View
222
Download
3
Category
Preview:
Citation preview
ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
========000========
BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN
ðỀ TÀI KHCN ðẶC BIỆT CẤP ðẠI HỌC QUỐC GIA
Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật
và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn
Mã số: QG. 09. 48
Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên
Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học
Hà Nội, năm 2011
1
MỤC LỤC
PHẦN I. BÁO CÁO TÓM T ẮT 3
Bằng tiếng Việt 3
Bằng tiếng Anh 8
PHẦN II. BÁO CÁO T ỔNG KẾT 12
Giải thích chữ viết tắt 13
Danh sách những người tham gia thực hiện ñề tài 13
Danh mục các bảng và hình 14
MỞ ðẦU 15
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LI ỆU 16
1.1 Kháng sinh 16
1.1.1. Khái niệm chung 16 1.1.2. Lịch sử phát triển kháng sinh 16
1.1.3. Phân loại kháng sinh 18
1.1.4. Kháng sinh kháng khối u 21
1.1.5. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới 21
1.2 Xạ khuẩn 22
1.2.1. Các ñặc ñiểm chung 22
1.2.2. Xạ khuẩn và các chất thứ sinh 23
1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam 23
1.4 Nội dung và mục ñích của nghiên cứu 24
CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. Nguyên vật li ệu 25
2.1.1. ðối tượng nghiên cứu 25
2.1.2. Hóa chất 25
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu 25
2.2.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 25
2.2.2. Các vi sinh vật kiểm ñịnh 26
2.2.3. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 27
2.2.4. Chiết bằng ethyl-acetate 28
2.2.5. Sắc ký các chất chiết thu ñược 28
2.2.6. Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline 29
2.2.7. Phép thử ñộc tế bào 30
2
2.2.8. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 30
CHƯƠNG III. K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở
Vườn Quốc gia Cát Bà 32
3.2. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 33
3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 35
3.4. Phân tích sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate 36
3.4.1. Sắc ký bản mỏng (TLC) 36
3.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 38
3.5. ðặc ñiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 42
3.5.1. ðặc ñiểm hình thái của các chủng thuộc Streptomyces 42
3.5.2. Giải trình tự rDNA 16S ñối với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Nonomuraea 44
3.6. Sàng lọc khả năng sinh anthracyline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 45
3.7. Các nghiên cứu liên quan ñến các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 46
3.7.1. Hoạt tính gây ñộc tế bào 46
3.7.2. Phân tích HPLC dịch nuôi chiết trong ethyl acetate
của các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 47
KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ 53
TÀI LI ỆU THAM KH ẢO 55
PHỤ LỤC 62
3
PHẦN I. BÁO CÁO TÓM T ẮT
1. Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh
vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn 2. Mã số: QG.09.48
3. Thời gian thực hiện: 2 năm (2009 - 2011)
4. Cấp quản lý: ðại học Quốc gia Hà nội
5. Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên
Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ðHQGHN
ðiện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: quyennhm@vnu.edu.vn
6. Cán bộ tham gia: - TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
- TS. ðinh Thúy Hằng
- CN. Lê Phương Chung
- ThS. Phan Thị Hà
- CN. Lê Hồng Anh
7. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ña dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ
khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ñảo
Cát Bà, một vườn quốc gia có ña dạng sinh học cao ở Việt Nam. Các chất kháng sinh do
các chủng lựa chọn sinh ra ñược tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm kiếm bản chất của chúng.
Cụ thể là:
- Phân lập xạ khuẩn từ mẫu ñất và lá mục ở ñảo Cát Bà, Hải Phòng qua ñó ñánh
giá mức ñộ ña dạng của ñối tượng
- Sàng lọc các chủng có hoạt tính kháng sinh cao
- Tách chiết sơ bộ thu các chất có hoạt tính kháng sinh từ các chủng chọn lọc ñược
- Nghiên cứu tính chất của các chất kháng sinh thu ñược bằng sắc ký bản mỏng
(TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Phân loại, ñịnh danh các chủng xạ khuẩn (bằng mô tả hình thái hoặc bằng giải
trình tự gene 16S của rDNA) có hoạt tính kháng sinh cao.
4
- Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của chất chiết từ dịch
nuôi của một số chủng có tiềm năng
- Phân tích HPLC chất chiết từ dịch nuôi của các chủng có hoạt tính kháng tế bào
ung thư làm cơ sở cho nghiên cứu bản chất của các hợp chất ñó.
8. Các kết quả ñạt ñược
8.1. Kết quả về mặt khoa học
- 424 chủng xạ khuẩn (gồm 353 chủng từ mẫu ñất và 71 chủng từ mẫu lá cây mục) thu
thập tại vườn Quốc gia ñã ñược phân loại (bằng quan sát hình thái kết hợp với ñọc
trình tự gene rDNA 16S) cho thấy gần 70% thuộc chi Streptomyces, còn lại thuộc
nhóm xạ khuẩn hiếm. Các chi xạ khuẩn hiếm có tỷ lệ cao trong bộ sưu tập này là
Micromonospora (hơn 7% trong tổng số 424 chủng), Nonomuraea (4%) và Nocardia
(gần 3%).
- 424 chủng xạ khuẩn này ñã ñược sàng lọc hoạt tính kháng sinh với 4 vi sinh vật kiểm
ñịnh ñại diện cho 3 nhóm vi sinh vật lớn là vi khuẩn (Gram âm: Escherichia coli,
Gram dương: Micrococcus luteus), nấm men (Candida albicans) và nấm sợi
(Fusarium oxysporium).
- 115 chủng trong số 424 chủng nói trên ñã biểu hiện hoạt tính kháng ít nhất một trong
bốn vi sinh vật kiểm ñịnh.
- Với 115 chủng có hoạt tính này có 2 chủng (A1073, A1393) kháng cả 4 chủng vi sinh
vật kiểm ñịnh, 7 chủng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470)
kháng với 3 chủng kiểm ñịnh, 8 chủng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427
và A444) có hoạt tính kháng 2 vi sinh vật kiểm ñịnh. Xét về ñối tượng bị kháng thì 14
chủng có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn Gram âm (E. coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn
Gram dương (M. luteus); 11 chủng có hoạt tính kháng cả hai nhóm vi khuẩn; 12 chủng
có hoạt tính kháng nấm sợi (F. oxysporium) và chỉ 6 chủng có hoạt tính kháng nấm
men (C. albicans). Như vậy tổng cộng có 17 chủng có hoạt tính kháng ít nhất 2 vi sinh
vật kiểm ñịnh ñã ñược lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. ðiều thú vị là 17 chủng
này chỉ thuộc 2 chi Streptomyces (10 chủng) và Nonomuraea (7 chủng).
- 17 chủng ñã ñược nuôi cấy thu dịch nuôi và dịch nuôi ñã ñược chiết bằng ethyl acetate
ñể thu các hợp chất có hoạt tính sinh học. Hiệu quả chiết chất tan trong ethyl acetate
(từ 1 lít dịch nuôi cấy) dao ñộng từ 30mg (chủng A154) ñến 2152mg (chủng A444).
5
So với chất khô thì chất chiết ñược chiếm từ 0,51% (chủng A154) ñến 14,89% (chủng
A396).
- Các chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 17 chủng xạ khuẩn ñã ñược phân tích
sắc ký bản mỏng (TLC) ñể so sánh với ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin,
erythromycin và với dịch nuôi của chủng ñối chứng sinh anthracycline (A16). Số băng
thu ñược sau sắc ký dao ñộng từ 1 ñến 4 băng. Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232,
A410, A427, A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ
có 2 băng, 4 chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390,
A1022) cho phổ 4 băng. So với các kháng sinh chuẩn thì thấy chất chiết từ dịch nuôi
của chủng A396 là có băng tương ứng với chloramphenicol; chất chiết từ dịch nuôi
chủng A45 và A410 có băng trùng với băng của erythromycin, không có mẫu nào có
băng tương ñồng với các băng của kháng sinh kitasamycin. So với dịch nuôi của
chủng ñối chứng sinh anthracycline, các mẫu A1018 và A1022 có phổ sắc ký rất gần
với ñối chứng này.
- Các chất tan trong ethyl acetate của 17 chủng lựa chọn ñược ñược tiếp tục phân tích
qua sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các ñiều kiện sắc ký như với các kháng
sinh chuẩn. Kết quả cho thấy ngoài chủng A396 có ñỉnh tương tự với ñỉnh thu ñược từ
chloramphenicol, tất cả các mẫu còn lại không tìm thấy mối tương quan nào so với các
kháng sinh ñối chứng.
- Một trong những nghiên cứu nữa ñược thực hiện với 17 chủng chọn lọc ñược là thực
hiện thử nghiệm biến ñổi màu phụ thuộc pH. ðây là phép thử ñặc hiệu ñối với các
chủng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline. Qua ñó nhận thấy có hai chủng có
biểu hiện dương tính với phép thử này là A1018 và A1073.
- Như vậy với các bước nghiên cứu liên quan, từ 17 chủng có hoạt tính kháng sinh
tương ñối cao, 3 chủng ñược lựa chọn thử nghiệm hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư
người là A1018 (có phổ TLC và phản ứng ñổi màu pH tương tự chủng ñối chứng),
A1022 (có phổ TLC tương tự ñối chứng) và A1073 (phản ứng ñổi màu pH).
- Bằng thử nghiệm với ba dòng tế bào ung thư người là ung thư gan, phổi và cơ vân tim,
các hợp chất chiết từ dịch nuôi của cả ba chủng chọn lọc ñược của ñề tài ñều có tác
dụng dương tính với cả ba dòng tế bào ung thư. So sánh về chỉ số IC50 (nồng ñộ gây
chết 50% tế bào ung thư, tức chỉ số này càng nhỏ thì hiệu quả gây ñộc tế bào càng lớn)
thì thấy trong ba mẫu nghiên cứu chất chiết từ dịch chiết của chủng A1073 có chỉ số
này thấp nhất và thấp gần bằng ñối chứng dương (một trong những chất có khả năng
6
diệt tế bào) của phép thử; thấp bằng so với chủng ñối chứng sinh anthracycline và thấp
hơn ñáng kể so với hai chủng còn lại. ðây là một trong những kết quả nổi bật nhất của
ñề tài, làm tiền ñề cho các hướng nghiên cứu tiếp theo.
- Chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 3 chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư
nói trên ñã ñược phân tích HPLC với cùng một ñiều kiện sắc ký với các ñối tượng
tương tự hiện ñang ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử,
Trung tâm công nghệ sinh học quốc tế, ðại học Tổng hợp Osaka. Qua phân tích kết
quả sau sắc ký các chất chiết ñược từ dịch nuôi chủng A1018 cho 8 ñỉnh khác nhau, từ
chủng A1022 cho 5 ñỉnh khác nhau và chủng A1073 cho 6 ñỉnh khác nhau. Các dữ
liệu liên quan hiện ñang ñược so sánh phân tích với cơ sở dữ liệu hiện có tại cơ sở nói
trên nhằm tìm kiếm bản chất của các chất ñó. ðây là một kết quả thể hiện sự hợp tác
quốc tế của ñề tài.
8.2. Kết quả ñào tạo
ðề tài ñã góp phần ñào tạo 01 Thạc sỹ chuyên ngành công nghệ sinh học thuộc
chương trình ñào tạo liên kết quốc tế với ðại học Liege, Vương quốc Bỉ với tên ñề tài là:
“Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam”. Học viên Nguyễn Phương Chung ñã bảo vệ thành công luận văn với kết quả
xuất sắc trước Hội ñồng ngày 24 tháng 2 năm 2011.
8.3. Bài báo
Kết quả của ñề tài ñã ñược ñúc kết thành 02 bài báo:
• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam. Tạp chí Công nghệ sinh học (ñã nhận ñăng).
• Bước ñầu nghiên cứu sàng lọc kháng sinh chống ung thư từ xạ khuẩn thu thập ở
vườn Quốc gia Cát Bà, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, ðại học Quốc gia Hà Nội
(ñã nhận ñăng).
9. Tình hình sử dụng kinh phí
- Tổng kinh phí của ñề tài ñược duyệt: 100.000.000 VNð
- Tổng kinh phí của ñề tài ñã quyết toán: 100.011.400 VNð, bao gồm các mục:
+ Chi phí thuê mướn: 40.000.000
+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 49.084.000
+ Photo tài liệu, văn phòng phẩm: 4.235.000
7
+ Hội họp: 1.500.000
+ Thông tin liên lạc: 442.000
+ Chi khác (lệ phí của ñơn vị DT): 4.750.000
Xác nhận của cơ quan Chủ trì ñề tài
Xác nhận của ðại học Quốc gia
8
SUMMARY
1. Project title: Investigation and study some substances which have antibiotic
activities against microorganisms and cancer cell lines from
actinomycetes
2. Code: QG.09.48
3. Duration: 2009 – 2011
4. Organizer: Institute of Microbiology and Biotechnology,
Vietnam National University, Hanoi (VNUH)
5. Project leader: Dr. Nguyen Huynh Minh Quyen
6. Key participants: Dr. Nguyễn Quỳnh Uyển
Dr. ðinh Thúy Hằng
BSc. Lê Phương Chung
MSc. Phan Thị Hà
BSc. Lê Hồng Anh
7. Objectives and study contents
Objective: This project was carried out to study biodiversity and to screen antibiotics from
actinomycete strains collected from a national park with high biodiversity in Vietnam,
named Catba National Park. The antibiotics produced by these strains were studied
further in order to find out their nature.
Study contents:
• Isolating actinomycete strains from soil and litter samples on Catba island (Hai
Phong) and then evaluating their biodiversity
• Screening the strains possessing high antibiotic activities
• Primary extracting the antibiotics from these strains
• Studying the properties of these antibiotics by use thin layer chromatography
(TLC) and high pressure liquid chromatography (HPLC)
• Classifying and identifying the strains possessing high antibiotic activities by use
their morphology and the sequences of 16S rDNA gene
• Testing cytotoxic activity of some potential strains
• HPLC analyses of the extracts from the strains capable of producing anticancer
agents to obtain data base in order to study their nature.
8. The obtained results
9
• 424 actinomycete strains, including 353 strains from soil and 71 strains form litter
samples, were collected at Cat Ba island and then were classified. As the result
through their observation morphology and the sequences of 16S rDNA gene, the
genus Streptomyces occupied about 70%, the rare actinomycetes were the rest.
Among the latter, Micromonospora occupied more than 7%, Nonomuraea
appeared about 4% and Nocardia was 3% in total.
• 424 above strains were screened their antibiotic activity against 4 tested
microorganisms, representative for bacteria (Negative Bacterium: Escherichia coli;
Positive Bacterium: Micrococcus luteus), yeast (Candida albicans) and fungi
(Fusarium oxysporium).
• Of 424 strains above, 115 strains out were shown antimicrobial activity against at
least one of the 4 testes microrganisms.
• Among these 115 strains, 2 strains (A1073, A1393) were shown activity against all
of the 4 tested microrganisms, 7 strains (A232, A390, A1018, A1022, A1041,
A1043 và A1470) against 3, 8 strains (A45, A149, A154, A160, A396, A410,
A427 và A444) against 2 testes microrganisms. Regarding the tested
microorganisms, 14 strains were shown inhibitory activity to Negative bacterium
(E. coli), 14 strains were shown inhibitory activity to Positive bacterium (M.
luteus); 11 strains were shown activity against both of these; 12 strains were shown
activity against fungi (F. oxysporium) and just only 6 strains were shown activity
against yeast (C. albicans). In general, 17 strains in total possessing activity
against at least 2 tested microoragnisms were selected for further study.
Interestingly, 17 these strains jsut belonged to 2 genus Streptomyces (10 strains)
and Nonomuraea (7 strains).
• 17 strains were cultured to get their cultured broths and the cultured broths were
extracted by ethyl acetate in order to obtain bioactive compounds. The yeild of
extracted substances soluble in ethyl acetate (from 1 liter cultured broth) was
variable from 30mg (strains A154) to 2152mg (strains A444). In comparison with
their respective dry mass, extracted subtances occupied from 0,51% (strains A154)
to 14,89% (strains A396).
• The substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 17 actinomycete
strains were analysed by thin layer chromatography (TLC) to compare their profile
with that of three standard antibiotics (chloramphenicol, kitasamycin,
10
erythromycin) and the cultured broth of control strain, capable of producing
anthracycline (A16). The bands obtained after chromatography were varied from 1
to 4 bands. 8 strains (A149, A154, A160, A232, A410, A427, A1073, A1393) were
shown 1 band, 3 strains (A396, A444, A1018) were shown 2 bands, 4 strains (A45,
A1041, A1043, A1470) - 3 bands and 2 strains (A390, A1022) - 4 bands. In
comparison with the standard antibiotics, the substances extracted from the
cultured broth of strain A396 were shown the similar band to chloramphenicol;
substances extracted from the cultured broth of the strains A45 and A410 were
shown the same band of erythromycin, none of them were shown the band similar
to the bands of antibiotic kitasamycin. In comparison with cultured broth of control
strain producing anthracycline, samples A1018 and A1022 were shown the
chromatography profile very close with this of the control.
