Diagnóstico de infecções virais - UFRGS · Cultivo e identificação de vírus ... Colocar...

Diagnóstico de infecções virais

Diagnóstico de infecções virais

Duas formas:

-buscar o vírus ou seu genoma

Ou

- buscar a resposta do organismo

(especialmente anticorpos)

Problema/suspeita levantada a campo

Encaminhamento ao laboratório

Diagnóstico presuntivo

Diagnóstico convencional Diagnóstico molecular

Análises filogenéticas

Confirmação do diagnóstico

Tomada de decisão

Diagnóstico de viroses

► Sinais clínicos

► Detecção do vírus, antígenos ou genomas

Isolamento (+ detecção imunológica)

Hemaglutinação (HA)

ELISA

PCR

Deteção imunológica (IPX, IF)

Microscopia eletrônica

1- na busca do vírus

- inoculação em animais

- inoculação em ovos embrionados

- microscopia eletrônica

- cultivos celulares

-

Cultivo e identificação

de vírus

Cultura de células é o processo pelo qual células são

mantidas vivas e em multiplicação fora de seu tecido original, em condições controladas.

CULTURA DE CÉLULAS

- cultivos primários (células diplóides)

- linhas celulares

(diplóide, 40 passagens )

- células de linhagem

(número de passagens indefinido)

Cultivos celulares

Cultivo Primário

- Preparadas diretamente das células obtidas de

um tecido de um organismo

- Sensível a vírus

- Resiste poucas passagens ( máximo 20)

CULTIVO DE CÉLULAS

Cultivo primário senescente

Células de linhagem

Algumas células sobrevivem

Seguem multiplicando-se

Tornam-se “imortais”

Capacidade ilimitada de crescimento em cultura

– Derivadas de células tumorais

– Sofreram transformação espontânea ou

induzida

CULTURA DE CÉLULAS

CULTIVO DE VÍRUS

IN VITRO

- Garrafas de Vidro

- Garrafas de Plástico

- Garrafas fechadas ou abertas (CO2)

-Garrafas estacionárias ou rolantes

-Tubos de vidro ou plástico

-Tubos com lamínulas (tubos de Leighton)

- Placas de microtécnica com 6, 12, 24, 96 orifícios

Tubos de cultivos celulares em equipamento rotativo

Microplacas de cultivos celulares

EFEITO CITOPÁTICO (ECP):

É o dano que o vírus causa à célula !

- infelizmente, nem todos os vírus

causam danos às células!

- a maioria não causa dano nenhum!

FCV

BVDV

RSV

Rotavírus

HSV

Adenovírus

EFEITO CITOPÁTICO (ECP):

- lise

- arredondamento

- vacuolização

- formação de sincícios

- inclusões

- picnose

- apoptose

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): Herpes (coloração: violeta de genciana)

EFEITO CITOPÁTICO (ECP): Herpes (coloração: carbazol)

Microscopia eletrônica

Hemaglutinação (HA)

com vírus hemácias

se entrelaçam

e aderem

às paredes

Sem vírus Hemácias livres

sedimentam

HEMAGLUTINAÇÃO

►Interpretação Reação positiva: presença de vírus

Reação negativa: ausência de vírus

HEMAGLUTINAÇÃO

Hemaglutinação (HA) Infelizmente, Nem todos os vírus hemaglutinam ! Alguns: Influenza (gripe) Rubéola Parvovírus Coronavírus Vários arbovírus Adenovírus e vários outros

Parvo B19

Rubéola

Arbo- vírus

Hemaglutinação (HA)

Hemaglutinação

Diluição

2 4 8 16 32 64 128 256 512

prozona título

1024

Sem

vírus

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA DE CAPTURA)

Amostra a ser testada

para a detecção de vírus

vírus

Anticorpo de captura

Anticorpo

Detector

Enzima +Substrato

solúvel= cor

no líquido

Exemplos de ELISAs

Imunoperoxidase (IPX)

Soro com anticorpos

contra o vírus

Células infectadas com vírus

Anticorpo

Detector

Enzima

Substrato insolúvel

células coradas

Microscópio

Imunoperoxidase

Herpesvírus (coloração por imunoperoxidase)

Imunoperoxidase

Tabela 1. Perfís de reatividade de amostras brasileiras do vírus da raiva com um

painel de anticorpos monoclonais anti-Lyssavirus

Anticorpos monoclonais

Amostras 5A3 5G2 CVS-2 L3 L18 DB1 DB3 DB4 D3 DB9 M11

Bovinos (42)

Morcegos (6)

Felino (1)

NA (1)CVS

Caninos (8)

