterdam.

MURRAY 31. R., 1905 - .Muscle. In : Cell and Tissues in Culture. E. N. Willnier ed. ; vol. 2, pp. 311-372. Academic Press, X.P.

NAMEROFF ;\I. e IIoiTZm H., 1000 - Contact-mediated recersible suppression of niyoge- nesis. Devclopm. Biolo-7, 10 : 380-390.

NAXEROFF BI., REZWIK AT., ANDERSON P. e HANSEX J. L., 1070 - Differentialion and control of mitosis in a skeletal muscle tumor. Cancer Res., 30 : 590-GOO.

O I ~ A Z A I ~ I K. e HOLTZER 11., 1005 - An analysis of myogcnesis in vitro usingjluorescein- labeled antimyosin. J. Histocliem. Cytocliem., 13 : 726739.

OKAZAKI I<. e IIoLTzmt H., 1900 - Jfyogenesis : fusion, myosin syntiiesis and the niitofic cycle. Proc. Nntl Acnd. Sci., 5 6 : 1481-1490.

O"EILL 31. c STnonxh- R. C., 1009 - Changes in DNA polymerase activity. associated with cell fusion in cultures of enzbrgonic mtcsele. J. Cell. Pliysiol., 73 : 01-0s.

PAUL J., 1908 - Bfolecular aspects of cyfodifferentiation. Adv. Comp. l'liysiol; Bioclieln.,

PAUL J., 1970 - UA'A masking in mammalian cliromatin : a niolecular mechanism for

PAUL J. c EIusTxn J. A., 1908 - DNA synthesis i s essential for increased hemoglobin

PELC S. R., 1904 - Labelling of DATA and cell division in so called non-dividing tissues.

PICCINNI E., MARTINUCCI G. B. e LEVIS A. G., 1970 - ReIatio&ip betzcecn cell density

PrETscIr P. e McCoLLIsTErt S. B., 1905 - Replication and the-activation of muscle diffe-

PoLrNoEn I. S., 1970,- Separation of cell types in enibrgonic heart cell cultures. Exptl

Posm G., 1971 - Tissue dissociation x i f k proleoI$ic en=gmes. A dsorplion and activity

PRzi'nsLsIix R. J., 1971 - Occurrence of centrioles during skeletnl and cardiac mgogenesis.

PnzsBwmix R. J. e BLUXBERG'J. AI., I000 - Ultrasfrudural aspects of mgogenesis in the

. poiesis i n the chick embryo. J. Cell Biol., 48 : 523-338.

291-313.

3: 115-172.

determination of cell type. Current Topics in Dcvelopm. Bioloev, 5 : 317-352.

sqnfliesis in response l o ergthropoietin. Xature, 219 : 1302-1303.

J. Cell Biol., 13: 21-2s.

and muscle fibre differentiation in vitro. Riv. Biol., 63 : 8-42.

rentiation. hhture, 208 : 1170-1178.

CCll Rcs., 83 : 78-88.

of enzgmes at the cell surface. Exptl Cell Res:, 63 : 339-307.

J. Cell Biol., 1.11: 214-231.

cliich-. Lnb. Invest.,. 15 : 830-803.

PRZYBSLSKI R. J. e CIILEUOWSBI J., 1970 - DNA synthesis, mitosis and fusion o j dij- ferentiated myocardial cells. J. Cell Biol., 47 : 102 abstr.

RASU J. E., SIIAY J. W. c BIESELE J. J., 1909 - Cilia in cardiac differentiation. J. Ultra- struct. Res., 29: 470484.

RENDEL J. AI., 1909 - A model relating gene replicas and gene repression to phenotypic expression and variability. Proc. Natl Amd. Sci., fX : 578-583.

REPORTER 11. C., KONICSUERG I. R. e STREIILER B. L., 10G3 - Kinetics of accriinulation of creatine pliosphokinase activity in developing embryonic skeletal muscle in vivo and in monoZayer culture. Esptl Cell Rcs., 30 : 41-17.