• The substances soluble in ethyl acetate of the 17 selected strains were analysed by
high performance pressure chromatography (HPLC) in the same condition as that
of the standard antibiotics. Except strain A396, which was shown the peak similar
to that of chloramphenicol, the rest of the samples were not shown any connection
with the control antibiotics.
• Furthermore 17 selected strains tested to change the colour based on the
enviromental pH. This is a specific test for strains producing antibiotic of group
anthracycline. Two strains A1018 and A1073 were shown positive results in this
test.
• 3 strains out of 17 strains above (A1018 (the TLC profile and change the coulour
based on pH were similar to that of the control strain), A1022 (TLC profile is
similar to that of the control) and A1073 (change the coulour based on pH)) with
relatively high antibiotic activity, were selected to test cytotoxicity against human
cancer cell lines. Crude extracts of three strains above exhibited significant
cytotoxic activity against hepatocellular carcinoma, lung cancer, and
rhabdosarcoma human cell lines.
• By testing with hepatocellular carcinoma, lung cancer, and rhabdosarcoma human
cell lines, the substances extracted from the cultured broths of three selected strains
exhibited positive results against all of these cell lines. By the comparison of IC50
value (i.e., the concetration of agents kills 50% cancer cells in number, which
means the smaller this value is, the higher the cytotoxicity is), the substance
11
extracted from strain A1073 was shown the lowest value and this value is very
close to that of the positive control of this test. This value is also as low as that of
the control strain producing anthracycline and significant lower in comparison with
the rest of the two strains. This is one of the outstanding results of the project and
this provides the base to develop further research.
• Substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 3 strains above were
analysed by HPLC at the same chromatography condition for similar subjects at
Molecular Microbiology Lab, International Center for Biotechnology, Osaka
University. HPLC analyses of ethyl acetate crude extracts of the three strains
A1022, A1018 revealed relatively high complexity, possessing 5 peaks, 8 peaks
and 6 peaks, respectively. Their data base is going to compare with that available
at this Lab in order to find out the nature of these substances. This is one of
international collaboration of the project.
9.1. Education results
The project contributes to educating 01 Master student, field Biotechnology,
belonged to international program jointed with University of Liege, Belgium. The
dissertation is: “Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from
Catba island, Vietnam”. The master students Nguyễn Phương Chung did defend
successfully on Feb 24th, 2011.
9.2. Publication:
All of the results above resulted in 02 publications:
• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,
Vietnam. Journal of Biotechnology (accepted).
• Primary screening anticancer antibiotic from actinomycetes isolated at Cát Bà
National Park, Journal of Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam
National Unversity, Hanoi (accepted).
Xác nhận của cơ quan Chủ trì ñề tài
Xác nhận của ðại học Quốc gia
12
PHẦN II. BÁO CÁO T ỔNG KẾT
13
GIẢI THÍCH CH Ữ VIẾT TẮT
DMSO: Dimethyl Sulfoxide
DNA: Deoxyribonucleic acid
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay
HPLC: High-performance liquid chromatography
rDNA 16 S: gene 16S của DNA ribosome
TE: ñệm có 10mM Tris-HCl và 1mM EDTA, pH8,0
TLC: Thin layer Chromatography
DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA TH ỰC HIỆN ðỀ TÀI
1. Chủ trì: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên
2. Những người thực hiện:
- TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
- TS. ðinh Thúy Hằng
- CN. Lê Phương Chung
- ThS. Phan Thị Hà
- CN. Lê Hồng Anh
14
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Danh mục bảng
Bảng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Bảng 2.1 ðiều kiện phân tích HPLC của các chất chuẩn
Bảng 3.1 Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập ñược
Bảng 3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
Bảng 3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
Bảng 3.4. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ các chủng xạ khuẩn chọn lọc
ñược
Bảng 3.5. Các ñặc ñiểm nhận dạng của 10 chủng thuộc chi Streptomyces
Bảng 3.6. Kết quả xác ñịnh hoạt tính gây ñộc tế bào
Bảng 3.7. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ 3 chủng có hoạt tính gây ñộc
tế bào ung thư
Danh mục hình
Hình 1.1 Kháng sinh ñược phát hiện qua các năm
Hình 1.2 Sự tiến hóa của penicillin G
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của daunorumycin (DNR) và idarumycin (IDA)
Hình 3.1. ðánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn
Hình 3.2. Phổ TLC chất chiết từ dịch ngoại bào của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
Hình 3.3. Phổ HPLC của chloramphenicol (A) và chất chiết từ chủng A396 (B)
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc một số chủng Streptomyces
Hình 3.5. Hệ sợi mang bào tử của một số chủng Streptomyces
Hình 3.6. Cây chủng loại phát sinh trình tự rDNA 16S cho thấy vị trí của 7 chủng xạ
khuẩn hiếm trong chi Nonomuraea
Hình 3.7. Sự thay ñổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng A1018 và A1073
Hình 3.8. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1018
Hình 3.9. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1022
Hình 3.10. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1073
15
MỞ ðẦU
Sức khỏe luôn là một trong những vấn ñề ñược chú trọng nhất trong mỗi quốc gia.
Mặc dù các thành tựu có ñược trong ngành hoá dược ñã ñem lại sự phong phú về chủng
loại dược phẩm, nhưng việc tìm kiếm và sử dụng trực tiếp các sản phẩm tự nhiên có hoạt
tính sinh học trong việc chữa trị các bệnh nan y vẫn luôn là hướng ñược quan tâm hiện
nay. Trong một tổng kết về các loại dược phẩm hiện ñang lưu hành trên thế giới, Newman
và cộng sự (2003) ñã cho biết từ năm 1981 ñến năm 2002 trong tổng số 868 loại thuốc
ñược phép ñưa vào sử dụng thì có ñến 58% là có nguồn gốc tự nhiên. ðặc biệt con số này
là 62% ñối với thuốc dùng trong ñiều trị bệnh ung thư.
Với nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú và ña dạng, Việt nam có cơ sở ñể phát
triển ngành công nghệ sinh học theo hướng ứng dụng y-dược này. ðây cũng là một bài
toán ñặt ra cho ngành dược nước nhà trước tình hình thuốc nhập ngoại chiếm vị trí áp ñảo
trên thị trường và trong các bệnh viện lớn. ðể cung cấp nguồn nguyên liệu hỗ trợ cho
ngành dược, các nghiên cứu về ñặc tính sinh học từ vi sinh vật có tác dụng chữa trị bệnh
cần phải ñược chú trọng, nhằm tạo tiền ñề cho việc phát triển dược phẩm mới với tính
năng ñiều trị cao và ít tác dụng phụ không mong muốn. Sự suy thoái môi trường sống ở
Việt nam hiện nay là nguyên nhân dẫn ñến ña dạng hoá các tác nhân gây bệnh. Các bệnh
viêm nhiễm và bệnh ung thư hiện ñang là ñối tượng cần thiết ñể các nhà nghiên cứu ñặt
mục tiêu tìm kiếm các chất có công dụng ức chế từ nguồn vi sinh vật nội ñịa.
Thay ñổi khí hậu, ô nhiễm môi trường sống là những yếu tố gây tác ñộng trực tiếp
ñến sức khỏe của con người. Theo dự báo toàn cầu, tại một số vùng trên thế giới, trong ñó
có Việt nam, tỷ lệ người mắc bệnh viêm nhiễm thông thường hay các bệnh nguy hiểm
như ung thư, tim mạch... ngày càng gia tăng (Ashutosh K., 2008; Goodfellow M., 1998).
Do vậy, việc nghiên cứu ñể tìm kiếm các chất có hoạt tính chữa trị bệnh từ các nguồn gốc
tự nhiên là một trong những hướng nghiên cứu trọng tâm của ngành công nghệ sinh học
tại nhiều quốc gia, ñặc biệt ở các nước phát triển. ðể nắm bắt ñược những kỹ thuật tiên
tiến trong lĩnh vực này và từng bước hoà nhập với sự phát triển chung, ñồng thời ñể ñáp
ứng nhu cầu trong việc bảo vệ sức khoẻ cộng ñồng, Việt nam cần chú trọng khai thác
nguồn ña dạng vi sinh vật của mình làm nguyên liệu ñể phát triển dược phẩm. Vì lẽ ñó
chúng tôi ñã ñề xuất và ñã ñược ðại học quốc gia Hà Nội phê duyệt thực hiện ñề tài:
“ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng
tế bào ung thư từ xạ khuẩn”
16
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LI ỆU 1. 1 Kháng sinh
1.1.1. Khái ni ệm chung
Theo ñịnh nghĩa truyền thống thì kháng sinh (còn ñược gọi là trụ sinh) là những
chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách ñặc
hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp ñộ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi
khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Theo ñịnh nghĩa hiện
nay, kháng sinh ñược hiểu là các hợp chất hóa học do vi sinh vật sinh ra và ở nồng ñộ
thấp chúng có thể kìm hãm sự sinh trưởng hoặc tiêu diệt (các) vi sinh vật khác (Nduka,
2007).
Hiện nay các chất có hoạt tính sinh học có khả năng diệt khuẩn gồm các chất
kháng sinh truyền thống, các sản phẩm trao ñổi chất như các acid lactic do các vi khuẩn
lactic sinh ra, các chất phân giải như lysozyme, các loại ngoại ñộc tố có bản chất protein,
các bacteriocin…. Các “vũ khí sinh học” này ñược quan tâm ñặc biệt do tính ña dạng và
cả do chúng có nhiều trong tự nhiên (Margaret & Milind, 2007).
Thực, ñộng vật bậc cao cũng có khả năng sinh “kháng sinh” tuy nhiên các hợp chất
này nằm ngoài ñịnh nghĩa nói trên. Tương tự như vậy, mặc dù cũng do vi sinh vật sinh ra
nhưng bacteriocin cũng không ñược coi là kháng sinh không chỉ vì chúng có khối lượng
phân tử không lớn như các chất kháng sinh thông thường khác mà còn do chúng chủ yếu
ảnh hưởng ñến các vi sinh vật gần với vi sinh vật sản sinh ra bacteriocin. So với
bacteriocin, các chất kháng sinh ña dạng về bản chất hóa học và tấn công các vi sinh vật
không có quan hệ họ hàng. ðiểm khác biệt quan trọng nữa là trong khi thông tin di truyền
của các chất kháng sinh thường nằm trên một vài gen thì bacteriocin chỉ cần gen ñơn.
(Nduka, 2007). ðến nay ñã có khoảng 16.500 kháng sinh ñược phát hiện từ vi sinh vật, và
hàng năm hàng chục kháng sinh mới ñược phát hiện (Hopwood, 2007).
1.1.2 Lịch sử phát tri ển kháng sinh
Kháng sinh là thuốc ñược con người dùng chủ yếu ñể chống các bệnh truyền
nhiễm. Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần rất lớn trong các bệnh của con người và ñộng
vật. Cho ñến nửa sau của thế kỷ 19 người ta ñã phát hiện ra rằng vi sinh vật chính là thủ
phạm gây ra hàng loạt các bệnh truyền nhiễm. Do ñó liệu pháp hóa học nhằm vào các vi
sinh vật gây bệnh ñã ñược phát triển thành liệu pháp ñiều trị chính.
17
Vào năm 1928, Fleming phát hiện ra penicillin và kháng sinh này ñã ñược dùng
trong ñiều trị vào những năm 1940. Ngay sau ñó penicillin ñã trở thành một kháng sinh
nổi tiềng vì ñã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranh thế giới II (Saga &
Yamaguchi, 2008).
Từ những năm 1940 ñến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới ñược xác
ñịnh hầu hết từ xạ khuẩn, và ñó trở thành thời kỳ vàng son của hóa liệu pháp kháng sinh
(Hình 1.1).
Hình 1.1 Kháng sinh ñược phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007).
Năm 1944, streptomycin ñược phát hiện từ vi khuẩn ñất Streptomyces griseus. Sau
ñó ñến chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh thuộc nhóm macrolide và
glycopeptide (tức vancomycin) ñược phát hiện từ vi khuẩn ñất. Các kháng sinh tổng hợp
như nalidixic acid, thuốc chống vi sinh vật có bản chất quinolone ñã ñược tạo ra vào năm
1962. Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu ñược phổ kháng vi sinh vật rộng
hơn, hoạt tính kháng vi sinh vật cao hơn ví dụ như các kháng sinh β-lactam. Lớp β-lactam
gồm penicillin, cephem, carbapenem và monobactam. Penicillin ban ñầu có tác dụng hiệu
quả lên vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus. Sau ñó, S. aureus sinh ra các
enzyme phân giải penicillin- penicillinase, nên người ta phát triển methicillin. Bên cạnh
ñó, ñể mở rộng phổ tác dụng của ampicillin (là kháng sinh chống vi khuẩn Gram âm
Enterobacteriaceae) người ta ñã phát triển ñược piperacillin có thể kháng ñược cả
Pseudomonas aeruginosa (Hình 1.2).
18
Hình 1.2 Sự tiến hóa của penicillin G (Saga et al, 2008)
Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong ñiều trị ở thế kỷ 20 ñã
làm giảm ñáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ 1980 số kháng sinh mới ñược
ñưa vào ñiều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển và thử nghiệm thuốc mới ngày
càng lớn. Bên cạnh ñó, một hiện trạng ñáng báo ñộng là ngày càng tăng các vi sinh vật
gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Hiện nay, việc kháng của vi khuẩn phải ñược
khắc phục bằng việc phát hiện ra các thuốc mới. Tuy nhiên vi sinh vật càng ngày càng
nhanh kháng thuốc và tốc ñộ ñó lại nhanh hơn tốc ñộ tạo ñược thuốc mới của con người.
Do vậy, các nghiên cứu cần phải tập trung vào làm thế nào ñể vượt qua tính kháng thuốc
kháng sinh cũng như phát hiện các kháng sinh mới có các cơ chế hoạt ñộng khác nhau
(Fred, 2006).
1.1.3 Phân loại kháng sinh
Có một số phương pháp phân loại kháng sinh. Một trong những phương pháp ñó là
dựa vào kiểu hoạt ñộng tức là kháng sinh ñó tác ñộng lên vách tế bào, kìm hãm protein…
Tuy nhiên có khi một kháng sinh lại có nhiều cơ chế ñồng thời cùng tác ñộng nên cách
phân loại này khó áp dụng. Một số trường hợp kháng sinh ñược phân loại dựa trên vi sinh
vật sản sinh ra kháng sinh ñó. Nhưng khi ñó có trường hợp một vi sinh vật có thể sinh ra
một số kháng sinh như Streptomyces sp. có thể sinh penicillin N và cephalosporin. Ngược
lại một kháng sinh cũng có thể do nhiều vi sinh vật sinh ra. Kháng sinh cũng ñã ñược
phân loại dựa theo con ñường sinh tổng hợp. Phổ tác ñộng cũng ñược dung, ví dụ như tác
19
ñộng lên vi khuẩn, nấm, nguyên sinh ñộng vật… Tuy nhiên một loại/nhóm kháng sinh
như aminoglycoside lại có thể có phổ tác dụng khác nhau (Nduka, 2007; Tortora et al,
2010).
Cách phân loại nêu dưới ñây là dựa trên cấu trúc hóa học của kháng sinh và theo
ñó kháng sinh ñược phân thành 13 nhóm (Bảng 1.1) (Nduka, 2007).
Bảng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học
Nhóm hóa học Ví dụ
Aminoglycoside Streptomycin
Ansamacrolide Rifamycin
Beta-lactam Penicillin
Chloramphenicol và các chất tương tự
Chloramphenicol
Linocosaminide Linocomycin
Macrolide Erythromycin
Nucleoside Puromycin
Puromycin Curamycin
Peptide Neomycin
Phenazine Myxin
Polyene Amphothericin B
Polyether Nigericin
Tetracycline Tetracycline
Như ñã ñề cập ở trên có nhiều cách phân loại kháng sinh và không có cách nào
thỏa mãn toàn bộ các yêu cầu về phân loại. Do vậy, cách phân loại dựa trên cấu trúc hóa
học nêu ở ñây cũng chỉ mang tính chất tương ñối và các ví dụ nêu ra là ñể dễ dàng nhận
biết nhóm có kháng sinh ñó mà thôi. Sau ñây là một số nhóm kháng sinh thông dụng:
a. Aminoglycoside là nhóm các kháng sinh mà các ñường amino ñược liên kết bằng
liên kết glycoside. Streptomycin và gentamicin là các ví dụ ñiển hình của nhóm này.
