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12-06-2009
Anne COLENO -COSTES
UMR7622 - Biologie du DéveloppementCNRS - UPMC
Bâtiment C - 7ème étage - case 249, quai Saint-Bernard75005 - Paris, France
tel: 00 33 1 44 27 32 59anne.coleno-costes@snv.jussieu.fr ou anlikia@yahoo.fr
Démonstration de PCR quantitative
1. Principe de la PCR quantitative
2. Exemples d’applications de la PCR quantitative
3. Calculs à effectuer pour l’analyse des résultats du stage
Principe de la PCR conventionnelle
Dénaturation du double brin d’ADN et hybridation des amorces
Elongation
Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol
72°C
55°C
95°C
72°C
x 35 cycles
Séparation électrophorétique
PCR conventionnelle versus PCR quantitative
Analyse en point final sur gel d’agarose
Phase exponentielle
Phase linéaire
Phase plateau
Analyse dynamique de la PCR quantitative
-haute précision pendant la phase exponentielle
-variabilité importante à la phase plateau
PCR quantitative SYBR ®Green
Mesure de fluorescence en fin d’élongation
PCR quantitative avec une sonde TaqMan®
Cette méthode repose sur deux principes :-l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol-la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)
5’
5’
3’
3’
FP
RP
Reporter Quencher
FAM, VIC TAMRA, MGB
-Spécificité de l’amorce pour la PCR-Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R Q
-FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),
pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte
Fluorescence
Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®
PCR quantitative avec une sonde TaqMan®
Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®
-au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ exonucléase lyse la sonde
5’
5’
3’
3’
FP
RP
Q
5’
5’
3’
3’
FP
RP
Q
-lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.
nm
Abs
orbt
ion Fluorescence
475 550
Reporter :FAM
nm550 600
Abs
orbt
ion Fluorescence
Quencher :TAMRA
-Le spectre d’emission du Reporteur recouvre le spectre d’absorption du Quencher
FRET
Mécanisme de quenching
Excitation
Émission
FRET
TaqMan® MGB probes
NFQ non fluorescent quencherNouvelle innovation
MGB minor groove binderstabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3’)sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné)
NFQReporter
MGB
TaqMan ® versus SYBR ® Green
TaqMan ® SYBR ® GreenSpécificité -fixation des amorces
-hybridation de la sonde-conditions PCR
-fixation des amorces,--conditions PCR
Flexibilité -multiplexe,-détection de SNP-
---utilisation d’amorces dégénérées
Optimisation -standardisée -dépend du gène ciblé-vérifier la formation de dimère d’amorces
ROX™ comme référence passive
Le marqueur fluorescent ROX ™ permet de normaliser les variations de fluorescence non reliées à la PCR (fluorescence des plaques ou tubes, contamination du bloc PCR, légère variation du volume…)
ROX
Echantillon 2
FAM
ROX
Echantillon 1
FAM
Fluo
resc
ence
Fluo
resc
ence
Rn
Rn
Rn= Reporter / Passive référence
Détermination du Ct (cycle threshold) ou Cp (Crossing point)
Ct
La valeur de Ct est déterminée dans la phase exponentielle, à l’intersection de la ligne de base avec la courbe de fluorescence
Bruit de fond
Rn
Ligne de base
Ct
Efficacité de la PCR quantitative
Nom
bre
de c
opie
s (lo
g)
1
2
3
4
5
6
18 23 28 33 38Cycle seuil - Ct
Log N = -0,26Ct + 10,85R2= 0,998
Efficacité = 10(-pente) -1
Exemplepente = -0.26E = 10(0.26) –1
= 1.82 – 1= 0.82 soit 82 %
Si la pente est égale à 0.301 alors l’efficacité de la PCR quantitative est de 100 % : à chaque cycle le nombre d’ADN cible sera multiplié par deux.Si l’efficacité est de 82%, le nombre d’ADN cible sera multiplié par 1,64 !!!