RESSEGUIE L.; 1901 - JZyogenesis in cell culture. J. Esptl Zool., l i 8 : 41-03. REZSIK 31.. 1009 - Oriiin of myoblasts during skeletal muscle. regeneration. Lab. Invest.,

REzsirc JI., 1070 - Satellite cells, ~nyoblasts, and skeletal inuscle regeneration. In : Rege- neration of Striated Muscle, and ilfyogenesis. A. Jkuro, S. A. Shafiq, A. T. Mil- liorat eds ; pp. 133-150. Exccrpta JIcdica, Amsterdam.

Rxzsis M., NAXEROFF 31. c HAKSEN J. L., 1970 - Ultrasfrucfure of a transplantabk mu- h e rhabdomyosarcoma. Cancer Rcs., 30 : 001-010.

R~CUARDSOX J.. P., l9G9 - R N A polymerase and the control o j RNA synthesis. Prop. Nuclcic Acid Res. 3101. Biol., 9 : 75-110.

RICIILER C. e SAFFE D., 1070 - The in vitro cultiuation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Developin. Biol., 13 : 1-24.

ROEDER It. G. c RUTTER 11'. J., 1070 - Specific nuclear and nucleo~~losmic RA'A p o l p nicrases. Proc. Natl Acad. sci., 65 : 675-082.

Ross I<. F. A., JASS D. E., L A R S O ~ P. F., XASTAGIJA F. L,, Pmsoss R., FULTIIORPE J. J., JESKISSOS 11. e \VALTON J. N., 1070 - Distribution of ribosomal XNA in fusing myoblasts. Nature, 226 : 515-517.

RUXERY R. E. c RIEKE 11'. O., 1007 - D X A synthesis by cttltured myocardial cells. Anat.

SAGGIORATO It., Zariuso G. c LEGIS A. G., 1970 - Ossemazioni sulla capaeitd differenzia- tiva dei mioblnsti di cavia e di raft0 in 4tro. BOIL ZOOI., 37: 121-120.

SawcEn J. W. e HOLTZER €I., 1970 - A-uclear complemenfation e in 5-Bromodeoxyuridine and cyfochalasin %treated 9nyogenic cells. J . Cell Biol., 47 : 178 abstr.

SCIIOLL A., H E R R X A ~ ~ X 11. c ROTII J., 100s Studies o j muscle deuelopment. I I I . An eval- uation of ihyniidylale kinase actiz;ity, x i t h respect to cell proli/eration in developing chick by muscle. Life Sci., 7 : 91-97.

Scriijsnma 0. T., WASICA F. e KLII-I-ER C. 31. A., 1970 - Periodic cliange of deoxyribo- nuclease activity in syncltronous cttlfures of Chlorellr. Biochirn. Biophys. Acta, 2 2 4 : 74-70.

SCIIUBERT D. e +COB P., 1070 - 5-bron1odeoxyuridine-i1~diiced differentiation of a micro- bluston~a. Proc. Natl Acad. Sci. , 67 : 217-254.

SCOTT R. n. c BELL E., 1061 - Protein synthesis diiring de~elopment : control through messenger RXA. Science, 145 : 711-714.

SERAYDARIAN 11. W., HARARY 1. e SATO E., 100s - In vitro sfudies of healing-lieart cells in culture. XI. The ATP level and contractions of the heart cells. Biochim. Biopliys. Acta, 165 : 414.423.

Suaviq S. A, 1970 - Satellite cells and jiher titiclei i n niusclf regeneration. In : Regenera- tion of Sfriated Jfuscle, and ilfyogenesis. A. 3Iauro, S. A, Shafiq, A. T. Milllorat 'eds ; pp. 122-132. Esccrpta Jledica, Amstcrdnm.

2 0 : 353-3G3.

Rcc., 158: 501-50s.

SI~AFIQ S. A, ConycIii 31. A. e JIauno A., 1908 - .Mitosis during postnnlal grorcth in skeletal and cardial muscle of the rat. J. Anat., 103 : 135.

SI~AINUERG A., YAIXL G. c YAFFE D., 1900 - Control of myogenesis in vitro bg Ca+f concentration in iiulrifional mcdiuin. Exptl Cell Rcs., 58 : 163-1G7.