Streptomycin vẫn còn là thuốc thay thế trong ñiều trị bệnh lao, nhưng do sự phát triển tính
kháng thuốc nhanh chóng và các ảnh hưởng ñộc hại nghiêm trọng ñã làm hạn chế việc sử
dụng kháng sinh này. Các aminoglycoside kìm hãm tổng hợp protein ở nhiều vi khuẩn
Gram âm và một số vi khẩn Gram dương. ðôi khi chúng ñược dùng kết hợp với penicillin.
20
Thành viên của nhóm này thường có xu hướng ñộc hơn các nhóm kháng sinh khác
(Tortora et al, 2010).
b. Beta-lactam là các kháng sinh ñã ñược sử dụng rất nhiều và rất quan trọng trong ñiều
trị như penicillin, cephalosphorin cũng như các loại tương ñối mới như cephamycin,
nocardicin, thienamycin và clavulanic acid (Nduka, 2007).
Penicillin là chất diệt khuẩn, kìm hãm sự tạo thành vách tế bào. Có 4 loại penicillin:
penicillin-G phổ hẹp, ampicillin và các chất tương tự, các penicillin kháng penicillinase
và các penicillin phổ rộng có thể kháng các vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas. Các
penicillin-G kháng hiệu quả các chủng Gram dương như Streptococcus, Staphylococcus,
và một số vi khuẩn Gram âm như Meningococcus. Penicillin-G ñược dùng ñể ñiều trị các
bệnh như giang mai, lậu, viêm màng não, lao và bệnh ghẻ cóc (yaws). Penicillin V có
hoạt ñộng tương tự nhưng hiệu lực thấp hơn. Ampicillin và amoxicillin có tác dụng tương
tự penicillin-G nhưng có phổ tác dụng rộng hơn bao gồm cả một số vi khuẩn Gram âm
(Tortora et al, 2010).
c. Chloramphenicol kìm hãm sự sinh trưởng của nhiều vi khuẩn Gram dương và âm,
ñây là kháng sinh phổ rộng ñầu tiên ñược sử dụng trong ñiều trị. Chloramphenicol ñược
sản xuất từ nuôi cấy vi khuẩn ñất Streptomyces venezuelae. Chloramphenicol kìm hãm
sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gây nhiễu hoạt tính xúc tác của peptidyl-
transferase của ribosome trong pha kéo dài của phiên mã. Do phân tử lượng thấp, kháng
sinh này có thể thâm nhập vào nhiều vùng của cơ thể mà các loại thuốc khác không thể
thâm nhập ñược. Tuy nhiên, chloramphenicol có các ảnh hưởng bất lợi, trong ñó quan
trọng nhất là kìm hãm hoạt ñộng của tủy xương do ñó ảnh hưởng ñến sự tạo thành tế bào
máu (Creighton, 1999; Nduka, 2007).
d. Macrolide là nhóm các kháng sinh ñược ñặt tên do có mặt vòng macrocyclic lactone
trong phân tử. Macrolide ñược dùng nhiều nhất trong ñiều trị là erythromycin. Kiểu hoạt
ñộng của nó là kìm hãm tổng hợp protein. Erythromycin có tác dụng hiệu quả lên các cầu
khuẩn Gram dương và thường ñược dùng ñể thay thế penicillin trong các bệnh nhiễm
Streptococcus và Pneumococcus. Macrolide còn ñược dùng trong ñiều trị bệnh bạch hầu
và nhiễm trùng huyết (bacteremia). Tác dụng phụ của nhóm kháng sinh này có thể gồm
nôn, mửa và tiêu chảy, ñôi khi gây suy giảm thính giác (Nduka, 2007).
e. Tetracycline là nhóm kháng sinh phổ tương ñối gần nhau do Streptomyces spp sinh ra.
Tetracycline ảnh hưởng tới sự gắn tRNA mang amino acid vào ribosome ở tiểu ñơn vị
30S của ribosome 70S do ñó ngăn cản sự bổ sung amino acid vào chuỗi polypeptide ñang
tổng hợp. Tetracycline là các kháng sinh phổ rộng kháng các Streptococcus, Bacillus
21
Gram âm, rickettsia (gây sốt thương hàn) và Spirochetes (gây bệnh giang mai). Các kháng
sinh này cũng ñược dùng ñể ñiều trị nhiễm trùng ñường tiết niệu và viêm cuống phổi.
Nhờ phổ tác dụng rộng, tetracycline ñôi khi làm thay ñổi cân bằng hệ vi khuẩn nội sinh
thông thường ñược duy trì/kiểm soát bởi hệ miễn dịch của cơ thể, dẫn ñến việc nhiễm
khuẩn thứ cấp ví dụ như ở hệ tiêu hóa hay âm ñạo. Việc sử dụng tetracycline hiện nay còn
bị hạn chế do sự tăng tính kháng của các chủng vi khuẩn (Nduka, 2007).
1.1.4 Kháng sinh kháng ung thư (Anti-tumor antibiotics)
Ở sinh vật bậc cao mỗi tế bào có chức năng nhất ñịnh ñược thực hiện trong mối
tương tác/liên hệ với các tế bào khác. ðôi khi, tế bào mất liên hệ với các tế bào xung
quanh và phân chia một cách không ngừng ñể tạo thành cấu trúc gọi là khối u hay ung thư.
Ung thư ñược ñiều trị bằng một trong ba liệu pháp hoặc kết hợp các liệu pháp gồm phẫu
thuật ñể loại bỏ khối u, chiếu xạ ñể phá hủy chọn lọc các tế bào ung thư hoặc hóa trị.
Nhiều chất hóa học dùng trong hóa trị liệu ung thư là các sản phẩm thứ cấp do vi sinh vật
sinh ra do ñó ñược gọi là kháng sinh chống/kháng khối u (Nduka, 2007; Carlos et al,
2009). Một số nhóm kháng sinh ñã ñược dùng trong ñiều trị ung thư có thể kể ñến là
anthracycline, actinomycin và bleomycin.
Anthracycline ñược sử dụng rộng rãi trong ñiều trị ung thư như ung thư máu, ung
thư bạch huyết, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư
vú, ung thư bàng quang (Gewirtz, 1999). Một số
chủng ñược cho là sinh anthracycline là
Streptomyces coeruleorubidus hoặc
Streptomyces peucetius. Nhóm kháng sinh này
cho ñến nay ñược ghi nhận gồm daunorubicin
(DNR), doxorubicin, epirubicin và idarumycin
(IDA) (Hình. 1.3). Daunorubicin và adriamycin
gắn vào các cặp base do ñó kìm hãm tổng hợp
RNA và DNA. Mithramycin và chromomycin
A3 (là các actinomycin), kìm hãm tổng hợp
RNA phụ thuộc DNA. Bleomycin tương tác và
làm ñứt gãy DNA (Nduka, 2007; Carlos et al,
2009).
1.1.5. Nhu cầu phát tri ển kháng sinh mới
Một trong các thành tựu của y học hiện
ñại là phát triển các chất kháng sinh và các chất
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của daunorumycin (DNR) và
idarumycin (IDA)
22
kháng vi sinh vật khác. Tuy nhiên, rõ ràng là các vi sinh vật ñã và ñang phát triển tính
kháng với các kháng sinh hiện có bằng các ñột biến mới hoặc thay ñổi thông tin di truyền
(Arnold et al, 2009). Cần phải có các kháng sinh mới có tác dụng hiệu quả lên các vi
khuẩn kháng thuốc, ñặc biệt là các hợp chất chống khối u và vật ký sinh (anti-parasitic).
Tuy nhiên việc tìm kiếm các kháng sinh chống ung thư khó hơn nhiều so với các chất
kháng khuẩn hay kháng nấm về mặt phương pháp và biểu hiện (interpretation) (Nduka,
2007). Hơn nữa còn cần các kháng sinh mới cho nông nghiệp ñể làm thuốc chữa bệnh cho
cây trồng và vật nuôi vì các bệnh ñó sẽ ảnh hưởng ñến con người thông qua chuỗi thức ăn.
1.2 Xạ khuẩn
1.2.1 Các ñặc ñiểm chung
Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất ña dạng trong ñó ña số sinh trưởng hiếu khí
và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Tên xạ khuẩn –actinomycete- bắt nguồn từ
tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và ban ñầu xạ khuẩn ñược coi là nấm nhỏ vì
chúng sinh trưởng giống với nấm. Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở
cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất
(Ashutosh, 2008). ða số xạ khuẩn sinh bào tử, bào tử rất khác nhau về hình dạng và kích
thước. ðây là một trong những ñặc ñiểm ñể phân loại.
Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA. ða số xạ
khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong ñất, nước và xác thực vật. Xạ khuẩn
ñóng vai trò về mặt sinh thái quan trọng trong vòng tuần hoàn tự nhiên. Chúng phân hủy
và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như humic acid trong ñất. Nhiều chủng xạ
khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp chất liên quan ñến lignin bằng
cách sinh các enzyme thủy phân cellulose và hemicellulose và các peroxidase ngoại bào
(Pasti et al., 1990; Mason et al., 2001). Các chủng xạ khuẩn cũng xuất hiện trong môi
trường giàu hữu cơ như các compost, ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu nhiệt
(thermophilic) (Steger, 2006), và ở cống rãnh nước thải nơi mà các xạ khuẩn chứa
mycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn ñịnh, ñặc trưng (Seong
et al., 1999, Goodfellow et al., 1996).
Nhìn chung, nhiệt ñộ ôn hòa 25-30°C và pH trung tính là các ñiều kiện tối ưu cho
xạ khuẩn phát triển. Mặc dầu vậy, nhiều loài ñã ñược phân lập ở các môi trường khắc
nghiệt ví dụ như Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh ñược phân lập từ trầm tích hồ ở Nam
cực có thể sống ở nhiệt ñộ 0°C (Chen et al., 2005) và Nocardiopsis alkaliphila ñược phân
lập từ ñất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH 9.5-10 (Hozzein et al., 2004).
23
Về mặt phân loại, lớp xạ khuẩn có 5 phân lớp, 6 bộ trong ñó bộ ñược nhắc ñến
nhiều nhất (có giá trị trong y học và kinh tế) là bộ Actinomycetales. Bộ Actinomycetales
có 13 dưới bộ, 42 họ và khoảng 200 chi (http://en.wikipedia.org/wiki/Actinobacteria).
Xạ khuẩn thường ñược chia thành hai loại: Streptomyces và không phải
Streptomyces (non-Streptomyces). Chi xạ khuẩn ñược biết nhiều nhất là Streptomyces, với
khoảng 500 loài, tất cả ñều có GC cao (69–73 %) trong DNA. Streptomyces ñặc biệt
nhiều trong ñất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều phức các chất hữu cơ bằng các
enzyme ngoại bào. Thực tế, mùi mốc ñặc trưng của nhiều loại ñất liên quan ñến sự sản
sinh hợp chất hữu cơ dễ bay hơi gọi là geosmin
(http://science.howstuffworks.com/question479.htm). Một phần rất lớn các chất kháng
sinh ñược sự dụng hiệu quả trong ñiều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces trong ñó
ñược biết ñến nhiều nhất là streptomycin, erythromycin và tetracycline (Stuart, 2005).
1.2.2 Xạ khuẩn và các chất thứ sinh
Xạ khuẩn ñược ñặc biệt quan tâm là do khả năng sinh ra các hợp chất thứ sinh có
giá trị ứng dụng cao. Trong các hợp chất tự nhiên do vi sinh vật sinh ra ñã ñược công bố
sử dụng trên toàn thế giới thì 45% ñược sinh ra từ xạ khuẩn, 38% từ nấm và 17% từ vi
khuẩn ñơn bào (Arnold et al, 2009). Hai phần ba kháng sinh ñã biết ñược sinh ra bởi xạ
khuẩn chủ yếu từ các loài Streptomyces (Miyadoh, 1997). Các hợp chất kháng sinh khác
nhau của xạ khuẩn ñã ñược nghiên cứu ñặc ñiểm gồm aminoglycoside, anthracyclin,
glycopeptide, β-lactam, macrolides, nucleoside, peptide, polyene, polyeste, polyketide,
actinomycin và tetracycline (Goodfellow et al., 1988). Các hợp chất này ñã ñược sử dụng
thành công làm thuốc giệt cỏ, thuốc chống ung thư, thuốc, các chất ñiều hòa miễn dịch và
các chất chống ký sinh trùng (Thomson et al, 1995).
1.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam
Ở Việt Nam xạ khuẩn ñã ñược quan tâm nghiên cứu khá nhiều trong ñó các nghiên
cứu tập trung vào ñặc ñiểm sinh học (Biền Văn Minh, 2000-2004), tối ưu hóa môi trường
nuôi cấy (Bùi Việt Hà, 1998, Lê Gia Hy, 1994…), khả năng sinh kháng sinh kháng các vi
sinh vật gây bệnh thực vật (như vi khuẩn héo lá, nấm thực vật, nấm ñạo ôn, nấm thối cổ
rễ…) (Kiều Hữu Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Hy và cs, 1992, 1994, 2005), kháng vi sinh vật
gây nhiễm trùng bệnh viện (Nguyễn Phú Hùng và cs, 2009). Ngoài ra còn có công trình
nghiên cứu sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần nhằm nâng cao hiệu quả sinh kháng
sinh của xạ khuẩn (Vi Thị ðoan Chính, 2000), hay sản xuất kháng sinh b-lactam (Lê Gia
Hy và Phạm Thị Bích Hợp, 2004), tìm hiểu khả năng sử dụng dầu mỏ của một số xạ
24
khuẩn (Lại Thúy Hiền và cs., 1998), nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh (Lê Gia Hy và cs,
2005).
Cho ñến nay chưa thấy công trình nào ñề cập ñến kháng sinh kháng ung thư có
nguồn gốc từ xạ khuẩn ở Việt Nam.
1.4. Nội dung và mục ñích của nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ña dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ
khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ñảo
Cát Bà, một vườn quốc gia có ña dạng sinh học cao ở Việt Nam. Các chất kháng sinh do
các chủng lựa chọn sinh ra ñược tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm kiếm bản chất của chúng.
Cụ thể là:
- Phân lập xạ khuẩn từ mẫu ñất và lá mục ở ñảo Cát Bà, Hải Phòng qua ñó ñánh
giá mức ñộ ña dạng của ñối tượng
- Sàng lọc các chủng có hoạt tính kháng sinh cao
- Tách chiết sơ bộ thu các chất có hoạt tính kháng sinh từ các chủng chọn lọc ñược
- Nghiên cứu tính chất của các chất kháng sinh thu ñược bằng sắc ký bản mỏng
(TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Phân loại, ñịnh danh các chủng xạ khuẩn (bằng mô tả hình thái hoặc bằng giải
trình tự gene 16S của rDNA) có hoạt tính kháng sinh cao.
- Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của dịch chiết từ dịch
nuôi của một số chủng có tiềm năng
- Phân tích HPLC chất chiết từ các chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư làm cơ
sở cho nghiên cứu bản chất của các hợp chất ñó.
25
CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật li ệu
2.1.1. ðối tượng nghiên cứu
Các chủng xạ khuẩn phân lập từ các mẫu ñất và rác thu thập từ Cát Bà năm 2008 là
ñối tượng nghiên cứu của ñề tài này.
Chủng xạ khuẩn Nonomuraea roseoviolacea có ký hiệu A16 do National Institute
of Technology and Evaluation (NITE, Nhật Bản) cung cấp ñược dùng làm ñối chứng như
xạ khuẩn sinh anthracycline trong các phân tích sắc ký và ñộc tố tế bào.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất ñược sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật ñều là những hóa chất có
tiêu chuẩn chất lượng cao của các hãng cung cấp lớn như Merck (ðức), Sigma (Mỹ). Hoá
chất và một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer (Hàn Quốc),
Fermentas (ðức), Qiagen (Mỹ), ABI (Mỹ), BioRad (Mỹ) cung cấp. Các hóa chất dùng
cho HPLC ñạt tiêu chuẩn cho phân tích này.
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
Nghiên cứu ñược thực hiện chủ yếu tại Vi ện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học –
ðại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học,
sinh học phân tử và hoá phân tích ñạt tiêu chuẩn quốc tế.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn
Hai phương pháp phân lập ñã ñược sử dụng trong ñề tài là phương pháp sấy khô
(Nonomura et al, 1969) và phương pháp ly tâm-hoàn ẩm (rehydration–centrifugation)
(Hayakawa et al, 2000).
