ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV.

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

Dr. Kremmer Tibor

EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM

Budapest

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA

HYDROPHOBIC INTERACTIONCHROMATOGRAPHY

(HIC)

1971 Affinitási kromatográfiás tölteteknél spacer alkalmazásakor zavaró másodlagos kölcsönhatásokat figyelnek meg

1972  Shaltiel Hydrophobic Chromatography Spacer-ligandumként, agaróz hordozóra alkilaminokat alkalmaz

1973 Hjerten Hydrophobic Interaction Chromatography Porath Hydrophobic Salting-out Chromatography Kozmotróp sók adagolásával a fehérjék retenciója nő Hoftsee Hydrophobic Adsorption Chromatography A ligandum szénláncának növelése és sűrűségének csökkentése

növeli az eljárás felbontóképességét

1976 Morris HIC (Trends Biochem Sci.)

1980 - HPLC töltetek 5-10 m szemcseméret (analitikai)

20-40 m szemcseméret (preparatív), pórusméret növelése (300Å)

1986 Nem porózus töltetek (1-3 um)

1991 Perfúziós töltetek (200 és 300-500 nm pórus)

TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC)

spacer

ligandum

matrix

(domain)

protein

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC)

KÜLÖNBÖZŐ LIGANDUMOK HATÁSA A RETENCIÓRA

(Gooding et al. 1984)

OH-Propil → Propil → Benzil → i-Propil → Fenil → Pentil

a retenció növekedése

KÜLÖNBÖZŐ ANIONOK ÉS KATIONOK HATÁSA A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSRA

PO43- ~ SO4

2- ~ CH3COO- ~ Cl- ~ Br- ~ NO3- ~ CIO4

- ~ SCN-

növekvő besózó - csökkenő kisózó hatás

növekvő kaotrop - csökkenő kozmotrop hatás

NH4+ ~ Rb+ ~ K+ ~ Na+ ~ Cs+ ~ Li+ ~ Mg2+ ~ Ca2+ ~ Ba2+

Phenyl-Superose, Pharmacia, Uppsala

HUMÁN SZÉRUM

SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) ÉS

ALFA-1-ANTITRIPSZIN (AAT)

ELVÁLASZTÁSA ÉS TISZTÍTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ

KROMATOGRÁFIÁVAL

Fractogel EMD Propyl oszlop (10x1 cm, 20-40 m)

Eluens A – 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2 1,1 M NH4-szulfát

Eluens B - 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2

Lineáris gradiens elúció

Áramlási sebesség : 1 mL/perc

Detektálás : 278 nm

(Oláh, Kremmer, Boldizsár, J. Chromatogr. 2000)

(NH4)2SO4

1,5 M

(NH4)2SO4

M

REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL

HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA

FEHÉRJÉK OVALBUMINRA VONATKOZTATOTT RELATIV RETENCIÓK

PROTEIN RRT

Cytochrome C 0.59

Myoglobin 0.73

Ribonuclease A 0.76

Haemoglobin 0.91

Albumin (human) 0.94

Ovalbumin 1.00

Trypsinogen 1.02

Transferrin 1.07

Lysozyme 1.08

Albumin (bovine serum) 1.11

a-Chymotrypsinogen A 1.12

Pepsin 1.15

Trypsin inhibitor 1.23

Hydrophobic Interaction Chromatography of Proteins

Column A: Progel-TSK Butyl-NPR, 3.5cm x 4.6mm ID, 2.5μm particles Column B: Progel-TSK Phenyl-SPW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles Column C: ProgeI-TSK Ether-5PW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles

Samples: 1.  Myoglobin, 2. Ribonuclesae, 3. Lysozyme, 4. -Chymotrypsin, 5.  -Chymotrypsinogen

Mobile Phase: A - 0.1M phosphate buffer, pH 7.0 and 2.3 → 0M ammonium sulfate (12 min)B - C = 0,1M phosphate buffer, pH 7.0 and 1.8 → 0M ammonium sulfate (60 min)

Flow rate: 1mL/min; Temp.: 250 C; Detection: UV 280 nm

1 - Kis sókoncentrációk

- ionos kölcsönhatások - stabilizálás

2 - Nagy sókoncentrációk

- speciális kölcsönhatások, kozmotróp sópárok, pl. (NH4)2SO4

- stabilizálás, majd kicsapódás,

hidrofób kölcsönhatások

A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA

II. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA

HIC - TERVEZÉS

A HIDROFÓB KÜLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC)

ÖSSZEHASONLÍTÁSA

Mindkét technikában közös és jellemző:

- Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum.

- A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás.

- A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg.

- Mindkét technika alkalmas a fehérjék elválasztására.

A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS A FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) KÜLÖNBSÉGEI

- A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja.

- A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye.

- A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg.

- A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye.

- A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős,

- a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező

• A fehérjék fiziológiás körülmények (pH, ionerősség) között harmadlagos ill. negyedleges szerkezettel (folded) rendelkeznek.