PCR efficace à 100%
y = x (1 + E)n
cas spécifique E = 1 alorsy = x 2n
y=nombre de copie du gène cible
x=nombre de copie initiale
E=efficacité
n=nombre de cycle PCR
Quand E = 1 alors :
ΔCt = + 1 augmentation x2
ΔCt= + 3.32 augmentation x10
Quantification relative :
• pas besoin de courbe de standard
• calcul des résultats par comparaison des Ct
• nécessité de définir :- un gène servant de contrôle endogène,- un standard ou référence
• donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc)• est présent en quantité constante dans tous les échantillons• normalise :
les biais d’extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN)les variations d’efficacité de transcription inverse
le contrôle endogène :Quantification relative : Q-RT PCR
Le Standard :
• permet de comparer l’échantillon cible à un groupe de référence
• permet de rendre compte de la variation étudiée
• Peut être un groupe non traité, un t0 dans une cinétique, un input (en ChIP), un WT….
Quantification relative :
Contrôle endogène
Gène cible
ΔCt = 22 – 16 = 6
Ct=16 Ct=22 Cycle
ΔRn
Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène
Ct=16 Ct=22 Cycle
ΔRn
Ct=21Ct=15
Contrôle endogène
Gène cible
ΔCt = 21 – 15 = 6
Si 2 x plus de matrice ?
Quantification relative :
Comparaison de Ct
Ct=16 Ct=26 Cycle
ΔRnt2
Ct=12 Ct=22 Cycle
ΔRnt4
Ct=15 Ct=31 Cycle
ΔRnt7
Ct=16 Ct=32 Cycle
ΔRnT0 = standard
Contrôle endogène Gène cible
Quantification relative :
Comparaison de Ct
Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène
Ct gène cible – Ct contrôle endogène = ΔCt
Etape 2: normalisation par rapport au standard
ΔCt échantillon - ΔCt standard = ΔΔCt
Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible
X=2-ΔΔCt
Quantification relative :
Quantification relative des résultats :
64 64
1 1
standard
Aug
men
tatio
n pa
r x
t0
t2
t4
t7
Quantification absolue :
•besoin de courbe standard
• calcul des résultats en nombre de copies
• nécessité de définir :- le nombre de copies présentes dans l’extrait de référence- un gène cible servant de standard.
Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents
Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct
0
50
100
150
200
250
0 10 20 30 40
Nombre de cycles
Fluo
resc
ence
ém
ise
(UA
)
101106 105 104 103 102
Nom
bre
de c
opie
s (lo
g)
1
2
3
4
5
6
18 23 28 33 38Cycle seuil - Ct
Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998
Ct
Quantification absolue :
Créer une courbe standard avec de l’ADN génomique pour la Q- PCR
1.Identifier la taille du génome de l’organisme d’intéret.
2.Identifier la masse d’ADN dans le génome d’intéret
3.Diviser la masse du génome par le nombre de copies du gène d’interet par génome haploide.
4.Calculer la masse du gène d’intérêt pour avoir de 300 000 à 30 copies.
5.N copies du gène d’intéret× masse du génome haploide= masse de gDNA nécessaire
6.Calculer la concentration de gDNA nècessaire pour atteindre le nombre de copies du gène d’interet. Diviser la masse nécessaire (calculée en 4) par le volume à pipetter pour chaque réaction.
7.Préparer des dilutions successives du gDNA.
Quantification absolue :
Créer une courbe standard avec de l’ADN plasmidique pour la Q- PCR
1. Calculer la masse d’une seule copie du plasmide.
2. Calculer la masse du plasmide pour avoir de 300 000 à 30 copies
3. Calculer la concentration du plasmide nécessaire pour avoir le nombre de copiesnécessaires dans le volume voulu. Diviser la masse nécessaire (calculée en 2) par levolume à pipeter pour chaque réaction
4. Préparer des dilutions successives du plasmide.
Quantification absolue :
0
50
100
150
200
250
0 10 20 30 40
Nom
bre
de c
opie
s (lo
g)
1
2
3
4
5
6
18 23 28 33 38Cycle seuil - Ct
Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998
Nombre de cycles
Fluo
resc
ence
ém
ise
(UA
)
101106 105 104 103 102Ct
Résultat : l’échantillon d’ADN (ex: 25 ng) contient 10000 copies du gène cible
Quantification absolue : interprétation
Quantification absolue :
Courbe standard avec plasmide ou avec gDNA????