Trong phương pháp sấy khô, các mẫu ñất và rác ñược làm khô ở nhiệt ñộ phòng
trong 5-7 ngày rồi xử lý ở nhiệt ñộ 90 – 110 0C trong 10 – 30 phút ñể loại bỏ các vi khuẩn
không sinh bào tử (hầu hết các bào tử xạ khuẩn không chết ở ñiều kiện này). Tiếp theo,
các mẫu ñược trải lên môi trường HV (môi trường thạch có humic acid và vitamin: humid
acid 1 g, CaCO3 0,02 g; FeSO4.7H2O 0,01 g; KCl 1,71 g; MgSO4.7H2O 0,05 g; Na2HPO4
0,5 g, cycloheximine 50 mg, nalidixic acid 20 mg, kabicidine 14 mg, thạch 18 g, H2O 1 L,
pH 7,2) và nuôi ở 28 – 300C trong 7 ñến 14 ngày. Các khuẩn lạc xạ khuẩn với hình thái
khác nhau ñược nhặt và chuyển sang môi trường YS (môi trường thạch chứa dịch chiết
26
nấm men và tinh bột: glucose 10 g, cao nấm men 2 g, thạch 17 g, H2O 1 L, pH 7,0) ñể tạo
sinh khối tế bào nhiều hơn.
Phương pháp ly tâm-hoàn ẩm (RC) là một phương pháp phân lập ñặc hiệu với xạ
khuẩn ñộng. Các bước tiến hành như sau:
− Lấy 0.5 g mẫu ñất và rác ñã ñược phơi khô cho vào bình tam giác 100 ml, nhẹ
nhàng thêm 50 ml ñệm phosphate 10 mM (pH = 7) chứa 10% dịch chiết ñất (trộn
500 g ñất với 500 ml nước cất trong bình tam giác, khử trùng ở 121°C trong 30
phút, lọc hai lần, khử trùng và bảo quản ở 4°C).
− ðậy bình bằng giấy nhôm và nuôi ở 30°C trong 90 phút ñể giải phóng các ñộng bào
tử (motile zoospores).
− Chuyển 8 ml dịch nổi vào ống falcon 15 ml, ly tâm ở nhiệt ñộ phòng trong 20 phút
ở 1,500 g ñể loại bỏ các xạ khuẩn không ñộng. ðể các ống ổn ñịnh trong 30 phút.
− Lấy 1 ml dịch nổi rồi pha loãng bậc 2 bằng nước sạch ñã khử trùng, lấy 0,2 ml của
các bậc pha loãng 10-2, 10-3 và 10-4 cho lên ñĩa môi trường thạch HV và nuôi ở 28 –
30°C trong 2 – 3 tuần ñể tạo khuẩn lạc.
− Nhặt các khuẩn lạc ñược tạo thành và chuyển vào ñĩa môi trường thạch HV mới ñể
thuần khiết lần thứ hai rồi chuyển sang môi trường thạch YS ñể tạo sinh khối.
Tất cả các chủng xạ khuẩn phân lập bằng hai phương pháp nói trên ñều ñược lưu giữ
ở -80°C trong dung dịch glycerol 20% tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (Vietnam
Type Culture Collection-VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ðại học Quốc
gia Hà Nội.
2.2.2. Các vi sinh vật ki ểm ñịnh
Bốn chủng vi sinh vật do VTCC cung cấp, gồm Micrococcus luteus (có ký hiệu
VTCC-B-644), Escherichia coli (VTCC-B-428), Candida albicans (VTCC-Y-674) và
Fusarium oxysporium (VTCC-F-239) ñược sử dụng làm ñích ñể sàng lọc hoạt tính kháng
vi sinh vật. Các chủng này ñược nuôi trong các môi trường dinh dưỡng thích hợp, cụ thể
là môi trường Mueller-Hinton (MHA: cao thịt 0,3%; casein thủy phân 1,75%; tinh bột
0,15%; pH 7,4) ñối với E. coli và M. luteus, môi trường cao nấm men/malt (YM; glucose
1%, peptone 0,5%; cao nấm men 0,3%; cao malt 0,3%) ñối với C. albicans và F.
oxysporum. Việc nuôi cấy ñược tiến hành trong ñiều kiện lắc ở 37 °C ñối với E. coli và
M. luteus hoặc 30°C ñối với C. albicans và F. oxysporum.
27
2.2.3 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh
Trước tiên, tất cả các chủng xạ khuẩn ñược hoạt hóa trong ñĩa môi trường YS ở
30°C trong 3–4 ngày. Sau ñó các chủng ñược nuôi trong môi trường ñậu tương lỏng (tinh
bột 25 g, bột ñậu tương 15 g, cao nấm men 1 g, CaCO3 4 g, nước cất 1 L, pH 6,2) ở 30°C
trong 3 ngày có lắc với tốc ñộ 100 vòng/phút. Sau thời gian nuôi cấy, dịch nuôi ñược ly
tâm ở 8.000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch nổi thu ñược ñược dùng ñể ñánh giá hoạt tính
kháng vi sinh vật. Có hai bước ñánh giá hoạt tính:
a. Phương pháp thỏi thạch
Các mảnh thạch có ñường kính 5 mm ñược cắt từ ñĩa môi trường YS có chủng xạ
khuẩn mọc rất tốt ñược ñặt lên bề mặt các ñĩa thạch trước ñó ñã ñược cấy vi sinh vật kiểm
ñịnh và nuôi trong ñiều kiện thích hợp trong 2 ngày. Hiệu quả kìm hãm ñược ñánh giá
thông qua sự tạo thành các vùng kìm hãm quanh mảnh thạch có xạ khuẩn và hoạt tính
ñược ño bằng ñường kính của các vùng này (Ichikawa T. và cộng sự, 1971).
b. Phương pháp khuếch tán dịch nuôi
Các giếng nhỏ ñược ñục trên các ñĩa thạch rắn trước ñó vừa ñược cấy vi sinh vật
kiểm ñịnh. Nhỏ khoảng 25 µl dịch nuôi ñã ly tâm vào các giếng và nuôi trong 2 ngày dưới
các ñiều kiện thích hợp với vi sinh vật kiểm ñịnh. Hoạt tính kháng sinh ñược ñánh giá
thông qua các vòng kìm hãm ñược tạo thành quanh giếng. Các thí nghiệm ñược lặp lại hai
lần và dịch môi trường ban ñầu ñã khử trùng ñược dùng làm ñối chứng âm (Alex Y. l. T.,
Hai M.T. 2006).
2.2.4 Chiết bằng ethyl acetate
Dịch nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn trong môi trường ñậu tương lỏng sau ly tâm
(ở 8000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt ñộ phòng) loại bỏ tế bào ñược tách chiết theo mô
tả của Guoliang Yin và cộng sự với một số thay ñổi cho phù hợp (Guoliang Yin và cs,
2010). Bốn thể tích ethyl acetate ñược thêm vào rồi ñược lắc kỹ trong 1 giờ. Phần hòa tan
ñược thu lại bằng bình chiết sau ñó ñược bổ sung sulfate natri sao cho có nồng ñộ là 5
g.L-1. Dung môi ñược loại bỏ bằng máy loại dung môi. Phần cắn thu ñược sẽ ñược xử lý
tùy theo mục ñích thí nghiệm tiếp theo.
ðể tiến hành sắc ký, phần cắn sẽ ñược hòa tan trong chloroform (Westley J.W., và
cs., 1979). Tuy nhiên trước khi tiến hành sắc ký, dịch chiết thô trong chloroform sẽ ñược
kiểm tra lại hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp ñã mô tả 2.2.3.b với chloroform
là chứng âm.
28
ðối với phép thử ñộc tố tế bào cắn ñược thu lại ở dạng rắn. Việc tiến hành xử lý tiếp
theo ñược tuân thủ theo quy trình mô tả ở 2.2.7.
2.2.5 Sắc ký các chất chiết thu ñược
2.2.5.1. Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)
Phân tích TLC ñược tiến hành trên bản Silica Gel G (20 x 10 cm) với hệ dung môi
chloroform : methanol (90:10). Chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin dịch chiết
thô của anthracyclines (do chủng A16 sinh ra) ñược dùng làm chuẩn so sánh. Các băng
ñược hiển thị bằng tia UV (bước sóng 254 và 366 nm) hoặc bằng phun sulfuric acid
(H2SO4) 10% và cố ñịnh ở 120 °C trong 5-10 phút (Irena C., 2010, Matook S. M., Fumio
H., 2005).
2.2.5.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid Chromatography - HPLC)
a. Sắc ký so sánh với các kháng sinh chuẩn
Phân tích này ñược tiến hành trên hệ thống Agilent 1100 series HPLC (Mỹ) với cột
C18 Synchropak RP-4 (250 mm × 4.6 mm, ID 11704457 Agilent, Mỹ) và UV detector.
Dung dịch các kháng sinh chuẩn (chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin) ñặc ñược
pha trong methanol ở nồng ñộ 1 mg.ml−1 và bảo quản ở 4 °C trong tối. Nồng ñộ và ñiều
kiện sắc ký áp dụng cho các chất chuẩn thay ñổi tùy theo bản chất hóa học của chúng và
ñược nêu cụ thể ở bảng 2.1.
Bảng 2.1 ðiều kiện phân tích HPLC của các chất chuẩn
Kháng sinh Bản chất hóa học ðiều kiện phân tích Tài li ệu tham khảo
Chloramphenicol
Công thức: C11H12Cl2N2O5
MW: 323.132
Pha mang: 25% acetonitril (pH 6)
Vận tốc: 1 ml min−1
Nhiệt ñộ cột: 30 °C
Bước sóng: 270 nm
Jeffrey R.K. (1978)
Erythromycin
Công thức: C37H67NO13
MW: 733.93 Có một vòng lactone lớn gắn với hai ñường không có oxy
Pha mang: acetonitril (25%) : phosphate buffer (0.05M, pH 6.3) = 3 : 7 (vol:vol)
Vận tốc: 1 ml min−1
Nhiệt ñộ cột: 35 °C
Bước sóng: 200 nm
Stubbs C., et. al. (1985)
29
Kitasamycin
Công thức: C35H59NO13
MW: 701.84
Pha mang: acetonitril (25%) : phosphate buffer (0.05M, pH 2.5) = 58 : 42 (vol:vol)
Vận tốc: 0.5 ml min−1
Nhiệt ñộ cột: 40 °C
Bước sóng: 232 nm
Horie M., et.al.
(1996); Leo M. L. N. (2000)
Anthracyclines
R1=CH3, R2=H: Daunorubicin R1=CH3, R2=OH: Adriamycin
Pha mang: Dung môi A (0.1% formic acid trong nước) : Dung môi B(0.1% formic acid trong acetonitril) = 70 : 30 (vol:vol)
Vận tốc: 1 ml min−1
Nhiệt ñộ cột: 30 °C
Bước sóng: 480 nm
Kristof M.
(2009), Young S.R., et. al., 2001
Các mẫu ñược phân tích với mỗi chuẩn trong cùng ñiều kiện. Trước khi cho mẫu
cột ñược rửa bằng ñệm cho ñến khi cân bằng. Thể tích mẫu là 10 µl.
b. Sắc ký phân tích trên các bước sóng khác nhau
Phân tích ñược tiến hành trên hệ thống tự ñộng Agilent 1200 series HPLC (Mỹ) với
DAD detector với các ñiều kiện: cột: Varian, Microsorb MV 100C18, 100mm x 4.6 mm,
kích thước hạt 3 µm; pha ñộng : 0,15 % KH2PO4 (pH 3,5) và acetonitril (CH3CN) có
gradient (0 - 3 phút: 15 %, 3 - 6 phút: 40 %, 6 - 12 phút: 40 %, 12 - 19 phút: 45 %, 19 -
22 phút: 85 %, 22 - 29 phút: 85 %, 29 - 32 phút: 15 %); vận tốc: 1,2 ml/phút; nhiệt ñộ lò
cột: 30 'C; bước sóng: UV/VIS 190 - 600 nm (khoảng cách 2 nm). Các mẫu chất chiết
ñược hòa tan trong DMSO. Phần nghiên cứu này ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi
sinh vật phân tử, Trung tâm Công nghệ sinh học quốc tế (International Centre of
Biotechnology-ICBiotech), ðại học Tổng hợp Osaka, Nhật Bản.
2.2.6 Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline
Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn ñược sàng lọc bằng phép thử
màu. Bản chất của phép thử như sau: Do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo
hóa học, các anthracycline thay ñổi màu sắc tùy theo pH của môi trường, cụ thể là có màu
da cam ở pH acid và màu tím khi ở pH base. ðặc tính này ñược dùng ñể sơ bộ sàng lọc
30
các chủng sinh anthracycline trong số các chủng xạ khuẩn phân lập ñược (Trease G. E.,
Evans W. C., 1996).
Cách tiến hành như sau: ñục 2 giếng nhỏ trên ñĩa thạch trước ñó ñã ñược nuôi xạ
khuẩn (khoảng 4 – 5 ngày tuổi). Nhỏ vào mỗi giếng 25 µl HCl (1N) hoặc NaOH (2N).
Quan sát màu quanh giếng sau 10 – 20 phút.
2.2.7. Phép thử ñộc tế bào
Khả năng gây ñộc tế bào của các chất chiết ñược từ dịch nuôi xạ khuẩn ñược xác
ñịnh theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990) và Likhiwitayawuid và cộng sự
(1993) hiện ñang ñược áp dụng tại Vi ện Nghiên cứu ung thư quốc gia (Hoa Kỳ) và trường
Dược, ðại học Illinois, Chicago (Hoa Kỳ). Phép thử ñược thực hiện tại Phòng Sinh học
thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam. Cụ thể là:
Ba dòng tế bào ung thư của người gồm ung thư gan (hepatocellular carcinoma, Hep-
G2), ung thư phổi (lung cancer, Lu) và ung thư cơ vân tim (rhabdosarcoma, RD) ñược
dùng ñể sàng lọc hoạt tính gây ñộc tế bào bằng phép thử Sulforhodamine B (SRB assay).
Các dòng tế bào này ñược cho vào ñĩa 96 giếng (mỗi giếng chứa 2x103 tế bào) rồi
cho chất cần thử (ở ñây là chất chiết từ dịch nuôi xạ khuẩn như ñã mô tả ở 2.2.4. với các
nồng ñộ pha theo thang 10) hòa tan trong DMSO. Sau ñó các ñĩa ñược nuôi trong tủ CO2
ở 37 ºC trong 7 ngày. Vào ngày thứ 3 môi trường nuôi ñược thay mới. Tỷ lệ phần trăm
sống sót của tế bào ñược hiện thị màu bằng SRB (sulforhodamine B) và ñược ñọc bằng
máy ñọc ELISA (ELISA reader) ở bước sóng 495 nm.
Hoạt tính gây ñộc tế bào ñược tính bằng phần trăm ức chế khi so sánh mật ñộ quang
học của giếng ñược xử lý với mẫu nghiên cứu và chứng âm (DMSO). Nồng ñộ ức chế
50% (IC50) ñược suy ra từ ñường cong phát triển tế bào và nồng ñộ chất thử (phần trăm
sống sót so với nồng ñộ chất thử).
2.2.8. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn
a. Qua ñặc ñiểm hình thái
Các ñặc ñiểm hình thái của xạ khuẩn ñược quan sát sau hai tuần nuôi ở các ñiều
kiện như ñã mô tả. Các ñặc ñiểm hiển vi như hệ sợi cơ chất, hình thái sợi khí sinh, cấu
trúc chuỗi bào tử ñược quan sát dưới kính hiển vi phản pha (Carl-Zeiss) có nối máy ảnh
và phần mềm chụp ảnh. Atlas hình thái xạ khuẩn (Gernot, 1997) và Sổ tay nhận dạng xạ
khuẩn (Identification Manual of Actinomycetes) (Miyadoh et al, 2001) ñược dùng ñể
31
tham khảo về ñặc ñiểm phân loại.
b. Bằng sinh học phân tử
Tách chiết DNA
DNA genome của các chủng xạ khuẩn ñược tách chiết theo phương pháp ñã ñược
Marmur (1961) và Saito (1963) mô tả với một số cải tiến. Cụ thể là, nuôi xạ khuẩn trong
môi trường YS lỏng trong 3 ngày ở 30°C và thu tế bào bằng ly tâm ở 3000 vòng/phút
trong 5 phút. Tế bào sau khi ñã ñồng nhất (bằng que nhựa vô trùng, rửa bằng 2 ml ñệm
1�TE 2 – 3 lần và hòa tan lại trong 0.5 ml EDTA 5 mM, pH 8) bị phá vỡ bằng xử lý với
lysozyme (50 µl có nồng ñộ 40 mg.ml−1) ở 37°C qua ñêm, rồi ñược xử lý với SDS (50 µl
có nồng ñộ 20%) và proteinase K (50 µl có nồng ñộ 4 mg.ml−1) ở 55°C trong 1 giờ. DNA
ñược chiết bằng bổ sung một thể tích tương ñương hỗn hợp phenol:chloroform:isoamine
alcohol = 25:24:1 (PCI), trộn và ly tâm ở 15000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. Bước
chiết này ñược lặp lại 3 lần. DNA nhiễm sắc thể ñược kết tủa bằng 2 thể tích 2-propanol
lạnh, rồi làm khô bằng ethanol 70% ở nhiệt ñộ phòng và hòa tan trong 100 µl nước cất.