• A fehérjék apoláros karakterű aminosav összetevői (Ala, Val, Leu, Tyr, Trp, Phe) a szerkezet belsejébe törekszenek, egy részük azonban a felületre kényszerül (hydrophobic patch). Ez kb. a felület 40%-át képezi, és fontos funkcionális szerepe van a fehérje biológiai aktivitásában.

• Frank és Evans (1945) feltételezték, hogy vizes oldatokban a víz molekulái un. "icebergs" formában fedik a hidrofób felületeket.

• Némethy és Sheraga (1962) szerint két hidrofób anyag vizes oldatban létrejövő kapcsolata során a víz jégszerű struktúrája mintegy feloldódik és dezorganizálódik (entrópia nő – az energia felszabadulás fedezi az asszociáció energiaigényét)

Vizes oldatokban ezek az erők stabilizálják a fehérjék natív szerkezetét. A fehérjék a vizes (fiziológiás) közegben általában jól oldódnak (stabilak) és nem törekszenek hidrofób kapcsolatokra.

A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA

I. FEHÉRJÉK "VIZES" KÖZEGBEN

Melander és Horváth (1977) SZOLVOFÓB ELMÉLET- Az oldódás során az oldószer az oldandó anyagot befogadó üreget (cavity)

képez.- Az oldhatóság a határfelületi szabadenergia megváltozásának a függvénye, ami

az oldószer felületi feszültségétől függ.- Az oldat só koncentrációjának (m) növelésével az oldat felületi feszültsége

arányosan változik:

V = Vo + c . R . m R - a víz felületi feszültsége c - a só moláris felületi feszültség

inkrementuma - c korrelációba hozható a sók (anionok) liotróp sorával (Hofmeister l888). - Az elmélet a hidrofób kromatográfiás gyakorlat számára legegyszerűbb

formájában a retenció kifejezésére alkalmas össszefüggést (lnk - m) ad. A kapacitási faktor logaritmusa (lnk) a következő egyenlettel fejezhető ki :

ln k = ln kviz + S. m

az egyenes tengelymetszete (elvileg) a tiszta vízben mérhető kapacitási faktor logaritmusa. - A konkrét mérések az elmélet számos bizonytalanságára hívják fel a figyelmet.

A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA

III. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA

-  Egy egyensúlyi rendszerben lévő oldathoz adott komponens megváltoztatja a fennálló egyensúlyt.

-  Az új komponens nem egyforma mértékben lép kölcsönhatásba a már ott lévő komponensekkel (preferentíal interaction), ezt fejezi ki a preferential interaction paraméter (PIP).

-  Mérése a szabadentalpia vagyis a kémiai potenciál változásának mérésével lehetséges, ez arányos a felületi feszültség változással.

-  Megállapították, hogy a kisózószerek (kozmotróp sók) a fehérjék környezetében negatív PIP értékkel bírnak, vagyis kizáródnak a fehérjék közeléből. Ennek eredménye egy többlet hidratáció, amely a fehérje kémiai potenciálját megnöveli végezetül kicsapódáshoz vezet.

-  A só-fehérje kölcsönhatás két ellentétes hatás eredője:

1. kedvezőtlen felületi feszültség változás

2. kedvező só kötődés

A kisózó szerek esetében az első hatás a domináns (egyértékű kationok sói), a besózó szerek esetében a második kompenzálja az elsőt.

PREFERENTIAL INTERACTION ELMÉLETTimasheff (1959) Arakawa és Timasheff (1982)

A ligandum szerkezetének szerepe az albumin kötödésében a hidrofób kölcsönhatású kromatográfiában

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

AFFINITY CHROMATOGRAPHY

(AFF)

ALAPELV

Kovalens kötéssel (általában köztes láncon keresztül - spacer, leash, tentacle) hordozó szemcsékre (mátrix) rögzített

különböző funkcionális csoportok (ligandum), amelyek

Az elválasztandó (bio)molekulával specifikus és reverzibilis kölcsönhatásokat képeznek.

Mátrix:

- Poliszacharidok: agaróz                     (Sepharose, Superose)

cellulóz

- Organikus polimerek:

poliakrilamid

hidroxialkil metakrilát (Spheron)

etilénglikol metakrilát (Fractogel)

- kevert agaróz-poliakrilamid        (Ultrogel)

- Silica, "porózus üveg"                (SelectiSphere)

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

AFFINITÁSI KÖLCSÖNHATÁSOK (IMMOBILIZED LIGAND AFFINITY TECHNIOUES)

IMMUNOAFFINITY (immunosorption)

LECTINS (glycoproteins, oligo-polysaccharides)

HORMONES (receptors/carriers/antihormones)

PROTEINS (enzymes, immunoglobulins)

SUBSTRATES (cofactors, inhibitors, modulators)

NUCLEIC ACID binding ligands (oligo(dT)cellulose)

VÍRUS binding ligands

PHENYL BORONATE binding (cis-diols)

IMMOBILIZED METAL ION binding affinity

DYE-LIGAND binding affinity

- Cibacron Blue F3G-A

- Malachit Green (A/T specific)

- Phenol Red (G/C specific)