Humano (1)

Cachorro-do mato* (1)

Morcegos (3)

Canino (1)

Cachorro-do-mato* (1)

Reação positiva, Reação negativa

Imunofluorescência Direta

anticorpo marcado sobre material infectado

material infectado (suspeito)

+ anticorpo específico marcado com FITC

+ luz UV

________________________________________

reação colorida

Imunofluorescência direta - raiva

Imunofluorescência Indireta

Material infectado (células ou tecidos)

+ soro específico (ex: soro humano)

+ conjugado anti-IgG específico (ex. anti-IgG humana/FITC)

+ luz UV

______________________________________________

= reação colorida

Imunofluorescência- Herpes

Western blot (para a detecção de antígenos)

Reação da polimerase em cadeia (PCR)

DNA viral

primers

Primeiro ciclo

Segundo ciclo

20-40 ciclos

Milhões de cópias

Amplificação pela reação da polimerase em cadeia (PCR)

DESNATURAÇÃO

HIBRIDIZAÇÃO

POLIMERIZAÇÃO

DNA FITA

DUPLA

5´-

3´

fragmento a

amplificar

ADN

ciclo 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo

4

0 0 2 8

nº de cadeias

duplicadas

de comprimento

correto:

4 PRIMEIROS CICLOS DA PCR: 4 primeiros ciclos

REA com Bgl II

PV 022

Hum

568

Can

3558

Can

3462

Bov

189

Bov

M03

Bov

97

Fel

1024

Morc

2138

Morc

2217

C.mato

0,6 kb

1,5 kb

MODIFICAÇÕES da PCR

RT-PCR

AAAAA

AA RT

PCR

RNA

ADN

fs

DNA fd

Nested-PCR

PCR 1er par de primers

PCR 2do par de primers

ADN fd

Multiplex

PCR Possíveis múltiplos

pares de primers

ADN fd

15

6

4

3

2

1

10

20

30

Kbp

A E B D

A

B C D E

G, H, I F

J

K

L

M

N

Análise do DNA viral com enzimas de restrição

HERPESVÍRUS RFLP

- RFLP

BamHI EcoRI BstEII HindIII

BHV

1 5a 5a 1 5a 5a 1 5a 5a 1 5a 5a

23,1 23,1

9,4 9,4

6,5 6,5

4,4 4,4

2,3

2,0 2,0

2,3

Kb Kb

FIGURA 2: Perfis de restrição enzimática das amostras de BHV-5 analisadas após eletroforese em gel de agarose 0,6%.

: marcador de peso molecular HindIII; 1: amostra padrão de BHV-5b A663; 2: amostra de campo SV 136/88 (BHV-5a); 3: amostra de campo EVI 88/95 (BHV-5a). As diferenças entre os subtipos são destacadas pelas setas.

Figura 4. Árvore filogenética baseada na sequência de aminoácidos deduzidas do sequenciamento

de 225 pb do gene N. Origem da amostras: 2217 e 2263 (Cachorro-do-mato; Cerdocyon thous),

585 (canino), 189 (bovino), 576 (morcego não hematófago Molossus molossus), 97 (felino), 686

(morcego, espécie não identificada), rvu22862 (canino), AF070449 (morcego hematófago

Desmodus rotundus), AF070450 (morcego não hematófago Tadarida brasiliensis).

0 2 4

BRfx2217

BRfx2263

BRdg585

rvu22862

AF070449Dr

BRbv189

AF070450Tb

BRbt576

BRct97 .1

BRbt686

Cachorro-do-mato (2217)

Cachorro-do-mato (2263)

Canino (585)

Canino (rvu22862)

Morcego H (AF070449)

Bovino 189

Morcego NH (AF070450)

Morcego NH (576)

Felino (97)

Morcego NI (686)

Análises filogenéticas

Neuraminidase > aqui fica clara a origem do segmento

6 em suíno > amostras com quadrado vermelho

Hemaglutinina > sem valor

filogenético, possível origem

só com amostras de suíno

Aqui as amostras recentes

Até aqui, só

vimos métodos de

detecção do agente !

Como podemos detectar

anticorpos?

Diagnóstico sorológico:

Amostras de soro pareadas

0 30 60 90 Dias

Anticorpos Anticorpos IgG

Nível de

Anticorpos

IgM IgG

D o e n ç a

Anticorpos

1a

2a

3a

4a

Efeito da vacinação e doses de reforço

nos níveis de anticorpos

A presença de anticorpos indica:

- contato prévio com o

agente !

ou

- Vacinação !!!