Phản ứng PCR, giải trình tự và phân tích cây chủng loại phát sinh
Gene rDNA 16S ñược khuếch ñại bằng cặp primer:
27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)
1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)
Hỗn hợp phản ứng (50 µl) gồm 5 µl ñệm (0.2 M Tris-HCl pH 8.3, 0.25 M KCl, 20
mM MgCl2), 20 nM mỗi loại deoxynucleotide, 50 pM mỗi loại primer, 2.5 U Taq DNA
polymerase, và 1 µl DNA khuôn (nồng ñộ khoảng 10-20 ng). Chu trình PCR gồm 5 phút
sốc nhiệt ở 95°C, tiếp ñến là 30 chu kỳ gồm 95°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, và
72°C trong 1 phút, cuối cùng là 72°C trong 7 phút. Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel
agarose, cắt và tinh sạch băng DNA bằng kit QIAquick gel extraction (Qiagen), và ñọc
trình tự bằng máy tự ñộng ABI 3110 Avant Appied Biosystems sequencer.
Trình tự gen sau ñó ñược phân tích so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có
liên quan hiện ñã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm
BLAST Search. So sánh tương ñồng với các trình tự liên quan ñược thực hiện bằng phần
mềm CLUSTAL_X, phiên bản 1.8 (Thompson et. al., 1997). Cây phân loại ñược dựng
theo phương pháp neighbour-joining (Saitou, Nei, 1987), trong ñó ñịnh dạng cây ñược
tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh ña chiều (Felsenstein, 1985).
32
CHƯƠNG III. K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở Vườn Quốc gia Cát Bà
Việt Nam với hơn 1.700 km bờ biển trải từ bắc xuống nam với rất nhiều ñảo có
mức ña dạng sinh học cao. Một số ñảo của Việt Nam ñã ñược công nhận là vườn quốc gia
ñể bảo tồn và phát triển bền vững nguồn gene sinh học. Trong khi hệ thực vật và ñộng vật
ở các vườn quốc gia của Việt Nam ñã ñược quan tâm nghiên cứu về mức ñộ ña dạng rất
nhiều thì vi sinh vật chưa ñược quan tâm ñúng mức cho dù vi sinh vật ñóng vai trò chủ
ñạo trong sự phát triển của công nghệ sinh học. Hiện vẫn còn ít các nghiên cứu liên quan
ñến sự ña dạng cũng như khả năng ứng dụng của hệ vi sinh vật ở các vườn quốc gia này.
Trong số các ñảo của Việt Nam, Cát Bà là ñảo lớn nhất của Vịnh Hạ Long, di sản
thiên nhiên thế giới. ðảo hiện có 620 loài thực vật bậc cao, 32 loài ñộng vật có vú, 69 loài
chim và 20 loài bò sát. Cũng tương tự như hầu hết các khu bảo tồn ở Việt Nam, Vườn
quốc gia Cát Bà chưa ñược nghiên cứu về mức ñộ ña dạng và tiềm năng sử dụng của vi
sinh vật.
Nhằm góp phần nghiên cứu về nhóm xạ khuẩn có ở ñảo Cát Bà, ñề tài ñã tiến hành
phân lập xạ khuẩn theo hai phương pháp khác nhau như ñã mô ở chương II. Qua ñó ñã
phân lập ñược 424 chủng xạ khuẩn từ các mẫu ñất và lá cây mục thu tại Cát Bà. Trong số
424 chủng ñó, 353 chủng (83.25%) phân lập ñược từ ñất và 71 chủng (16.75%) từ mẫu lá
cây mục.
Tiếp theo, các chủng xạ khuẩn phân lập ñược ñã ñược phân loại theo hình thái ñể
phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (xạ khuẩn hiếm) (Bảng 3.1). ðể
ñịnh loại chính xác hơn nhóm xạ khuẩn hiếm phương pháp ñọc trình tự một phần rDNA
16S (khoảng 900 bp) ñã ñược thực hiện và so sánh với các trình tự ñã có trên cơ sở dự
liệu bằng công cụ Blast Search.
Qua bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy 296 chủng phân lập ñược là Streptomyces (chiếm
khoảng 69,81%) và 128 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) (chiếm
khoảng 30,19%). Các nghiên cứu trước ñây cho thấy Streptomyces là một trong những
nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong ñất và phân bổ rộng rãi trên thế giới (Hopwood A. D.,
2007). Do vậy tỷ lệ cao của Streptomyces trong bộ sưu tập xạ khuẩn ở Cát Bà khẳng ñịnh
kết luận này.
Nhìn chung, hầu hết các chủng Streptomyces phân lập ñược mọc nhanh và khỏe,
xuất hiện trước tiên trong các ñĩa phân lập và dễ phân lập. Ngược lại, các chủng xạ khuẩn
hiếm (non-Streptomyces) mọc chậm, khuẩn lạc nhỏ, khó phân lập và nuôi cấy. Số lượng
33
xạ khuẩn hiếm thu ñược từ phương pháp ly tâm-hoàn ẩm nhiều hơn bằng phương pháp
sấy khô truyền thống.
Bảng 3.1 Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập ñược
Các nhóm xạ khuẩn Số lượng chủng %
Streptomyces 296 69.81
Xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces)
Micromonospora 27 6.36
Nonomuraea 17 4.00
Nocardia 12 2.83
Kineosporia 8 1.90
Microbispora 7 1.65
Actinomadura 7 1.65
Pseudonocardia 6 1.42
Nocardiopsis 6 1.42
Micrococcus 5 1.18
Streptosporangium 5 1.18
Khác (mỗi loại ít hơn 1%) 28 6.60
Tổng cộng 424 100.00
Xét về mức ñộ ña dạng, chúng tôi nhận thấy các chi Micromonospora, Nonomureae
và Nocardia là các chi chiếm ưu thế trong các chi xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) thu
thập tại Cát Bà (Bảng 3.1). Các loài thuộc ba chi này cũng thường ñược phân lập ở các
ñịa ñiểm khác ở Việt Nam (Duong V.H., Ando K., 2010).
Các chủng phân lập ñược hiện ñược lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật
(Vietnam Type Culture Collection, VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học trong
glycerol 20% ở −80 °C.
3.2 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh
ðể sàng lọc các chủng sinh kháng sinh, 4 chủng vi sinh vật ñại diện cho vi khuẩn
Gram âm và dương; nấm và nấm men ñã ñược lựa chọn làm vi sinh vật kiểm ñịnh.
Bước sàng lọc ñầu tiên ñược thực hiện bằng phương pháp mảnh thạch như ñã mô tả
ở chương II. Qua ñó cho thấy trong 424 chủng xạ khuẩn nghiên cứu chỉ có 115 chủng
34
(chiếm khoảng 27,12%) cho hoạt tính ñáng kể kháng ít nhất một trong bốn vi sinh vật
kiểm ñịnh.
Tiếp theo 115 chủng này ñược dùng làm ñích cho bước sàng lọc thứ hai sử dụng
phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy. Một số hình ảnh ñại diện cho bước phân tích này
ñược trình bày ở hình 3.1. Từ bước sàng lọc này 17 chủng thể hiện hoạt tính tương ñối
cao với ít nhất hai trong bốn vi sinh vật kiểm ñịnh ñã ñược lựa chọn. Hoạt tính tương ñối
của các chủng này ñược trình bày ở bảng 3.2.
Hình 3.1. ðánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn
Một số hình ảnh tiêu biểu minh họa cho phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy.
Trong số 17 chủng chọn lọc ñược, 14 chủng có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn Gram
âm (E. coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn Gram dương (M. luteus) và 11 chủng có hoạt
tính kháng cả hai nhóm vi khuẩn. Với các tế bào nhân thật, gồm nấm (F. oxysporium) và
nấm men (C. albicans), 12 chủng có hoạt tính kháng nấm và chỉ 6 chủng có hoạt tính
kháng nấm men (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
Hiệu quả ức chế vi sinh vật ki ểm ñịnh (ñường kính vòng kìm hãm, mm)
Chủng
E. coli M. luteus F. oxysporium C. albicans
A45 10 0 6 0
A149 8 6 0 0
A154 8 8 0 0
A160 0 6 0 10
A232 6 7 0 12
A390 10 10 18 0
A396 8 12 0 0
A410 24 0 10 0
A427 16 0 12 0
E. coli F. oxysporium M.luteus C. albicans
35
A444 0 7 8 0
A1018 0 40 10 16
A1022 16 30 10 0
A1041 22 28 6 0
A1043 8 32 6 0
A1073 21 30 10 10
A1393 14 18 14 6
A1470 15 26 12 0
Kết quả còn cho thấy 9 trong số 17 chủng chọn lọc ñược có hoạt tính mạnh với cả vi
khuẩn và nấm (ñường kính vòng kìm hãm > 10 mm). ðặc biệt là hai chủng A1073 và
A1393 kìm hãm cả bốn chủng vi sinh vật kiểm ñịnh (bảng 3.2, các dòng ñược bôi ñậm).
3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
17 chủng chọn lọc ñược ñã ñược tiến hành nuôi cấy lỏng và sơ bộ tách chiết dịch
ngoại bào ñể tiến hành các phân tích tiếp theo. Hiện nay có nhiều công bố liên quan ñến
việc tách chiết các chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc từ vi sinh vật. Qua tham khảo tài
liệu chúng tôi nhận thấy ethyl acetate thường ñược sử dụng trong bước ñầu tiên khi tách
chiết hợp chất có hoạt tính kháng sinh từ vi sinh vật. Ethyl acetate ñược coi là một trong
những dung môi hữu cơ tương ñối ít ñộc hại, dễ loại bỏ do có ñộ bay hơi cao và là dung
môi ñược dùng phổ biến trong tách chiết nhiều chất hóa học. Ethyl acetate hiện ñược sử
dụng trong nhiều ngành công nghiệp trong ñó có cả công nghiệp thực phẩm (làm bánh
kẹo). Vì vậy sử dụng dung môi này sẽ an toàn cho người thực hiện (Dutia, Pankaj, 2004).
Do ñó chúng tôi ñã lựa chọn ethyl acetate làm dung môi ñể chiết các chất tan trong dịch
nuôi thu ñược từ các chủng chọn lọc ñược. Quy trình tách chiết ñã ñược mô tả chi tiết ở
chương II. Hiệu quả tách chiết các chất tan trong ethyl acetate ñược trình bày ở bảng 3.3.
Qua ñó cho thấy từ 01 lít dịch nuôi cấy (sau khi ñã loại bỏ tế bào) thu ñược từ vài chục
miligram ñến vài gram chất tan trong ethyl acetate. So với chất khô thì lượng chất tan này
chiếm từ 0,5% ñến gần 15% tùy theo từng chủng xạ khuẩn. Trong ñó dịch nuôi của chủng
A396 có tỷ lệ chất tan này cao nhất (14,89%), còn thấp nhất là chủng A154 (chỉ chiếm
0,51%).
Bảng 3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
(từ 1 lít dịch nuôi ñã loại tế bào)
TT Chủng Chất khô (gam) Chất tan trong
ethyl acetate (mg)
Phần trăm so với chất khô (%)
36
1 A45 5,040 504,76 10,02
2 A149 33,445 103,20 3,09
3 A154 5,883 30,15 0,51
4 A160 14,114 72,96 0,52
5 A232 16,556 158,76 0,96
6 A390 13,076 361,40 2,76
7 A396 6,209 924,64 14,89
8 A410 9,699 113,60 1,17
9 A427 18,238 101,92 0,56
10 A444 18,413 2152,36 11,69
11 A1018 28,650 544,96 1,90
12 A1022 30,076 257,04 0,85
13 A1041 25,825 268,64 1,04
14 A1043 23,413 310,40 1,33
15 A1073 30,333 388,72 1,28
16 A1393 28,911 309,04 1,07
17 A1470 20,348 726,80 3,57
3.4. Phân tích sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate
3.4.1. Sắc ký bản mỏng (TLC)
Chất chiết ñược từ dịch ngoại bào của 17 chủng xạ khuẩn sau khi hòa tan lại trong
chloroform ñã ñược cho chạy TLC cùng với các ñối chứng là chloramphenicol,
kitasamycin, erythromycin và chất chiết dịch ngoại bào chủng A16 ñược coi là ñối chứng
cho anthracycline. Kết quả ñược trình bày trên hình 3.2.
Kết quả thu ñược cho thấy phổ các băng TLC của 17 chủng rất khác nhau. Số băng
thu ñược dao ñộng từ 1 ñến 4 băng. Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232, A410, A427,
A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ có 2 băng, 4
chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390, A1022) cho phổ
4 băng.
37
Hình 3.2. Phổ TLC chất chiết từ dịch ngoại bào của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược. A, B và C – phổ TLC dưới ánh sáng UV. D – phổ minh họa các băng ñược hiển thị. Viết tắt: CAP-Chloramphenicol; Kita-Kitasamycin; Ery-Erythromycin; các số biểu diễn số của tên chủng. Mũi tên chỉ hướng pha ñộng.
So sánh với từng ñối chứng chúng tôi nhận thấy:
- Chloramphenicol cho phổ TLC chỉ gồm 01 băng. Trong 17 mẫu nghiên cứu chỉ có
mẫu A396 (có hai băng) là có băng có cùng ñộ di ñộng tương ñối với kháng sinh
này.
- Kitasamycin cho một phổ hai băng. Không có mẫu nào trong 17 mẫu nghiên cứu có
phổ TLC cũng như băng sắc ký trùng với phổ hay băng của kháng sinh này.
- Erythromycin cũng có phổ gồm hai băng nhưng có ñộ di ñộng tương ñối nhỏ hơn
so với hai băng của kitasamycin. Có hai mẫu có băng tương tự với băng nhận ñược
từ erythromycin. ðó là băng có ñộ di ñộng tương ñối thấp nhất (tức băng chậm
D
38
nhất) của A45 (cùng ñộ di ñộng với băng chậm của kháng sinh này) và băng duy
nhất của A410 trùng với băng nhanh của kháng sinh này.
- Chất chiết từ chủng A16 cho phổ TLC gồm 5 băng. Trong số 5 băng này có 2 băng
(băng thứ hai và băng thứ năm tính từ phía xuất phát) là không tìm thấy ở bất kỳ
phổ TLC nào của 17 mẫu nghiên cứu. Ba băng còn lại có thể quan sát thấy ở mẫu
A1043 (băng thứ nhất); A232, A390, A1018 và A1022 (băng thứ ba); A45, A427,
A1018, A1022 và A1470 (băng thứ tư). Như vậy trong 17 mẫu nghiên cứu có hai
mẫu (A1018 và A1022) có 2 băng TLC trùng với 2 băng của mẫu ñối chứng này.
Như vậy qua phân tích TLC dường như các hợp chất chiết ñược không hoàn toàn tương
ñồng với một trong các kháng sinh ñược dùng làm chuẩn trong nghiên cứu này. Tuy nhiên
ñể trả lời chính xác liệu các hợp chất ñó có phải là các chất ñã biết hay là các hợp chất
mới cần phải có các phân tích sâu hơn.
3.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Tiếp theo nhằm tìm hiểu sâu hơn các hợp chất tách chiết ñược từ xạ khuẩn, chúng
tôi ñã tiến hành chạy HPLC của các mẫu với cùng ñiều kiện sắc ký của các chất chuẩn (là
các kháng sinh như ñã ñề cập ở phần phân tích TLC).
Với các ñiều kiện chạy HPLC như ñã mô tả ở phần phương pháp, kết quả phân tích
ñược tổng kết ở bảng 3.4, sắc ký ñồ ñược ñính kèm ở phần phụ lục của báo cáo.