Snh1l;IIERG A., YAGIL G. c YAFFE D., 1971 - Alterations of enzymatic acticilies during niuscle differentiation in vitro. Developm. Biol., 25 : 1-9.

SnntEn R. C. c 3LcCAnL R. L., 1071 - The mechanism of cortisol action in culfured tat heart cells. J. Cell Biol., 49 : 205-209.

SIIAPOT V. S. e DAVIDOVA S. YA., 1971 - Liporibonucleoprotein as an integral part of aninial cell membranes. Progr. Nuclcic Acid Rcs. 1101. Biol., 11 : 81-101.

SIIIMADA Y., 1065 - Suppression of myogenesis by heterotypic and heferospecific cells in monolayer cultures. Esptl Cell Res., 51 : 501578.

SIIIMADA Y., F1scnx.m D. A. e MOSCONA A. A., 1967 - The p n c structure of embryonic chick skeletal muscle cells differentiated in vitro. J . Cell Biol., 33 : 445453.

SLAVKIN €1. C., 1071 - The dgnaniics of extracellular and cell surface protein interactions. In : Cellular and Molecular Renexal i n the Jlanimalian Body. I . L. Cameron. J. D. Thrasher eds ; pp. 281-276. Academic Press, N.Y.

SIIETA~A I<., G Y O I ~ E Y F., GI-ORKEY P. c BUSCII II., 1970 - Studies on fhe rtlfrasfructure of riucleoli in human smooth muscle cells. Exptl Cell Rcs., GO : 175-184.

STEEX T. P., 1970 - Cell differentiation during salamander limb regeneration. In : Regene- ralio), of Striated ~lluscle, and JIyogcnesis. A. Maiiro, S . A. SlmBq, A. T. 1Iilhorat eds. ; pp. 73-00. Escerptn JIedicn, Amsterdam.

S T E I x x w R. JI., 1908 - A1 electron ?nicroscopic study of ciliogenesis in developing epi- derJniS and trachea in the embryo of Xcnopus lacvis. Amer. J. Anat., 122 : 19-55.

STOCKDALE F., 1070 - Clianging lecels of D N A polymerase activity during the decelopment of skeletal muscle tissue in vivo. Developrn. Biol., 21 : 462474.

STOCKDALE F. e IIOLTZER II., l0Gl - DNdl synthesis and myogenesis. Esptl Ccll Res.,

STOCKDALE F., OIiAZAKI I<., SAJIEROBP 31. c ~IOLTZER II., 1904 - 5-bro~~io~lcoryuridine : eflect on myogenesis in vitro. Sciencc, 1 ~ ; : 533-535.

STREIILER n., RONIGS~ERG I. e ICELLEY J.,,1003 - Ploidy of myoftibe nticlci dewloping in vitro as determined zcith a recording double beam microspectropliotomeler. Esptl

2.5 : 505-520.

Cell Rcs., 32 : 232-241. STROUN 31., CnAnLEs P., AXKER P. c PELC S. R., 1007 - lllefabolic DNA in heart and .

slielefal inriscle and in the infcstine of ?nice. Nature, 216 : 710717. SzYnaLSIiI W., I(vB1XSIiZ 11. e SilELDRICIC I?., 1966 - Pgrimidine clusters on ilte transcri-

bing strand of DATA and their possible role i n the i2itiation of DATA synthesis. Cold. Spring IInrhor Syrup. Quant. Uiol., 31 : 123-187.

TIIRASIIEI~ J . D., 1971 - Z W A molccules in cells and tissues, in vivo and in vitro. In : Cellular and illolecular Renezcal i n Ute ~IIa~ninalian Ilody. I . 1,. Camcron, J. D. Trns- lier eds ; pp. 107-152. Academic Press, K.P.

TUI~KISGTON R. W., 1971 - Ilormonal rcgulation of cell proliferation and differentiation. In Da.elopmenta1 Aspects of llie Cell Cycle. I. L. Cimeron, G. 31. Padilla, A. 31. Zim- merman cds ; pi). 315-335. Academic Press, ' N.Y.