Diagnóstico de viroses

► Quando os sinais clínicos já passaram

► Quando houve algum contato com o vírus

► Detecção de anticorpos: ► (usualmente no soro – raramente no líquido céfalo-raquidiano (LCR)

Soro-neutralização

Imunodifusão

Inibição da hemaglutinação (IH)

Hemaglutinação passiva

Imunoperoxidase para anticorpos

Imunofluorescência indireta

ELISAs (diversos)

Western blot

outros

2- na busca de anticorpos

Detecção de exposição ao vírus (sorologia= detecção de anticorpos)

► Soro/Vírus neutralização

Diluir o soro seriadamente: ex:

1/2 1/4 1/8 1/16……….1/512

Adicionar volume igual de vírus (100 DICC50) a cada tubo ( ou orifício da placa)

Incubar a 37oC

Colocar mistura sobre células

Última diluição que evita multiplicação viral é o título

Sem soro 1/2 1/4 1/256 1/512 1/128

--

IMUNODIFUSÃO - Influenza

Antígeno Soro c/anticorpos ou s/anticorpos

Antígenos

Soro c/anticorpos anti- H3N2 (reação cruzada parcial

Identidade

+

IMUNODIFUSÃO

Soros em teste

Identidade

?

Ag

+

+

+

?

?

Soro controle +

Sem identidade

Hemaglutinação (HA)

com vírus hemácias

aglutinam

e aderem

às paredes

Sem vírus Hemácias livres

sedimentam

no orifício

côncavo

Inibição da Hemaglutinação (HI)

Inibição

da HA

(ou IH) Anticorpos

Hemácias

vírus

Resultado positivo PRESENÇA DE ANTICORPOS

INIBIDORES DA HEMAGLUTINAÇÃO (HA)

Resultado negativo AUSÊNCIA DE ANTICORPOS

INIBIDORES DA HEMAGLUTINAÇÃO (HA)

INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO (HI)

Inibição da Hemaglutinação (HI)

Diluições do soro

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

1/640

1/1280

Controle de

Vírus (sem soro)

8 semanas 1 semana

Controle

de Vírus

HA

Anticorpos HI em animal vacinado

Negativo Positivo

Diluente

Látex com Ag adsorvido

AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX

POSITIVO

soro +

NEGATIVO

soro -

Soro com Acs

ELISA INDIRETO (para anticorpos)

Soro a ser testado

para anticorpos

Antígeno aderido à placa

Anticorpo

Detector

Enzima => cor

ELISA de bloqueio (para anticorpos)

Soro suspeito

+? -?

Células infectadas com vírus

Substrato solúvel

sem cor

Microscópio

Anticorpo

Detector

Enzima

onde ligar ?

?

Substrato

•Reações Falso positivas

Artrite reumatóide

Anti- HLA

•Não detecta baixos títulos de anticorpos

•Somente detecta IgG

Lisado de Virus

Ag celular

Ac paciente

Ac anti IgG humana

Marcado com Enzima

E

ELISA Indireto para anticorpos anti-HIV

1ª GERAÇÃO

Suporte sólido

Cor

Suporte Solido

E HIV-2

E

Substrato

Proteinas

recombinantes

Peptidos sinteticos

Ac paciente

Ag viral

Ac conjugado

HIV-2 env

HIV-1 env

HIV-1gag

HIV-O

ELISA 4ª GERAÇÃO

•Muito boa especificidade

•Detecta baixos títulos de anticorpos

•Boa sensibilidade para Ac. anti HIV-2 e Ac anti-grupo M e O de HIV-1

•Detecta IgG e IgM

•Detecta antígenos virais também (HIV-1 y HIV-2)

HIV-2

Western blot (para a detecção de anticorpos)

Western Blot

Critérios:

WB Positivo: p24,gp41,gp120/160 (pelo menos 2 bandas)

WB Negativo: Ausencia total de bandas

Testes imunocromatográficos – ex.: teste oral HIV

Limitações da sorologia

►Detecta exposição (ou vacinação), mas não

quando ela ocorreu !!!

►Para correlação com a doença:

Soros pareados

IgM

Líquido céfalo raquidiano

Fim deste bloco Disponível em: labvir

Infecções Persistentes

- após infecções “in útero”

- vírus não é reconhecido como “estranho”

- hospedeiro dissemina vírus

- hospedeiro pode não desenvolver anticorpos

O QUE É INFECÇÃO LATENTE ?

- ocorre nas infecções por herpesvírus

- vírus aloja-se no gânglio nervoso ou células

do sistema imune

- sem lesões aparentes

- periodicamente reativado

- periodicamente dissemina

vírus ao meio ambiente