Intéret Inconvénient
plasmide •pureté de la séquence : pas d’amplification aspécifique•facilité de mise en oeuvre si présent au laboratoire
•efficacité de la PCR probablement supérieurepar rapport au gène étudié(on sur-estime donc la quantité de gène amplifié)
gDNA •l’efficacité de PCR est identique•le même gDNA peut être utilisé pour l’étude de différents gènes ( seuls les calculs sont à refaire)
•Besoin d’un ADN de bonne qualité (nondégradé)•Variabilité des échantillons biologiques•Besoin de choisir des amorces capable d’amplifier du gDNA
Quantification absolue ou relative ?Que choisir ???
absolute relative
Calcul efficacité oui Oui
Courbe standard oui Non
Gene de réference non oui
méthode Standard curve Comparative Ct
intéret Quantification permet de rendre compte d’unnombre de copies
Permet la comparaison directe entre deux groupes, états, …Coût de revient inférieur à l’absolute
inconvénient Courbe standard à chaque plaque, donc augmentation du coûtProblème de conservation du standard
Le calcul d’éfficacité dePCR du calibrateur et de la cible est indispensable pour ne pas introduire de biais
•Etude de l’expression des gènes : Détermination de niveaux d’expression ARNmKnock-Down de gènes (SiRNA)Validation des expériences de puces à ADN
•Etude des gènes :PolymorphismeMutationsDiagnostic prénatal (anomalies chromosomiques)maladies génétiques Diagnostics en oncologie (charge tumorale)
•Etude de la répression des gènes: ChIPMeDIP
Applications :
SNP= Single Nucléotide Polymorphisms et discrimination allélique
Les Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) désignent despolymorphismes d'une seule paire de base du génome, entre individusd'une même espèce.
Ces variations sont très fréquentes (e.g. 1/1000 paire de bases dans legénome humain).
La discrimination allèlique permet la reconnaissance d’un allèle donnégrâce à une sonde fluorescente spécifique.
Cette technique permet l’établissement de génotypage rapide (lignéeanimaux transgéniques)
Homozygotes allele 1
Homozygotes allele 2
hétérozygotes
SNP= Single Nucléotide Polymorphisms et discrimination allélique
Chaque allèle aura une sonde spécifique :•allèle 1 non muté avec une sonde en FAM•allèle 2 muté avec une sonde en VIC.
La séquence de la sonde sera encadrée par un couple de primers identiques.
microARN
http://microrna.sanger.ac.uk/
•ARN simple-brin longs d'environ 21 à 24 nucléotides• plusieurs centaines de gènes de microARN dans lesgénomes de la plupart des organismes pluricellulaires.•Les miRNA sont des répresseurs post-transcriptionnels :en s'appariant à des ARN messagers, ils guident leurdégradation, ou la répression de leur traduction enprotéine.•Seuls les miRNA matures sont responsables derépression
Sondes microARN matures :
Synthèse de primers de RT spécifiques et Q-PCR pour microARN mature
ChIP
Mise en évidence "in vivo" des facteursde transcription sur leur site de liaisonau niveau des promoteurs desgènes, soit de l'état des histones auniveau des promoteurs.
Le CHIP consiste à purifier descomplexes ADN-protéines, liés par duformaldéhyde.