Bảng 3.4. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ các chủng xạ khuẩn chọn
lọc ñược
TT
Chất chuẩn/chủng
Số lượng ñỉnh thu ñược
Thời ñiểm
thôi của các ñỉnh
chính (phút)
Tỷ lệ so với tổng số thu ñược
Ghi chú
I Kitasamycin 7 3.714
4.427
17,77 %
62,82 %
1 A232 3 7.062
7.291
7.662
10,65 %
54,83 %
34,03 %
các ñỉnh không tách rõ rệt
2 A390 2 7.276
7.672
7.276 %
7.672 %
các ñỉnh không tách rõ rệt
39
3 A1018 5 5.723
6.174
64,09 %
28,67 %
4 A1041 6 6.456
6.648
7.266
7.622
5,28 %
6,92 %
50,77 %
36,10 %
5 A1073 5 7.266
7.619
8.180
55,60 %
40,53 %
3,2 %
6 A1393 5 7.293
7.641
60,43 %
38,50 %
các ñỉnh ko tách rõ rệt
7 A1470 4 3.396
3.898
5.877
5,61 %
22,47 %
71,46 %
không tách tốt
8 Các chủng còn lại (10 chủng và chủng ñối chứng A16)
không tách rõ rệt
II Erythromycin 6 3.117
3.357
53%
24,7%
1 A149 11 8.661
9.166
50%
40%
nhưng không tách biệt hoàn toàn
2 A154 5 9.107 96% nhưng không tách tốt
3 A160 8 8.789 94% nhưng không tách tốt
4 A232 9 3.925
4.054
21.19%
71.16%
5 A390 11 4.024 88,53%
6 A396 8 phân ñoạn từ 6 – 12 phút không tách
7 A427 12 3.363
4.775
8.607
8,98%
6,70%
70%
nhưng không tách
8 A444 8 3.044 1,2 %
40
3.339
9.107
1,1 %
93%
nhưng không tách
9 A1018 10 3,999
4.063
5.892
26,34 %
56,95 %
6,68 %
10 A1022 13 3.977
4.567
5.755
62,58 %
11,49 %
14,49 %
11 A1041 10 3.985 81,25%
12 A1043 8 3.333
8.585
2%
86%
nhưng không tách tốt
13 A1073 11 4.011 84,89 %
14 A1393 12 4.007 81,85%
15 A1470 8 3.038
3.343
9.467
1%
2,38%
93,62%
nhưng không tách tốt
16 A16: chủng ñối chứng dương
8 9.539 95% nhưng không tách tốt
17 Các chủng còn lại: 2 chủng không tách tốt
III Chloramphenicol 1 5.498 100%
1 A232 10 1.186
4.192
5.153
5,16 %
62,27 %
15,60 %
2 A390 7 1.195
4.190
29,61 %
66,82 %
3 A396 8 3.609
3.876
4.464
5.407
6.185
10.852
6,15 %
18,64 %
17,96 %
4,33 %
11,04 %
40,22 %
4 A1018 8 1.184 8,65 %
41
4.210
5.905
8.212
60,80 %
16,31 %
11,08 %
5 A1022 12 1.195
4.189
5.876
8.174
4,55 %
36,76 %
28,13 %
25,72 %
6 A1041 9 1.182
4.111
10,23 %
71,33 %
7 A1073 7 1.201
4.193
16,14 %
66,39 %
8 A1393 7 1.201
4.193
17,59 %
80,14 %
9 Các chủng còn lại: 9 chủng và chủng ñối chứng dương A16
không tách tốt
Qua phân tích kết quả thu ñược từ HPLC, chúng tôi nhận thấy các hợp chất thu ñược
từ các chủng xạ khuẩn nghiên cứu chưa thể khẳng ñịnh thuộc vào nhóm nào trong số các
chất chuẩn ñã sử dụng, trừ mẫu A396 có một ñỉnh (thôi ở 5.476 phút) tương ứng với
chloramphenicol (Hình 3.3). Kết quả này cũng ñược khẳng ñịnh từ phân tích TLC (Hình
3.2).
Hình 3.3. Phổ HPLC của chloramphenicol (A) và chất chiết từ dịch nuôi chủng A396 (B)
Abs
270
A B
Thời gian (phút)
42
3.5. ðặc ñiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
ðối với nghiên cứu về vi sinh vật, việc ñịnh loại là hết sức quan trọng. Như ñã trình
bày ở phần 3.1 (ða dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn phân lập ở Cát bà), trong 424
chủng phân lập ñược có khoảng 70% thuộc Streptomyces còn lại là xạ khuẩn hiếm (non-
Streptomyces). Sau ñây là các thông tin cụ thể hơn về 17 chủng chọn lọc ñược trong bộ
sưu tập nói trên. 17 chủng chọn lọc ñược chỉ thuộc 2 chi là Streptomyces (10 chủng) và
chi Nonomuraea (7 chủng).
3.5.1 ðặc ñiểm hình thái của các chủng thuộc Streptomyces
Như ñã trình bày, các chủng xạ khuẩn phổ biến (Streptomyces) có ñặc ñiểm hình
thái ñiển hình có thể dùng ñể nhận dạng [11], [29]. Từ các ñặc ñiểm ñó 10 chủng (gồm
A390, A410, A427, A1018, A1022, A1041, A1043, A1073, A1393 và A1470) trong số
17 chủng chọn lọc ñược thuộc về chi Streptomyces.
Các khuẩn lạc của các chủng này rất khác biệt về mặt kích thước (trong hoặc bầu
dục), bề mặt khuẩn lạc (mềm, cứng, nhăn nheo, cấu trúc hạt), và ñộ dày (phồng hay dẹt).
Các khuẩn lạc tạo thành hệ sợi cơ chất và sợi khí sinh với các loại màu khác nhau như
trắng, vàng, ñỏ hoặc nâu. Các khuẩn lạc này ñược phủ kín bởi một lớp sợi khí sinh hoặc
ñường ñồng tâm. Kích thước khuẩn lạc phụ thuộc vào các chủng và ñộ tuổi nhưng dao
ñộng từ vài mm ñến 1 cm (hình 3.4).
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc một số chủng Streptomyces
Liên quan ñến việc tạo thành hệ sợi khí sinh và chuỗi bảo tử, 10 chủng Streptomyces
này tạo thành hệ sợi khí sinh với các chuỗi bào tử dài trên môi trường thạch YS. ðặc ñiểm
bào tử và chuỗi bào tử ñược quan sát dưới kính hiển vi phản pha (hình 3.5).
A1018
A1073
(A) A1018
(B) A390
A1043 A390 A1073 A1018
43
Hình 3.5. Hệ sợi mang bào tử của một số chủng Streptomyces A, B – Dạng thẳng; C, D – Dạng hình xoắn của sợi mang bào tử
Dựa trên quan sát dưới kính hiển vi, chuỗi bào tử của các chủng Streptomyces có thể
chia thành hai loại:
- Dạng thẳng (Hình 3.5.A và B) có chuỗi bào tử thẳng hoặc ngoằn ngoèo, hệ sợi khí
sinh phân nhánh màu trắng. Các chủng thuộc nhóm này gồm A390, A427, A1018, A1022,
A1393 và A1470.
- Dạng xoắn (hình 3.6. D và D) có hệ sợi khí sinh tạo thành sợi mang bào tử phân
nhánh có hình móc, vòng mở, các xoắn dài, rộng hay vuốt dài (hình 3.5.C) hoặc các xoắn
với 3 -5 vòng (hình 3.5.D). Các chủng thuộc loại này gồm A410, A1041, A1043 và
A1073.
Các bào tử có hình bầu dục hoặc hình xoắn, sắp xếp thành chuỗi dài. Không quan
sát thấy các cấu trúc ñặc biệt khác như túi bào tử hay các cơ quan dự trữ.
Thông tin chi tiết về ñặc ñiểm nhận dạng của các chủng thuộc chi Streptomyces
ñược tổng hợp ở Bảng 3.5.
44
Bảng 3.5. Các ñặc ñiểm nhận dạng của 10 chủng thuộc chi Streptomyces
TT Chủng ðặc ñiểm khuẩn lạc ðặc ñiểm chuỗi bào tử
1 A390 ñường kính 0,5cm, màu tím nhạt, có sợi khí sinh, bề mặt khuẩn cao
Dạng thẳng
2 A410 ñường kính 0,2 cm, bề mặt phẳng, sợi khí sinh tâm màu xám, vòng ngoài màu trắng, các khuẩn lạc già tạo những giọt dịch thể màu nâu ở tâm khuẩn lạc
Dạng xoắn
3 A427 ñường kính 0,2 cm - 0,3 cm, bề mặt lồi, xung quanh có màu trắng, sợi cơ chất màu trắng
Dạng thẳng
4 A1018 ñường kính 0,1 cm, khí sinh màu trắng xám, cơ chất màu be
Dạng thẳng
5 A1022 ñường kính 0,2 cm, sợi khí sinh màu trắng sau chuyển sang vàng, tâm khuẩn lạc già tạo giọt nước, cơ chất màu vàng nâu
Dạng thẳng
6 A1041 ñường kính 0,3 cm - 0,5cm, sợi khí sinh màu xám, bề mặt hơi dẹt
Dạng xoắn
7 A1043 ñường kính 0,1 cm - 0,2cm, sợi khí sinh màu nâu, bề mặt hơi dẹt
Dạng xoắn
8 A1073 ñường kính 0,2cm - 0,3cm, sợi khí sinh màu xám ngả vàng, ngoài màu trắng xám, bề mặt hơi dẹt
Dạng xoắn
9 A1393 ñường kính 0,2cm - 0,3cm, khuẩn lac nhỏ, lồ cao, sợi khí sinh màu trắng
Dạng thẳng
10 A1470 ñường kính 0,3cm, bề mặt lồi, sợi khí sinh xung quanh màu xám, tâm màu trắng
Dạng thẳng
3.5.2 Giải trình t ự 16S rDNA ñối với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Nonomuraea
Như ñã trình bày ở phần 3.1. phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự và so sánh
16S rDNA ñã ñược dùng ñể phân biệt các chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm. ðiều thú vị
là cả 7 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm chọn lọc ñược lại cùng thuộc chi Nonomuraea.
Quan hệ di truyền giữa các chủng này ñược trình bày ở hình 3.6. và qua ñó cho thấy 7
chủng này có thể chia thành 5 nhóm.
Tóm lại, mặc dù bộ sưu tập xạ khuẩn từ Cát Bà có mức ñộ ña dạng về phân loại
nhưng các chủng có hoạt tính kháng vi sinh vật cao chỉ thuộc về hai chi Streptomyces và
Nonomuraea.
45
Hình 3.6. Cây chủng loại phát sinh trình tự rDNA 16S cho thấy vị trí của 7 chủng xạ khuẩn hiếm trong chi Nonomuraea
Giá trị tại các ñiểm phân nhánh lớn hơn 500 ñược biểu diễn trên cây. Thước ño là 5% khác biệt trong trình tự DNA. Microbispora parva ñược chọn làm gốc phân nhánh
3.6. Sàng lọc khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược
Một trong những nhóm kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn hiện ñang ñược sử
dụng ñể ñiều trị nhiều loại ung thư là anthracycline. ðể bước ñầu tìm hiểu xem liệu 17
chủng chọn lọc ñược có chủng nào sinh anthracycline không chúng tôi ñã tiến hành phép
thử ñặc hiệu với nhóm hợp chất này – thử nghiệm biến ñổi màu phụ thuộc vào pH.
Nguyên tắc của phép thử này là ở chỗ do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo
hóa học, các anthracycline thay ñổi màu sắc theo pH của môi trường, cụ thể là có màu da
cam ở pH acid và màu tím khi ở pH base.
Trên cùng ñĩa nuôi, hai pH khác nhau ñược tạo thành bằng cách nhỏ dung dịch acid
và base vào hai giếng ñược ñục ở chỗ khuẩn lạc mọc tốt. Sau khoảng 20 phút quan sát
màu sắc quanh các giếng ñể có kết luận bước ñầu về kháng sinh mà chủng xạ khuẩn ñó
sinh ra. Kết quả cho thấy, trong 17 chủng nghiên cứu chỉ có 2 chủng (A1018 và A1073) là
thể hiện phản ứng này tức chuyển màu da cam khi có pH acid và màu tím khi có pH base
46
(hình 3.7). Như vậy, rất có thể hợp chất do hai chủng xạ khuẩn này sinh ra thuộc nhóm
kháng sinh anthracycline.
Hình 3.7. Sự thay ñổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng A1018 và A1073. A: giếng có pH acid; B: giếng có pH base. A16 – chủng ñối chứng sinh anthracyclin.
3.7. Các nghiên cứu liên quan ñến các chủng có hoạt tính gây ñộc tế bào
3.7.1. Hoạt tính gây ñộc tế bào
Như vậy, qua các nghiên cứu ở trên có ba chủng xạ khuẩn ñược thấy là có tiềm
năng sinh chất kháng sinh kháng ung thư là A1018, A1022 và A1073. Trong ñó A1022 có
phổ TLC gần với chủng ñối chứng sinh anthracycline A16 (xem mục 3.4.1); A1018 vừa
có phổ TLC tương tự ñối chứng lại vừa ñược chọn từ phép thử thay ñổi màu do thay ñổi
pH (xem các mục 3.4.1 và 3.6); còn A1073 thì ñược lựa chọn từ phép thử pH (xem mục
3.6).
Các chất chiết từ dịch nuôi của ba chủng này và của chủng ñối chứng sinh
anthracycline (A16) ñược gửi thử nghiệm hoạt tính gây ñộc tế bào tại Phòng Sinh học
thực nghiệm, Viện Hóa các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Quy trình thử nghiệm, các dòng tế bào dùng trong thử nghiệm ñã ñược trình bày ở
phân phương pháp của báo cáo này. Kết quả nhận ñược cho thấy cả 4 chất chiết từ dịch
nuôi các chủng ñều có kết quả dương tính với cả 3 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2),
ung thư phổi (Lu) và ung thư cơ vân tim (RD) của người (bảng 3.6).
Hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư ñược thể hiện thông qua phần trăm tế bào sống
sót và IC50 (trong trường hợp này ñược hiểu là nồng ñộ chất làm chết 50% tế bào). Trong
ñó chủng A1073 cho hoạt tính cao nhất và cao một cách có nghĩa so với hai chủng còn lại
mà chúng tôi lựa chọn thử nghiệm. Hoạt tính của A1073 tương ñương với chủng ñối
47
chứng A16. Cả ba chủng ñều có hiệu quả gây ñộc cao với dòng RD – ung thư cơ vân tim.
ðiều thú vị là khi sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh ba chủng này cũng là các
chủng thể hiện hoạt kháng vi sinh vật nhân thật (tức F. oxysporium và C. albicans) khá
cao. Vậy phải chăng có mối liên hệ giữa hoạt tính kháng vi sinh vật và hoạt tính kháng tế
bào ung thư? Cho ñến nay chưa có tài liệu nào ñề cập ñến mối liên hệ này.
Bảng 3.6. Kết quả xác ñịnh hoạt tính gây ñộc tế bào
Dòng tế bào TT Mẫu
Hep-G2 Lu RD
Kết luận
Phần trăm sống sót (%) 1 Chứng âm (DMSO) 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 Âm tính 2 Chứng dương 1,8 ± 0,5 1,2 ± 0,1 0,5 ± 0,0 Dương tính 3 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1018 12,3 ± 0,6 7,6 ± 0,1 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả
3 dòng 4 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1022 50,1 ± 0,2 25,1 ± 0,7 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả
3 dòng 5 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1073 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả
3 dòng 6 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A16 0,6 ± 0,4 3,9 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả
3 dòng Giá trị IC50 (µg/ml) 1 Chứng dương 0,310 0,420 0,220 Dương tính 2 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1018 4,170 1,440 2,700 Dương tính với cả
3 dòng 3 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1022 20,000 5,250 0,446 Dương tính với cả
3 dòng 4 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A1073 0,510 0,450 0,550 Dương tính với cả
3 dòng 5 Chất chiết từ dịch
nuôi chủng A16 0.585 0.545 0.469
Dương tính với cả 3 dòng
Chứng dương: là một trong những chất có khả năng diệt tế bào (ellipithine, vinblastine hoặc taxol) pha trong DMSO. Hep-G2: dòng tế bào ung thư gan, Lu: dòng tế bào ung thư phổi, RD: dòng tế bào ung thư cơ vân tim. IC50: nồng ñộ chất làm chết 50% tế bào ung thư.
3.7.2. Phân tích HPLC các hợp chất chiết từ dịch nuôi của các chủng có hoạt tính
kháng tế bào ung thư
Sau khi ñã nhận ñược kết quả khả quan khẳng ñịnh khả năng gây ñộc tế bào ung thư,
các chủng A1018, A1022 và A1073 ñược tiếp tục nuôi với thể tích lớn nhằm thu ñược
nhiều hơn chất tan trong ethyl acetate. Các chất tan này sau ñó ñược tiến hành sắc ký trên
48
HPLC ñể so sánh với cơ sở dữ liệu hiện có tại ðại học Tổng hợp Osaka nhằm tìm hiểu
bản chất của các chất này. Các ñiều kiện sắc ký ñã ñược trình bày chi tiết ở phần phương
pháp (2.2.5.2.b). Kết quả sắc ký ñược tổng kết trong bảng 3.7, sắc ký ñồ ñược trình bày
trong hình 3.8; 3.9 và 3.10.
