Escherichia coli O que vale para E. coli vale para elefantes Jacques Lucien Monod (1910 –1976)...

Escherichia coli

“O que vale para E. coli vale para elefantes”

Jacques Lucien Monod (1910 –1976)

Práticas microbiológicas

Escherichia coli

-Presente no intestino-Caracterizada em 1855 pelo Dr

Theodor Escherich– Cepa O157:H7 patogênica a

humanos– Cepa K-12 comensal– Auxilio nos estudos

pioneiros da biologia molecular• 100 mil publicações

(Lederberg, 2004)

Escherichia coli

• Unicelular na forma de bastão• Cresce rapidamente a 37oC

– ciclo de 20 min• Pouco exigente nutricionalmente• Meio mínimo ou rico

– Glicose - melhor fonte de C– Extrato de levedura - essenciais– Triptona e Peptona: fonte aminoácidos

Escherichia coli• Todas cepas derivam da K-12 • Denominação

– Nome do Laboratório e números representam sequencia de obtenção da cepa

– Cepas mais utilizadas (DH10, BL21, JM 109, HB 101, DH5a, XL blue,......)

• Nomenclatura para genes e marcas genéticas- 3 letras em itálico ou sublinhado indica locus

genético auxotrófico (his ou his -1)- Varias enzimas usa letras maiúsculas para

indicar locus (hisA, hisB)- O fenótipo é escrito em letra maiúscula His+ ou

His

Escherichia coli-DH10B

F- endA1 recA1 galE15 galK16 deoR nupG rpsL ΔlacX74 Φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ-

- BL21 (AI) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])

http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#BL21.28AI.29

4.609.221 pares de base

Mapa de marcas e genético

SequenciamentoConjugação e mutantes auxotroficos

Plasmídeo

• DNA extra cromossomial– São menores que o principal– Alto replicativos– tamanho de 1 a > 200 Kpb– Determinam característica com resistência a

antibióticos ou síntese de enzimas de restrição

• Deles derivam os vetores utilizados na biologia molecular– Clonar fragmentos

Tipos de plasmídeos

Vetores de clonagem

• Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb– pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET

• Insertos: genômico, transcrito reverso de mRNA (cDNA), subclonagem ou sintético

Vetores de clonagemPlasmídeo

• Características para uso:– origem de replicação– marcadores de seleção

• resistência a antibiótico (ampR, tetR, CamR, KanR, )• gene lacZ - amino terminal b-galactosidase

(complementa)– IPTG e X - Gal

– sítio múltiplo de clonagem (MCS)– tamanho (quanto menor melhor!)

• Manipulação após purificacão– larga escala– “mini-prep” ou lise alcalina

Clonagem

pBR3221o plasmídeo -1977Bolivar et al 1977

Plasmídeos naturais

pBR322 = R1 + R6.5 + pMB1

4363 pb

Seleção Transformação Placa Réplica

pUC81982

Vieira & Messing(pBR322 and M13mp8)

Plasmídeo pUC

• Mutanção no gene rop– Permite um maior numero de copias por celula

• Sistema lacZ’• Adicionar ao meio

– IPTG = isopropil thio galactose– X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d-

galactopiranosídeo (branco/azul)

Bactérias para Transformação

• Células não apresentam fator de conjugação

• Não apresentam DNA plasmidial

• Precisam ser preparadas– Tornar-se competentes

• Transformação– Quimiotransformação– Eletroporação

F-

Prática Microbiológicas

Condições

• Estéril– Ambiente de

manipulação– Regentes e meio de

cultivo– Vidraria– Práticas devem

manter o ambiente estéril

Fluxo Laminar

Cultivo e conservação

• Meio cultivo– Indefinido– definido

• Consevação de microrganismos – Meses – placa de petri a 4oC, tubo inclinado.– 1ano – “stab”– 4 ano –

•glicerol 15-20% a -70 oC•DMSO entre 7-8% a -70 oC

Inoculação

• Inoculação– Estoque ou de um

cultivo

Isolamento

• Colônia isolada– formada a partir de

1 UFC (unidade formadora de colônia)

– Estoque ou de um cultivo

– Certificar da pureza do isolado

Curva de Crescimento

• Trabalhar com DNA recombinante priorizar fase exponencial (107 UCF, 109 UCFdificulta aeração)

• Inoculo inicial, colônia isolada, pré-cultivo (109), diluir de 10 ou 100 vezes, avaliar curva de crescimento por algumas horas

Curva de Crescimento

Pratica Microbiológicas-Contagem

– Diluição Serial• 1UCF entre 8-

16hs forma uma colônia visível ao olho nu

– Absorbância• 400-600 nm• 0,7 limite

Transferência horizontal de DNA