4. Spektroskopske metode

Spektroskopske metode

*Interakcija molekula i elektromagnetskog zračenja

•Detekcija, identifikacija i odredjivanje koncentracije

•Detaljna struktura molekula

Elektromagnetni talas

talasna dužina

pravac prostiranja talasa

-talas i čestica (foton)

talasna dužina brzina svetlosti

frekvencija

rastojanje

-foton ima diskretnu količinu energije ili kvant (E=h)

vidljiva oblast

radio talasi mikrotalasi infracrveni ultraljubičasti X zraci γ zraci

niska frekvencija visoka frekvencija

velika talasna dužina mala talasna dužina

Shematski prikaz elektromagnetnog spektra

(400-750 nm)

(UV-180-400 nm)(IC)

APSORPCIJA; EMISIJA; RASEJAVANJE

Spektrofotometrija (IC, UV, vidljiva)

NMR

Fluorescencija

Laserska spektroskopija

E2 - E1 = hν, E = hν = h(c/λ) h= 6,63·10-34 Js

I = I0·10-εcl log(I/I0) = - εcl log(I0/I) = εcl = A

Lamber – Berov zakon:h - Plankova konstanta

Difrakcija x-zraka

T = I/I0 T - transmisija apsorbancija

Energija

rotacioni energetski nivoi vibracioni nivoi, u okviru elektronskog energetskog nivoa

Energetski prelazi elektrona pri apsorpciji svetlosti (UV i vidljiva) –ekscitacija

-vibracije se ekscituju infracrvenom svetlošću, a rotacije mikrotalasima

n →π*, π→π*

Kontinualnost apsorpcionih spektara, jer je svaki energetski prelaz elektrona praćen vibracionim i rotacionim prelazima

Primeri energetskih prelaza elektrona u peptidnoj vezi pri apsorpciji svetlosti:

tranzicije na 190 nm,

na 210-220 nm

energija

λ

A

Apsorpcioni spektar tirozina i triptofana

triptofan

tirozin

Spektrofotometrijske analize

upadna svetlost propuštena svetlost

rastvor

kiveta

A apsorbancija

molarni ekstinkcioni koeficijent koncentracija

dužina puta svetlosti

A = OD (optička gustina)

OD – merenje turbidnosti (odbijene svetlosti)

T=I0/I

Komponente spektrofotometra

lampa monohromator

kiveta sa uzorkom

detektor

Kivete za spektrofotometar

spektrofotometar

-kvarcne

-staklene, polistirenske

Primena UV i vidljive spektrofotometrije:

-Identifikacija supstanci

-Odredjivanje koncentracije

-Procena čistoće izolata

-Detektovanje i praćenje konformacionih promena

DNK: 1OD260 – 50 g/ml

RNK: 1 OD260 – 40 g/ml

proteini: c (mg/ml)=1,55xA280 – 0,76xA260

olorimetrija: Lowry, Bradford; difenilaminska, orcinolska reakcija

A260/280=1,8

-izgled spektra zavisi od pH, koncentracije, polarnosti rastvarača, strukturne organizacije molekula, uključivanja u polimernu strukturu

Na izgled spektra utiču: pH, polarnost rastvarača, koncentracija supstance, interakcija sa sredinom i drugim molekulima...

jednolančana DNK

dvolančana DNK

λ

A

hipohromizam (smanjenje apsorpcije)hiperhromozam“crveni šift”-batohromni efekat“plavi šift” – hipsohromni efekat

fluorescencija

apsorpcija

A

apsorpcija

emisija

talasna dužina

rastojanje između atoma,

energija ekscitiranog stanja

prenos energije

fluorescencija

ekscitacijaenergija osnovnog stanja

Fluorescentni spektri

Q – kvantni prinos=(broj emitovanih fotona) / (broj apsorbovanih fotona)

Fluorescencija tirozina

Obeležavanje proteina fluorescinom

TGase - transglutaminaza

Fluorescentna boja SYBR Green interkalira se samo u 2s DNK-primena u RT-PCR

Primena fluorescentnih boja kod sekvenciranja DNK

Fragmenti koji se sintetišu u reakcijama obeležavaju se fluorescentno. Jedan od načina obeležavanja je primena obeleženih dideoksinukleotida. Svaki dideoksi nukleotid (ddT, ddA, ddC, ddG) obeležen je posebnom fluorescentnom bojom. Fragmenti koji nastaju u reakciji i koji se završavaju odgovarajućim dideoksi nukleotidom, razdvajaju se elektroforezom i detektuju na osnovu odgovarajuće fluorescencije.

fragment koji se sekvencira

sintetisani komplementarni fragmenti, koji se završavaju sa ddT

2.kretanje fragmenata DNK

fragmenti, sintetisani u reakcijama i obeleženi fluorescentnim bojama, dužina koje se razlikuju za jedan nukleotid, razdvajaju se na kapilarnom gelu kao pojedinačne trake; gel se skenira laserskim zrakom, fluorescencija se pobuđuje i detektuje

detektor

laserski zrak

laser

Kompjuter prevodi zapis fluorescencije u sekvencu DNK

zapis detektovanih fragmenata (traka)

sekvenca DNK

Primeri korišćenja fluorescentnih boja za analizu ekspresije gena

Izolovanje iRNK iz dva različita uzorka (stadijuma razvića)