With N-linked sugars

Lectin-AAA

Lectin-DSA

Lectin-GNA

Lectin-MAA

Lectin-SNA

Lectin-PHA-L

Specificity for structures

L-Fuc(l-6)GIcNAcl

Galβ(l-4)GlcNAc-

Man (l-3)62 Man-

SA (2-3)Gal

SA (2-6)Gal

Poly-Gal-GlcNAc-

With O-linked sugars

Lectin-ACA

Lectin-PNA

Lectin-ConA

Lectin-RCA-120

Lectin-WGA

SA(2-3)Galβ(l-3)-GalNAc-Ser/Thr

Galβ(l-3) GalNAc-Ser/Thr

FOR AFFINITY INTERACTIONS WITH GLYCOPROTEINS

LECTINS

Product Specificity Applications Eluents

Protein A-Sepharose CL-4B

Fc region of IgG

IgG (many species), IgG subclasses and fragments immuno complexes,

antigens

1 M HAc, pH 3

0,1 M glycyltyrosine, pH 7

Con A-Sepharose-D-glucosyl,

-D-mannosyl residues

Glycoproteins, membrane proteins, glycolipids, polysaccharides

Free sugar (methyl- -D-glucoside); pulse or gradient (0-0.5 M).

Decreased pH (not below 3) Borate buffer (0.1 M, pH 6.5)

Lentil Lectin-Sepharose 4B

Similar to Con A (weaker affinity)

Membrane proteins, glycoproteins

Free sugar (methyl- -D-glucoside); pulse or gradient (0-0.1 M)

Wheat germ Lectin-Sepharose 6MB

N-acetyl-β-D-glucos-aminyl residues

Glycoproteins, polysaccharides, cells (esp. T-lymphocytes)

Free sugar (N-acetyl- β -D-glucos-amine);

pulse or gradient.

Helix pomatia Lectin-Sepharose 6MB

N-acetyl- -D galactos-aminyl residues

cells (esp. T-lymphocytes), glycoproteins

Free sugar (N-acetyl- -D-galactosamine)

Ready-to-use group specific adsorbents

AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

Sejtmembrán glikoprotein (Na-deoxikolát extraktum) tisztításaL. culinaris lectin-Sepharose 4B oszlopon

FESTÉK LIGANDUM AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIADYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY

FUNCTIONAL GROUP: CIBACRON BLUE F3G-A

AFFINITY PACKING MATERIALS:

(Capacities 10 mg albumin per ml gel)

~ Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia)

~ Affi-GelR Blue Gel           (Bio-Rad)

~ Fractogel TSK AF-Blue (Merck), TOYOPEARL AF Blue HC-650M

COLUMN: 6x0.5cmI.D. (Pharmacia 5/5)

CHROMATOGRAPHIC SYSTEM: FPLC (Pharmacia) with LCC-500 Programmer and UV-1 Monitor (278 nm)

ELUTION:

Equilibrated and eluted with 10 mM phosphate buffer

pH: 5.8 or 6.8

Step gradient elution with 10 mM phosphate buffer

pH:8.0 containing 2 M NaCl

FLOW RATE: 1 ml / min

SAMPLE: 500 μL ~ prepared by Sephadex G-25

Equivalent to 50 μL of original serum

DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS

DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS

COLUMN: Blue Sepharose CL-6B pH:5,8Human serum samples prepared by Sephadex G-25

FENIL BORONÁT AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN

PSEUDO-URIDINE DETERMINATIONPRINCIPLE

NUCLEOSIDES (PSEUDO-URIDINE) WITH VICINAL HYDROXYL GROUPS IN THEIR STRUCTURE CAN BE EXTRACTED SELECTIVELY BY AFFINITY CHROMA-TOGRAPHY FROM COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES AND SEPARATED BY REVERSED-PHASE HPLC.

SAMPLE PREPARATION

MICRO-PREPARATIVE BORONATE AFFINITY COLUMN (Affi-Gel 601, Bio-Rad Labs, 5x50 mm) WAS EQULIBRATED WITH 0.25M NH4-ACETATE (pH 8-8).

ONE ml URINE WAS MIXED WITH 0.3 ml 2.5M NH4-ACETATE (pH 9.5) AND

CENTRIFUGED. 500 μL SUPERNATANT WAS APPLIED ON THE AFFINITY

COLUMN AND WASHED WITH 2x4 ml 0.25M NH 4 - ACETATE (pH 8.8).

ELUTION WAS PERFORMED WITH 5 ml 0.1M FORMIC ACID. ELUATE WAS COLLECTED AND FREEZE-DRYED. THE RESIDUE WAS SOLVED IN 250 μL 10mM NH4~PHOSPHATE (pH 5) CONTAINING 2 % METHANOL.

HPLC ANALYSIS

HP 1084B LIQUID CHROMATOGRAPH ISOCRATIC ELUTION WITH 10mM PHOSPHATE BUFFER (pH 5.1) CONTAINING 2% (v/v) METHANOL.,

COLUMN: ODS-HYPERSIL (25x0.46 cm, 5u) TEMP: 35°C. FLOW: 1 ml/min.

DETECTION: 254 nm.