Cross-link des protéines à l’ADN en fixant les cellules au
formaldehyde
Purification des noyaux etsonication pour fragmenterl’ADN génomique en fragmentsde 200 à 1000 bp pour« mapper » les interactions ADNprotéines
Immunoprécipitationavec un anticorps primaire d’intéret
Collecte du complexe Anticorps- protéine- ADN
immunoprécipité à l’aide de billes couplées à la protéine G
Dépontage des complexes protéine-ADN par incubation à
65°C pour relarguer l’ADN
Analyse de l’ADN purifié par Q-PCR
La méthylation des cytosines peut être responsable de silencing épigénétique, c’est lamodification de l’ADN la plus répandue chez les eucaryotes.
Le MeDIP est une approche par immunoprécipitation de l’ADN méthylé. Le principe est quel’ADN est fragmenté par sonication et immunoprécipité avec un anticorps qui reconnaitspécifiquement la 5mC (5 methylcytidine).
Ce protocole est utilisé pour générer des profils de méthylation de l’ADN à l’échelle du génomechez les mammifères et les plantes, et pour identifier les gènes anormalement méthylés dans lescellules cancéreuses.
MeDIP : Methylated DNA ImmunoPrecipitation
MeDIP Diagénode
Interprétations des résultats du stageEtapes de traitement des données :
Faire la moyenne des Ct des duplicats / triplicats Faire le calcul pour chaque IP :
% input= AE^(Ctinput – CtChIP) x Fd x 100%
Exemple pour le binome 1 ChIP K4me3 sur cellules MLL-/-% input= 1,96^(31,595-30,085)x1/100 x 100 = 2,85%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1 K4me3 2 K4me3 3 K4me3 4 K27me3 5 K27me3 6 K27me3 7 Mock lapin
8 Mock lapin
9 Mock lapin
binome1
binome2
i+ i- iF
i+ i- iF
i+ i- iF
Bons calculs à tous et merci de votre attention
!!!Calculs ChIP :
% input= AE^(Ctinput – CtChIP) x Fd(only for input) x 100%
Calculs MeDIP :
% (MeDNA-IP/ Total input)= 2^[(Ct(20%input) -3,32) -Ct(MeDNA-IP)]x 100%
Références bibliographiques
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• Dheda K, Huggett JF, Chang JS, Kim LU, Bustin SA, Johnson MA, Rook GA, Zumla A. The implications of using an inappropriate reference gene for real-time reverse
transcription PCR data normalization. Anal Biochem. 2005 Sep 1;344(1):141-3.
• Bustin SA, Nolan T. Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. J Biomol Tech. 2004 Sep;15(3):155-66. Review.
• Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000 Oct;25(2):169-93.
• Bustin SA. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol. 2002 Aug;29(1):23-39.
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•David Baulcombe (2002) "An RNA Microcosm", Science, 297: 2002-2003.
•Lee, R.C., Feinbaum, R.L. and Ambros, V. (1993) "The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14", Cell, 75:
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•User Bulletin #2 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System December 11, 1997 (updated 10/2001)
•Weber M, Davies JJ, Wittig D, Oakeley EJ, Haase M, Lam WL, Schubeler D: Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA
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•Weber M, Hellmann I, Stadler MB, Ramos L, Paabo S, Rebhan M, Schubeler D: Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation
in the human genome. Nat Genet 2007, 39:457-466.
•Zilberman D, Gehring M, Tran RK, Ballinger T, Henikoff S: Genome-wide analysis of Arabidopsis thaliana DNA methylation uncovers an interdependence between
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•Sensitivity of multiplex real-time PCR reactions, using the LightCycler and the ABI PRISM 7700 Sequence Detection System, is dependent on the concentration of the
DNA polymerase M. M. Exner* and M. A. Lewinski Molecular and Cellular Probes (2002) 16, 351±357
•Reviews in Biology and Biotechnology Vol.2, No 2, December 2002 La PCR en temps réel: principes et applications Elyse Poitras et Alain Houde*
•Creating Standard Curves with Genomic DNA or Plasmid DNA Templates for Use in Quantitative PCR (Doc ABI)
•User Bulletin #5 ABI PRISM®7700 Sequence Detection System August 10, 1998 (updated 01/2001) SUBJECT: Multiplex PCR with TaqMan® VIC Probes
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