TYLER A, 1907 - Jlasked messenger RA'A and cytoplasmic D N A i n rclation lo prolein synthesis and proccsscs of jerlilization and determinotion in embryonic dccelopnient. I n : Control .Mechanisms in Da-elopntentnl Processes. 11. Loch ed. ; pp. 170-8% Academic Press, S.S.

\\=\nnzs L., 10130 - The biological significance of furnorer of fhe srtrjuce incinbrane o j animal cells. Cirrrcnt Topics in Dcvclopm. niol., 4 : 107-222.

\VEIL n. e I<AXL~ J., 1070 - Polgoma 4 tumor nnfigcn e : nn ncfirafor of chroniosoine re- plicafion P Proc. Kntl A m d . Sci., 07 : 1011-1017.

\VExssmrx R, B. e IIAY E. D., 1070 - Dcoxyribonucleic acid synilcesis and mifosis i n diflcrcnfiafcd cardiac muscle cclls of chick embryos. J. Cell Biol., 47 : 310-310.

\\’EsTEno.\.\nD O., 1070 - Scparalion of is0 DATA polymerase fractions from Telrahginena cclls ajfcr e.rcision-repairable damage fo D N A . Biochiin. Biopliys. Actn, 218 : 30-4 t.

\Vmrr.\xiEn J. R., lS(I8 - Tlie tiafure and probnbk cause of tnodulafions in pigincnl cell ctclfures. In : The slability of tire Diflere~ifiafcd~Sfafc. 11. Ursprung cd. ; pp. 25-30. Springer, Berli?.

YAFFE D., 1008 - Ziclcntion of diflcrenliation p o f c n f i a l i f i ~ during prolongcd cullioalion of atyogenic cells. Proc. h’ntl ;\cad. Sci., 01 : 477453.

I-AFFI: D., 1963 - Cclttrlar aspects o/ tntcscre diflerenfiafion in vitro. Corrcnt Topics in Dcrcloprn. Uiol., 4 : 37-77.

I.AFFEF. D., 1071 - Umelopnieiiial changes preceding ccll fusion cluriiig niusclc differrib f iafion in vitro. Ihptl Ccll Ilcs., ti: 33-48.

SAFFE D. c IJELDMAN JI., 1001, - Tlie efleet of neiinoiii~cin D o n heart and tliigk inusclc cells groxtr in vitro. Dcvclopni. Diol., D : 31.7-3GG.

TAFFE D. L‘ FELDJIAN JI., 1905 - Titc jorntofion of hgbrid niulfinuclcaicd I I ~ I ~ R C I C Jbres froin ttiuoblnsfs of diflerenl genelic origin. Dcvclopm. Diol., 11 : 300-317.

SAFFE D. c Fucns S., 1007 - ~lrtloradiograpl~iic~ sfrrdy of fhe incorporalion o j uri’dinc-*Zl duriiig nrgogcnrsis i n lissuc culture. Devclopm. niol., 13 : 33-50.

YAFFE D. e GEnsuos D., 19G7 - Jliclfinitclcofcd aiuscle jbres : induction of D.”1 sun- thesis and tiiifosis by polyonin oitirs inferlion. Xnturc, 213 : 49142i .

Ym J. e Fisiicn 11. W., l0G3 - A diflicsiblc fncior rchicli sustains conlncf inhibilion of replicnfion. J . Cell Uiol., 40 : 352-38s.

YOSIIIDA S. c C.\V.\LLF:IU L. F., 1071 - .Ilulfiple niolccrrlar species of Esclicricliin coli DSA polynierase. Proc. Xatl Acnd. Sci., on : 200-204.

ZASUSO G., SAccronaTo R. e LIXIS A. G., 1370a - I’crdita clclla cnpacifci diflerenrinlica in colfura cla park rli eellule di raflo i~ii:inln~c~iie tniogcnichc. Actn Embryol. Rsp.,

ZANUSO G., CELOITI L. c LEVIS A. G., 1070b - Origine dci n~ioblasfi drcrnnle il difle- 1: 13-20.

renzianicnfo tntcscolnre in vitro. Boll. Zool., 3; : 390-997.

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