Sinteza i obeležavanje cDNK primenom fluorescentno obeleženih nukleotida

iRNK

cDNK

reverzna transkriptaza

Nanošenje cDNK na pripremljene mikroereje; cDNK prepoznaju komplementarne sekvence na mikroereju i vezuju se za njih

mikroerej ploča

odstranjivanje nehibridizovene probe

Svaka fluorescentna tačka predstavlja gen eksprimiran u uzorcima

Izgled DNK čipa, sa fluorescentno obojenim probama

Izdvajanje ćelija koje eksprimiraju fluorescentno obeležene proteine pomoću FACS-a

Struktura zelenog fluorescentnog proteina (GFP), često korišćenog u obeležavanju rekombinantnih proteina

suspenzija ćelija

detektori

analizatorlaser

-praćenje jednog molekula u živoj ćeliji, u “realnom” vremenu- prostorna rezolucija 1-10 nm, vremenska rezolucija < 1 ns- BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy

• distance-dependent interaction between the electronic excited states of two dye molecules in which excitation is transferred from a donor molecule to an acceptor molecule without emission of a photon.

• The mechanism of fluorescence resonance energy transfer involves a donor fluorophore in an excited electronic state, which may transfer its excitation energy to a nearby acceptor chromophore in a non-radiative fashion through long-range dipole-dipole interactions. The theory supporting energy transfer is based on the concept of treating an excited fluorophore as an oscillating dipole that can undergo an energy exchange with a second dipole having a similar resonance frequency. In this regard, resonance energy transfer is analogous to the behavior of coupled oscillators, such as a pair of tuning forks vibrating at the same frequency.

• The process of resonance energy transfer (RET) can take place when a donor fluorophore in an electronically excited state transfers its excitation energy to a nearby chromophore, the acceptor. In principle, if the fluorescence emission spectrum of the donor molecule overlaps the absorption spectrum of the acceptor molecule, and the two are within a minimal spatial radius, the donor can directly transfer its excitation energy to the acceptor through long-range dipole-dipole intermolecular coupling.

•Donor and acceptor molecules must be in close proximity (typically 10–100 Å).

•The absorption spectrum of the acceptor must overlap the fluorescence emission spectrum of the donor (see Figure).

•Donor and acceptor transition dipole orientations must be approximately parallel.

Schematic representation of the FRET spectral overlap integral.

Primary Conditions for FRET

Strategy for detection of protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer and mutant fluorescent proteins. If two proteins, one labeled with BFP (the donor) and the other with GFP (the acceptor), physically interact, then increased intensity at the acceptor emission maximum (510 nanometers) will be observed when the complex is excited at the maximum absorbance wavelength (380 nanometers) of the donor. Failure of the proteins to form a complex results in no acceptor (GFP) fluorescence emission.

A typical investigation of intracellular protein-protein association in a living cell culture is illustrated in Figure for events associated with apoptosis, a physicological process of cellular death resulting from an intricate cascade of sequential interactions. Gene products directly involved in the chain of events can be labeled by fusion to appropriate members of the fluorescent protein family (in this case, BFP and GFP) for co-expression in the same cell in order to probe specific associations by FRET. The proteins involved with apoptosis interact within the mitochondria and display a gradual decrease in binding as programmed cell death proceeds. Thus, an image of donor emission (Figure 8(a)) contains only fluorescence from the BFP-labeled proteins, while the corresponding acceptor emission profile (Figure 9(b)) illustrates signals due to proteins labeled with GFP (and some contribution from donor emission). A FRET filter (Figure 8(c)) reveals fluorescence derived from resonance energy transfer between the two proteins

visoki napon

kapilara rastvor uzorka

-jonizacija uzorka-

analizator mase

Masena spektrometrija, kao vid spektroskopije kod koje se informacije o molekulu ne dobijaju na osnovu njegove interakcije sa elektromagnetnim zračenjem

Masena spektroskopija

Izgled masenog spektra

(određivanje molekulske mase, Mr, proteina)

m – masa

z - naelektrisanje

Sistemi za jonizaciju molekula:

ESI –Electrospray Ionisation

FAB – Fast Atom Bombardment

MALDI – Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)

Analizatori:

TOF (Time of Flight)

quadrupoles

Tandemska masena spektrometrija MS/MS ili MS2

Tandemska masena spektrometrija – primena za sekvenciranje proteina

Princip nuklearne magnetne rezonancije (NMR)

Apsorpcija energije dovodi do reorijentacije spina jezgra aroma

apsorbovana energija

povećanje frekvencije

rezonancija

relativna energijaenergija primenjenog elektromagnetnog zračenja

13C19F, 31P

radio talasi

Apsorpcija zračenja dovodi do promene pravca momenta spina jezgra

vreme

magnetno polje

frekvencija

Hemijski “šift”:

Href-H)/Href)x106

ppm

“cepanje traka”

Rekonstrukcija trodimenzionalne strukture proteina na osnovu NMR spektara

Trakasti modeli strukture proteina

Primer primene NMR spektroskopije u proučavanju interakcije proteina i nekog malog molekula (inhibitor)

Difrakcija x – zraka, koja se koristi, kao i NMR, za određivanje konformacije proteina

izvor x-zraka

snop x-zraka

kristal proteina

skretanje zraka

slika (pattern) nastala difrakcijom x- zraka na kristalu proteina

model strukture proteina, rekonstruisan na osnovu analize difrakcione slike kristala

Cirkularni dihroizam (CD) – razlika u apsorpciji levo i desno cirkularno polarizovane svetlosti

Primena cirkularnog dihroizma (CD) u analizi strukture proteina (procena sadržaja sekundanih struktura, promene konformacije proteina)

električno polje

električno polje

ploča slučajno ispresavijani lanac

heliks

talasna dužina (nm)

CD spektar za mioglobin