Bảng 3.7. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ dịch nuôi của 3 chủng có
hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư
Mẫu
Bước sóng phân tích (nm)
Số lượng ñỉnh
Thời gian thôi mẫu của ñỉnh chính (phút)
%
6.305 9.8890 16.632 46.4839
254,4 27
18.076 11.1244 0.862 15.4892 290,16 14 6.306 29.6140 0.922 19.0729 210,8 30 1.079 67.4264 0.936 36.1242
Chất chiết từ dịch nuôi chủng A1018
230,16 32 1.090 51.1499 7.190 16.5334 254,4 40 8.107 30.9796 7.190 16.3111 290,16 35 8.107 24.5976
210,8 40 1.160 34.3541 0.909 13.1443
Chất chiết từ dịch nuôi chủng A1022
230,16 49 1.081 21.3425 7.182 18.6807 7.336 11.7642
254,4 48
8.099 25.0185 290,16 47 Không có ñỉnh nổi trội
1.080 32.9418 7.182 5.4240 8.099 7.2609
210,8 50
23.073 5.9238 1.023 31.0006 7.182 10.1459 8.098 8.1295
Chất chiết từ dịch nuôi chủng A1073
230,16 49
23.072 6.0938 [ñỉnh chính ñược hiểu là ñỉnh chiếm % cao so với tổng diện tích sắc ký ñồ hoặc ñỉnh có ñộ cao
(mAU-mili ñơn vị hấp thụ) khác biệt ñáng kể so với các ñỉnh thu ñược sau sắc ký]
49
Hình 3.8. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1018
50
Hình 3.9. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1022
51
Hình 3.10. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1073
52
Qua phân tích kết quả bước ñầu có thể nhận thấy như sau:
- Với mẫu A1018: có thể gồm 8 chất khác nhau với thời gian (phút) thôi ra là 0.862,
0.922, 0.936, 1.079, 1.090, 6.305, 16.632 và 18.076
- Với mẫu A1022: có thể gồm 5 chất khác nhau với thời gian (phút) thôi ra là 0.909,
1.081, 1.160, 7.190 và 8.107
- Với mẫu A1073: có thể gồm 6 chất khác nhau với thời gian (phút) thôi ra là 1.023;
1.080; 7.182; 7.336; 8.099 và 23.073
Hiện nay việc so sánh với cơ sở dự liệu các chất có hoạt tính sinh học ñang ñược tiến
hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật phân tử, Trung tâm Công nghệ sinh học quốc tế
(International Centre of Biotechnology-ICBiotech), ðại học Tổng hợp Osaka, Nhật Bản.
53
KẾT LUẬN
Từ kết quả thu ñược, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. 424 chủng xạ khuẩn ñã ñược phân lập tại Vườn Quốc gia Cát Bà với 353 chủng
(83.25%) từ ñất và 71 chủng (16.75%) từ mẫu lá cây mục.
2. Gần 70% số chủng phân lập ñược thuộc chi Streptomyces, phần còn lại thuộc về 10 chi
xạ khuẩn hiếm trong ñó hơn 6% thuộc chi Micromonospora và 4% thuộc chi
Nonomuraea.
3. Bằng sơ bộ sàng lọc, 115 chủng (chiếm hơn 27% số chủng phân lập ñược) có hoạt tính
kháng ít nhất một trong bốn chủng vi sinh vật kiểm ñịnh.
4. Trong 115 chủng có hoạt tính kháng sinh, 17 chủng có hoạt tính cao và kháng ít nhất
hai trong bốn vi sinh vật kiểm ñịnh. Các chủng này thuộc hai chi Streptomyces (10
chủng) và Nonomuraea (7 chủng). Bằng phân tích quan hệ di truyền, 7 chủng thuộc
chi Nonomuraea có thể xếp vào 5 nhóm.
5. Hiệu quả chiết chất tan trong ethyl acetate (từ 1 lít dịch nuôi cấy) dao ñộng từ 30mg
(chủng A154) ñến 2152mg (chủng A444). So với chất khô thì chất chiết ñược chiếm
từ 0,51% (chủng A154) ñến 14,89% (chủng A396).
6. Qua phân tích TLC, chủng A396 có hai băng có cùng ñộ di ñộng tương ñối với
chloramphenicol; các chủng A45 và A410 (mỗi chủng một băng) có băng có cùng ñộ
di ñộng tương ñối với các băng của erythromycin. Không có mẫu nào có băng tương
ñồng với kitasamycin. Hai chủng A1018 và A1022 có phổ TLC tương ñối gần với
phổ TLC của chủng ñối chứng sinh anthracycline.
7. Qua phân tích HPLC chất chiết từ 17 chủng nghiên cứu, với cùng một ñiều kiện sắc ký
chủng A396 cho một ñỉnh có thời gian thôi tương ứng với kháng sinh
chloramphenicol.
8. Hai chủng A1018 và A1073 có phản ứng tương tự khi có pH thay ñổi ñặc trưng cho vi
sinh vật sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline.
9. Chất chiết từ dịch nuôi của ba chủng A1022, A1018 và A1073 có tác dụng gây ñộc
cho ba dòng tế bào ung thư (gan, phổi và cơ vân tim) trong ñó A1073 có hoạt tính cao
nhất.
10. Qua HPLC, với cùng một ñiều kiện phân tích, chất tan trong ethyl acetate của dịch
nuôi từ chủng A1018 tách thành 8 ñỉnh với thời gian (phút) thôi ra là 0.862, 0.922,
54
0.936, 1.079, 1.090, 6.305, 16.632 và 18.076; từ chủng A1022 tách thành 5 ñỉnh với
thời gian (phút) thôi ra là 0.909, 1.081, 1.160, 7.190 và 8.107; từ chủng A1073 tách
thành 6 ñỉnh có thời gian (phút) thôi là 1.023; 1.080; 7.182; 7.336; 8.099 và 23.073.
KI ẾN NGHỊ
ðể tiếp tục hướng nghiên cứu này một số ñịnh hướng cần tiếp tục:
- Xác ñịnh ñỉnh có hoạt tính sau sắc ký
- Nghiên cứu tinh sạch chất có hoạt tính
- Nghiên cứu cấu trúc hóa học của chất có hoạt tính sau khi ñã tinh sạch
55
TÀI LI ỆU THAM KH ẢO
Tiếng Việt
1. Ki ều Hữu Ảnh, Phạm Văn Ty, Lê Gia Hy, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Thanh
Huyền, 2003. Tách chiết chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces
hygroscopicus TC-54 có hoạt tính cao chống nấm gây bệnh, Tạp chí Sinh học, tập
25-số 2A, trang 85-91
2. Vi Th ị ðoan Chính (2000), Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh của
chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật
dung hợp tế bào trần, Luận án TS sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội.
3. Bùi Th ị Việt Hà, Lê Gia Hy, Ki ều Hữu Ảnh, 1998. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
xạ khuẩn Streptomyces sp. TC54 sinh chất kháng sinh, Tạp chí Khoa học và Công
nghệ, XXXVI, 6B, tr.155-159
4. Bùi Thị Việt Hà, ðào Duy ðạt, Ki ều Hữu Ảnh, 2004. Phân lập và tuyển chọn xạ
khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật, Tạp chí Khoa học, T. XX,
No2AP., tr103-107
5. Bùi Th ị Việt Hà, Nguyễn Thanh Huyền, ðinh Xuân Tuấn, Kiều Hữu Ảnh, 2004.
Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở 2 chủng xạ
khuẩn T41, D42, Tạp chí Di truyền và Ứng dụng, tr 50-55, T-4
6. Bùi Vi ệt Hà, 2005. Study on Streptomyces hygroscopicus for control of
phytopathogenic fungi. VNU, J. Scien Nat Tech, T.XXI, N04AP.
7. Lại Thúy Hi ền, Nguyễn Thị Lợi, Lê Gia Hy, Kiều Hữu Ảnh, 1998. ðặc ñiểm phân
loại và khả năng sử dụng dầu mỏ của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ nhiên liệu
JET-A1 ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, XXXVI, 6B, tr.64-69
8. Nguyễn Phú Hùng, Liễu Thị Phương, Nguyễn Thị Yên, Trịnh Ngọc Hoàng, Vi
Thị ðoan Chính, 2009. Tuyển chọn và ñịnh loại một số chủng xạ khuẩn có khả năng
ñối kháng vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện. Tạp chí Y học Thực hành, số 2, 8-
2009, tr.81-85.
9. Lê Gia Hy, Phạm Kim Dung, Nguyễn Hồng Hà, Vũ Thị Nhung, Phạm Thị Bích
Hợp, Phạm Minh Hương, Ngô ðình Bính, 1992. Tính ñối kháng của xạ khuẩn phân
lập từ ñất Việt Nam ñối với bệnh ñạo ôn. Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4, tr.11 - 12.
56
10. Lê Gia Hy, Phạm Thị Bích Hợp, Ngô ðình Bính, 1992. Nghiên cứu khả năng sinh
chất kháng sinh chống nấm gây bệnh ñạo ôn của một số chủng xạ khuẩn
(Streptomyces) phân lập ở Việt Nam. Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4, tr. 59-63.
11. Lê Gia Hy, Phạm Kim Dung, Phạm Thị Bích Hợp, Ngô ðình Bính, 1994. Ảnh
hưởng của môi trường lên men lên khả năng sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm gây
bệnh thực vật của chủng xạ khuẩn 5820. Tạp chí Sinh học, tập 16, số 2, tr. 44 - 48.
12. Lê Gia Hy, Phạm Thị Bích Hợp, 2004. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên
cứu sản xuất kháng sinh nhóm b-lactam. Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn
quốc: Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống ñịnh hướng y dược
học. Nxb KH&KT, Hà Nội, tr. 246-251.
13. Lê Gia Hy, Nguyễn Phương Nhuệ, Phan Thị Hồng Thảo, Phạm Thị Bích Hợp,
2005. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng
Streptomyces orientalis 4912. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005: Những vấn
ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr.
574-577.
14. Biền Văn Minh và cộng sự, 2000. Tìm hiểu khả năng sinh kháng sinh và ñặc ñiểm
phân loại của một số chủng Micromonospora phân lập từ ñất Bình Trị Thiên. Tạp
chí Khoa học, ðại học Huế số 2, 2000, tr: 24 28.
15. Biền Văn Minh và cộng sự, 2000. Khảo sát xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc chi
Micromonospora từ ñất bùn Thừa Thiên Huế. Tạp chí Khoa học và Công nghệ số
1(38), 2000, tr: 18 - 21.
16. Biền Văn Minh và cộng sự, 2003. Một số tính chất lý hoá của chất kháng sinh M101
chống vi nấm chiết xuất từ Streptomyces craterifer S1. Tạp chí khoa học, Trường
ðHSP Hà Nội số 4, 2003, tr: 91- 93.
17. Biền Văn Minh và cộng sự, 2003. Khảo sát xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc chi
Micromonospora từ ñất bùn ở Bình Trị Thiên. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc
lần thứ 2, NCCB trong Sinh học, Nông nghiệp, Y dược, Huế, 25- 26/07/2003, tr: 177
- 179.
18. Biền Văn Minh và cộng sự, 2004. Phân lập chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ một
số mẫu ñất bùn ở Thừa Thiên Huế. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2004,
NCCB trong khoa học sự sống. ðịnh hướng Nông Lâm nghiệp miền núi, Thái
Nguyên 23/09/2004, tr: 822 - 824.
57
Tiếng Anh
1. Alex Y.l.T., Hai M.T. (2006), Microbial Biotechnology (2nd edition) Principles and
Applications, World scientific, pp. 3 – 23.
2. Arnold L.D., Sergio S. (2009), “Microbial drug discovery: 80 years of progress”, J.
Antibiotics, 62, pp. 5–16.
3. Ashutosh K. (2008), Pharmaceutical Microbiology, New Age International (P) Ltd,
pp. 89 – 101.
4. Burdick M.D., Harris A., Reid C.J., Iwamura T., Hol lingsworth M.A. (1997).
Oligosaccharides expressed on MUC1 by pancreatic and colon tumour cell lines,
J.Biol. Chem. 272, 24198-24202.
5. Carlo O., Carmen M., Jose A.S. (2009), “Antitumor compounds from marine
actinomycetes”, Marine Drugs, 97, pp. 210 – 248.
6. Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F. (2005), “Arthrobacter ardleyensis sp.
nov. isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment”, Arch Microbiol,
183, pp. 301-305.
7. Creighton T.E. (1999), The encyclopedia of molecular biology, Vol 1-4, John Wiley
& Sons, Inc, pp. 771 – 779.
8. Cruciani R.A., Barker J.L., Zasloff M, Chen H.C., Colamonici O. (1991)
Antibiotic magainins exert cutolitic activity against transformed cell lines through
channel formation. Proc. Natl. Acad. Sci., 3792-3796
9. Dobrzanska J., Szachowicz-Petelska, Sulkowski S., Figaszewski. (2005). Changes
in electric charge and phospholipids composition in human colorectal cancer cells.
Mol. Cell. Biochem. 276, 113-119
10. Duong V.H., Ando K. (2010), Taxonomic and ecological studies of microorganisms
in Vietnam and the utilization, Joint research project between IMBT-VNU and NITE-
DOB, Japan, final report, March 2010, pp. 315 – 358.
11. Dutia, Pankaj (2004). "Ethyl Acetate: A Techno-Commercial Profile" (PDF).
Chemical Weekly: 184.
http://www.chemicalweekly.com/Profiles/Ethyl_Acetate.pdf#page=6. Retrieved
2009-03-21
58
12. Eyassu H.G. (2002), “Antimicrobial resistance: A global public health threat”, J. Erit.
Med. Assoc. Jema, pp. 36 – 40.
13. Felsenstein J. (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using the
bootstrap”, Evolution, 39, pp. 783–791.
14. Fred C. Tenover (2006), “Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria”, Amer.
J. Med, 119, pp. 3–10.
15. Gernot V. (1997), Morphology of actinomycetes, In Miyadoh S., Hamada M., Hotta
K., Kudo T., Seino T. et al (eds), Atlas of Actinomycetes, Asakura, Tokyo, pp. 180-
191.
16. Gewirtz D.A. (1999), “A critical evaluation of the mechanism of action proposed for
the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin”,
Biochem Pharmacol, 57, pp. 727 – 741.
17. Goodfellow M., Williams S.T., Mordarski M. (1988), Actinomycetes in
biotechnology, Academic Press, London, pp. 1 – 32.
18. Goodfellow M., Davenport R., Stainsby F.M., Curtis T.P. (1996), “Actinomycete
diversity associated with foaming in activated sludge plants”, J. Ind. Microbiol.
Biotechnol, 17, pp. 268-280.
19. Guoliang Yin, Weimin Wang, Sha Sha, Lei Liu and Xiaoping Yu (2010),
“Inhibition and control effects of the ethyl acetate extract of Trichoderma harzianum
fermented broth against Botrytis cinerea”. African Journal of Microbiology Research
Vol. 4(15), pp. 1647-1653.
20. Hayakawa M., Otoguro M., Takeuchi T., Yamazaki T., Iimura Y. (2000),
“ Application of method incorporating differential centrifugation for selective
isolation of motile actinomycetes in soil and plant litter”, Antonie Van Leeuwenhoek,
78, pp. 171 – 185.
21. Horie M., Saito K., Nakazama H. (1996), “Determination of kitasamycin and
josamycin in meat by HPLC”, Japan Analyst, 45, pp. 1089 – 1094.
22. Hopwood A. D. (2007), Streptomyces in nature and medicine, the antibiotics maker,
Oxford University Press, pp. 28 – 50.
23. Hoskin DW, Ramamoorthy A. (2008). Studies on anticancer activities of
antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta. 1778(2), 357-75.
59
24. Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A., Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang
C.L. (2004), “Nocardiopsis alkaliphila sp. nov., a novel alkaliphilic actinomycete
isolated from desert soil in Egypt”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 54, pp. 247-252.
25. Ichikawa T., Date M., Ishikura T., Ozaki A. (1971), “Improvement of kasugamycin-
producing strain by the agar piece method and the prototroph method”, Folia
Microbiol, 16, pp. 218 – 224.
26. Irena C. (2010), Encyclopedia of chromatography 3rd Edition, CRC Press, pp. 89 –
95.
27. Jeffrey R.K. (1978), “High-Performance Liquid Chromatographyic assay of
chloramphenicol in serum”, Antimicrob Agent Chemother, 14, pp. 439 – 443.
28. Kristof M. (2009), PhD thesis: Quantitative liquid chromatographic analysis of
anthracyclines in biological fluids, Ghent University, Belgium.
29. Leo M.L.N. (2000), Food analysis by HPLC 2nd Ed, Marcel Dekker, New York, pp.
649 – 653.
30. Likhiwitayawuid, K., Angerhofer, C.K., Chai, H., Pezzuto, J.M., Cordell, G. and
Ruangrungsi, N., 1993. Cytotoxic and antimalarial alkaloids from the bulbs of
Crinum amabile. Journal of Natural Products 56 8, pp. 1331–1338.
31. Mason M.G., Ball A.S., Reeder B.J., Silkstone G., Nicholls P., Wilson M.T. (2001),
“ Extracellular heme peroxidases in actinomycetes: a case of mistaken identity”, Appl
Environ Microbiol, 67, pp. 4512-4519.
32. Marmur J. (1961), “A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from
micro-organisms”, J Mol Biol, 3, pp. 208-218.
33. Margaret A. R., Milind A. C. (2007), Bacteriocins: ecology and evolution, Springer,
Berlin Heidelberg New York, pp. 1-5.
34. Matook S. M., Fumio H. (2005), “Antibacterial and antioxidant activities of banana
(Musa, AAA cv. Cavendish) fruits peel”, Amer J Biochem Biotech, 1, pp. 125-131.
35. Miyadoh S., Hamada M., Hotta K., Kudo T., Seino T. (1997), Atlas of
Actinomycete, The Society for Actinomycetes Japan, Asakura Co, pp. 2 – 10.
36. Miyadoh S., Hotta K., Kudo T., Seino A., Suzuki K., Yokota A. (2001),
Identification Manual of Actinomycetes, The Society for Actinomycetes Japan,
Business Center for Acedamic Societies Japan, pp. 2 – 28.
60
37. Nduka O. (2007), Modern Industrial Microbiology and Biotechnology, Science,
Enfield, USA, pp. 429 – 453.
38. Newman D. J., Cragg G. M., and Snader K. M. (2003), Natural Products as
Sources of New Drugs over the Period 1981-2002, J. Nat. Prod. 2003, 66, 1022-1037.
39. Nonomura H., Ohara Y. (1969), “Distribution of actinomycetes in soil. VI. A culture
method effective for broth preferential isolation and enumeration of Mircobispora
and Streptosporangium strains in soil (Part 1)”, J Ferment Technol, 47, pp. 463 – 469.
40. Pasti M. B., Pometto A. P., Nuti M. P., Crawford D. L. (1990), “Lignin-solubilizing
ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gutt”, Appl Environ
Microbiol, pp. 2213-2218.
41. Saga T., Yamaguchi K. (2008), “History of antimicrobial agents and resistant
bacteria”, J Japan Med Assoc, 137, pp. 513 – 517.
42. Saito H., Miura K. (1963), “Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by
phenol treatment”, Biochim. Biophys. Acta, 72, pp. 619–629.
43. Saitou N., Nei M. (1987), “The neighbor-joining method: a new method for
reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol, 4, pp. 406 – 425.
44. Seong C.N., Kim Y.S., Baik K.S., Lee S.D., Hah Y.C., Kim S.B., Goodfellow M.
(1999), “Mycolic acid-containing actinomycetes associated with activated sludge
foam”, J Microbiol, 37, pp. 66-72.
45. Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica D., Warren
J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R. (1990), “New colorimetric cytotoxicity
assay for anticancer-drug screening”, J. Nat Cancer Inst, 82, pp. 1107-1112.
46. Steger K. (2006), PhD. Thesis: Composition of microbial communities in composts. A
tool to assess process development and quality of the final product. Swedish
University of Agricultural Sciences, Uppsala.
47. Stuart H. (2005), Essential microbiology, John Wiley & Sons Ltd., England, pp. 191
– 369.
48. Stubbs C., Haigh J. M., Kanfer I. (1985), “Determination of erythromycin in serum
and urine by HPLC with ultraviolet”, J Pharm Sci, 74, pp. 1126-1128.
61
49. Thomson C.J., Bialphos S.H. (1995), Genetics and Biochemistry of antibiotic
production. L.C. Vining, C. Stuttard (eds), Butterworth-Heinemann, Boston, pp. 197
– 222.
50. Thompson J. D., Gibson T. J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D. G. (1997),
“The CLUSTAL X Windows interface: flexible strategies for multiple sequence
alignment aided by quality analysis tools”, Nucleic Acids Res, 25, pp. 4876–4882.
51. Tomoo S., Keizo Y. (2009), “History of antimicrobial agents and resistant bacteria”, J
Japan Med Assoc, 52, pp. 103 – 108.
52. Tortora J. G., Funke R. B., Case L. C. (2010), Microbiology – An Introduction, 10th
ed, Pearson Education, Inc, pp. 553 – 583.
53. Trease GE, Evans WC (1996), A textbook of Pharmacognosy. 14th ed. Bailliere
Tindall Ltd, London, pp. 832.
54. Westley J.W., Evans R.H., Sello L.H., Troupe N., Liu C.M., Blount J.F. (1979),
“Isolation and characterization of antibiotic X-14547A, a novel monocarboxylic acid
ionophore produced by Streptomyces antibiotics NRRL 8167”, J. Antibiot, 32, pp.
100-107.
55. Young S.R., Wan J.K., Dong J.Y., Heun S.K., Soon R.C. (2001), “Synthesis and
antitumor activity of new anthracycline analogues”, Bull. Korean Chem. Soc, Vol. 22,
9, pp. 963 – 968.
56. http://science.howstuffworks.com/question479.htm
62
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Thành phần các môi trường nuôi cấy
1. Môi tr ường Mueller – Hinton (MHA)
- Cao thịt 3 g
- Casein thủy phân 17,5 g
- Tinh bột 1,5 g
- Thạch 17 g
- Nước cất 1 lít
- pH 7,4
2. Môi tr ường tinh bột-cao nấm men
- Glucose 10 g
- Cao nấm men 2 g
- Thạch 17 g
- Nước cất 1 lít
- pH 7,0
3. Môi tr ường dinh dưỡng ñậu tương
- Tinh bột 25 g
- ðậu tương 15 g
- Cao nấm men 1 g
- CaCO3 4 g
- Nước cất 1 lít
- pH 6,2
4. Môi tr ường cao malt- nấm men
- Cao malt 3 g
- Cao nấm men 3 g
- Glucose 10 g
- Pepton 5 g
- Thạch 17 g
- Nước cất 1 lít
5. Môi tr ường thạch vitamin-acid humic
- Acid humic 1 g
- CaCO3 0,02 g
- FeSO4.7H2O 0,01 g
- KCl 1,71 g
63
- MgSO4.7H2O 0,05 g
- Na2HPO4 0,5 g
- Cycloheximide 50 mg
- Nalidixic acid 20 mg
- Kabicidine 14 mg
- Thạch 14 g
- pH 7,2
64
Phụ lục 2. Trình tự các gene rDNA 16S của 7 chủng thuộc chi Nonomuraea
>A0045 Contig1, 1495 bases TTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACCGCCCCCGGCATCGGGTGGTGGTGGAAAGTTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGATCTTCCACGATCTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAACGCTCAGAGATGGGCGCCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCGGGGTGGTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCACTTTGTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCT
>A0149 Contig1, 1436 bases TGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACCGCCCCCGGCATCGGGTGGTGGTGGAAAGTTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGATCTTCCACGATCTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAACGCCTGGAGACAGGCGCCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCGGGGTGGTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCACTTTGTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC
>A0154 Contig1, 1476 bases CATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACGTTCTGTCGCATGACATGAACGTGGAAAGTTTTTTCGGTCGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCT
65
GCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAAGCTCTGGAGACAGAGCCCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCTACGTGGTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCTAAGCCGTGAGGCGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGGCCAACCCCCAAGGGGGGGAGAGGGCGAAAGTGGGGCTGGCGATTGTGACAAAATCGTAACAAGGTAGCCGTACCGCAAAGTGCGGCTGGATCACCTCCTTATAAAGGAGC >A0160 Contig1, 1440 bases, TGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCGCCTCCGGCATCGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTCGGTCGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGACCGGTCCAGAGATAGGCCTTCCCTTTTGGGCTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAACACCTTCGGGTGGTTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAA
>A0232 Contig1, 1441 bases GCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACACACCCCGGCATCGGGTGTGTGTGGAAAGTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGCAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCGGGGTGGTGGGGACTCATG
66
GGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCTAAACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAA >A0396 Contig1, 1432 bases TGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCGCCTCCGGCATCGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTCGGTCGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGACCGCCTCAGAGATGGGGCTTCCCTTTTGGGCTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAACACCTTCGGGTGGTTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGT >A0444 Contig1, 1496 bases GTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCGCCTCCGGCATCGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGACCGGTCTAGAGATAGGCCTTCCCTTTTGGGCTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAACACTTTCGGGTGGTTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCG
67
Phụ lục 3. Kết quả phân tích HPLC chất chiết từ dịch nuôi các chủng chọn lọc ñược
với các ñiều kiện tương ứng với các kháng sinh chuẩn
68
Phụ lục 4. Bản sao kết quả thử nghiệm gây ñộc tế bào
69
Phụ lục 5. Kết quả phân tích HPLC chất chiết thu ñược từ dịch nuôi của ba chủng
có hoạt tính kháng tế bào ung thư người
70
SẢN PHẨM CỦA ðỀ TÀI Bài báo
• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam.
Tạp chí Công nghệ sinh học (ñã nhận ñăng).
• Bước ñầu nghiên cứu sàng lọc kháng sinh chống ung thư từ xạ khuẩn thu thập ở vườn
Quốc gia Cát Bà, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, ðại học Quốc gia Hà Nội (ñã nhận
ñăng).
ðào tạo
ðề tài ñã góp phần ñào tạo 01 Thạc sỹ chuyên ngành công nghệ sinh học thuộc chương trình ñào
tạo liên kết quốc tế với ðại học Liege, Vương quốc Bỉ với tên ñề tài là: “Biodiversity and
antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam”. Học viên Nguyễn
Phương Chung ñã bảo vệ thành công luận văn với kết quả xuất sắc trước Hội ñồng ngày 24 tháng
2 năm 2011.
71
PHIẾU ðĂNG KÝ
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ðỀ TÀI KHCN
Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi
sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn
Mã số: QG.09.48
Cơ quan quản lý ñề tài: ðại học Quốc gia Hà Nội
ðịa chỉ: 144 ñường Xuân Thủy, Cầu Giấy – Hà Nội
ðiện thoại: 37 54 86 64
Cơ quan chủ trì ñề tài: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ðHQGHN
ðịa chỉ: Nhà E2, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy – Hà Nội
ðiện thoại: 37547407
Tổng chi phí thực chi: 100.000.000 ñ
Trong ñó:
− Từ ngân sách NN: 100%
− Nguồn khác: không có
Thời gian nghiên cứu: 2 năm
− Thời gian bắt ñầu: 3/2009
− Thời gian kết thúc: 3/2011
Tên các cán bộ phối hợp nghiên cứu:
− Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên
− Cán bộ tham gia: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển
- TS. ðinh Thúy Hằng
- CN. Lê Phương Chung
- ThS. Phan Thị Hà
- CN. Lê Hồng Anh
Số ñăng ký ñề tài
Ngày
Số chứng nhận ñăng ký KQNC
Ngày
Bảo mật
A. Phổ biến rộng rãi
Tóm tắt ý nghĩa, kết quả nghiên cứu:
- 424 chủng xạ khuẩn (gồm 353 chủng từ mẫu ñất và 71 chủng từ mẫu lá cây mục) thu
thập tại vườn Quốc gia ñã ñược phân loại.
72
- 424 chủng xạ khuẩn ñã ñược sàng lọc hoạt tính kháng sinh với 4 vi sinh vật kiểm ñịnh
cho thấy trong ñó có 115 chủng biểu hiện hoạt tính kháng ít nhất một trong bốn vi sinh
vật kiểm ñịnh.
- Với 115 chủng có hoạt tính này có 2 chủng (A1073, A1393) kháng cả 4 chủng vi sinh
vật kiểm ñịnh, 7 chủng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470)
kháng với 3 chủng kiểm ñịnh, 8 chủng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427
và A444) có hoạt tính kháng 2 vi sinh vật kiểm ñịnh. Xét về ñối tượng bị kháng thì 14
chủng có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn Gram âm (E. coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn
Gram dương (M. luteus); 11 chủng có hoạt tính kháng cả hai nhóm vi khuẩn; 12 chủng
có hoạt tính kháng nấm sợi (F. oxysporium) và chỉ 6 chủng có hoạt tính kháng nấm
men (C. albicans). Như vậy tổng cộng có 17 chủng có hoạt tính kháng ít nhất 2 vi sinh
vật kiểm ñịnh ñã ñược lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
- 17 chủng ñã ñược nuôi cấy thu dịch nuôi và dịch nuôi ñã ñược chiết bằng ethyl acetate
ñể thu các hợp chất có hoạt tính sinh học. Hiệu quả chiết chất tan trong ethyl acetate
(từ 1 lít dịch nuôi cấy) dao ñộng từ 30mg (chủng A154) ñến 2152mg (chủng A444).
So với chất khô thì chất chiết ñược chiếm từ 0,51% (chủng A154) ñến 14,89% (chủng
A396).
- Các chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 17 chủng xạ khuẩn ñã ñược phân tích
sắc ký bản mỏng (TCL) ñể so sánh với ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin,
erythromycin và với dịch nuôi của chủng ñối chứng sinh anthracycline (A16). Số băng
thu ñược sau sắc ký dao ñộng từ 1 ñến 4 băng. Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232,
A410, A427, A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ
có 2 băng, 4 chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390,
A1022) cho phổ 4 băng. So với các kháng sinh chuẩn thì thấy chất chiết từ dịch nuôi
của chủng A396 là có băng tương ứng với chloramphenicol; chất chiết từ dịch nuôi
chủng A45 và A410 có băng trùng với băng của erythromycin, không có mẫu nào có
băng tương ñồng với các băng của kháng sinh kitasamycin. So với dịch nuôi của
chủng ñối chứng sinh anthracycline, các mẫu A1018 và A1022 có phổ sắc ký rất gần
với ñối chứng này.
- Các chất tan trong ethyl acetate của 17 chủng lựa chọn ñược phân tích qua sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) với các ñiều kiện sắc ký như với các kháng sinh chuẩn cho thấy
ngoài chủng A396 có ñỉnh tương tự với ñỉnh thu ñược từ chloramphenicol, tất cả các
mẫu còn lại không tìm thấy mối tương quan nào so với các kháng sinh ñối chứng.
73
- Bằng phép thử ñặc hiệu (ñổi màu theo pH) với các chủng sinh kháng sinh thuộc nhóm
anthracycline nhận thấy có hai chủng có biểu hiện dương tính với phép thử này là
A1018 và A1073.
- 3 chủng ñược lựa chọn thử nghiệm hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư người là A1018
(có phổ TLC và phản ứng ñổi màu pH tương tự chủng ñối chứng), A1022 (có phổ
TLC tương tự ñối chứng) và A1073 (phản ứng ñổi màu pH). Bằng thử nghiệm với ba
dòng tế bào ung thư người là ung thư gan, phổi và cơ vân tim, các hợp chất chiết từ
dịch nuôi của cả ba chủng chọn lọc ñược của ñề tài ñều có tác dụng dương tính với cả
ba dòng tế bào ung thư. So sánh về chỉ số IC50 (nồng ñộ gây chết 50% tế bào ung thư,
tức chỉ số này càng nhỏ thì hiệu quả gây ñộc tế bào càng lớn) thì thấy trong ba mẫu
nghiên cứu chất chiết từ dịch chiết của chủng A1073 có chỉ số này thấp nhất và thấp
gần bằng ñối chứng dương (một trong những chất có khả năng diệt tế bào) của phép
thử; thấp bằng so với chủng ñối chứng sinh anthracycline và thấp hơn ñáng kể so với
hai chủng còn lại.
- Chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 3 chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư
nói trên ñã ñược phân tích HPLC với cùng một ñiều kiện sắc ký với các ñối tượng
tương tự hiện ñang ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử,
Trung tâm công nghệ sinh học quốc tế, ðại học Tổng hợp Osaka. Qua phân tích kết
quả sau sắc ký các chất chiết ñược từ dịch nuôi chủng A1018 cho 8 ñỉnh khác nhau, từ
chủng A1022 cho 5 ñỉnh khác nhau và chủng A1073 cho 6 ñỉnh khác nhau. Các dữ
liệu liên quan hiện ñang ñược so sánh phân tích với cơ sở dữ liệu hiện có tại cơ sở nói
trên nhằm tìm kiếm bản chất của các chất ñó.
- ðã ñào tạo ñược 01 thạc sỹ Công nghệ sinh học thuộc chương trình ñào tạo liên kết
quốc tế.
- 02 bài báo ñã ñược tạp chí Công nghệ sinh học và tạp chí Khoa học ðại học Quốc gia
Hà Nội nhận ñăng.
Ki ến nghị về qui mô và ñối tượng áp dụng kết quả nghiên cứu:
- Nghiên cứu bản chất/cấu trúc hóa học của các chất quyết ñịnh hoạt tính sinh học
- Sàng lọc các ñối tượng thu thập tại các ñịa danh khác của Việt Nam nhằm tìm kiếm
thêm các nguồn gene quý giá
- Xây dựng cơ sở dữ liệu sử dụng trong phân tích các chất kháng sinh bằng phương
pháp HPLC
74
Chức vụ
Chủ nhiệm ñề
tài
Thủ trưởng cơ
quan chủ trì ñề
tài
Chủ tịch hội ñồng
ñánh giá chính
thức
Thủ trưởng cơ
quan quản lý ñề
tài
Họ và tên Nguyễn Huỳnh
Minh Quyên
Dương Văn Hợp Phạm Thị Trân
Châu
Học vị TS TS GS. TSKH.
Ký tên
ðóng dấu
Recommended