Histonas Canal de potasio Mioglobina · Proteínas Albúmina Transporte Canal de potasio Mioglobina...

Proteínas

TransporteAlbúmina

Canalde potasio Mioglobina

Movimiento

Miosina

Estructura

Colágeno

Histonas

Lisozima

PepsinaPolimerasade DNA

CatálisisRegulacióny

SeñalizaciónFactor detranscripción

Inmuno-gamma-globulina

Insulina

Enlaces de hidrógenoInteracciones de van der WaalsInteracciones electrostáticasInteracciones hidrofóbicas

Red de interacciones• intramoleculares• intermoleculares

++−=

dNVdPSdTdG

dNVdPTdSdH

dNPdVTdSdE

PVTSETSHNPTGGPVENPSHH

+−=−==+==

),,(),,(

( ) ( )

( ) ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛Δ+Δ=Δ

−Δ+Δ=ΔΔ−Δ=Δ

lnTTCTSS

TTCTHHSTHG

)()()(⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂Δ∂

−=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

∂Δ∂

=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

∂Δ∂

∑+−=−=

−=Δ

iiidNPdVTdSWdQddE

≥≥Δ

dSS aisladosistemaunen

1a Ley de la Termodinámica Balance energético

2a Ley de la Termodinámica Direccionalidad o viabilidad

∑−<<

dNPdVWdTdSQd

leirreversib

reversible

dSdSdS

imposibleleirreversib

reversible

entorno

sistemaenergía

0≥+= es dSdSdS

0=+= es dEdEdE

0≥−=+=TQddS

TQddSdS s

0≥− ss QdTdS

constanteVsi00 ≤=−≥− sssss dFTdSdEdETdS

constantePsi00 ≤=−≥− sssss dGTdSdHdHTdS

Supongamos que el sistemano es aislado, pero es cerrado

0,0,0,

≤≤≥

dGPTdFVTdSVE

constantesconstantesconstantes

STHGPVFTSHPVTSEG

sNPTGG

ΔΔΔ

Gibbdelibreenergía),,(

−=+=−=+−=

∑++−=++−−=i

iidNVdPSdTPdVVdPSdTTdSdEdG μ

BA 0BA 0,

→<↔=

favorableprocesoequilibrioconstantes

favorablenoproceso

dGdGPTdG

exergónicaaendergónic

exotérmicaaendotérmic

<Δ>Δ

Δ−Δ=Δ

ΔG ΔH -TΔS

( ) RSRTHRTGeq eeeK /// 000 ΔΔ−Δ− ==

ΔH cambio de energía almacenada en enlaces e interaccionesrefleja número, tipo y calidad de enlacesΔH < 0 ⇒ si T ↑, entonces Keq ↓ΔH > 0 ⇒ si T ↑, entonces Keq ↑

ΔS medida de desordenrefleja orden-desorden en enlaces, flexibilidad conformacional y solvatación

BA ↔

( )RTGPPT /expcte, ii Δ−∝⇒

iestados,...,1,0 Pni ⇒=

0ii =∑

G0ii GGG −=Δ

exp(-ΔGn/RT)ΔGnGnn

exp(-ΔGi/RT)ΔGiGii

exp(-ΔG/RT)ΔGGi

( ) ( )∑=

Δ−=Δ−

ii /exp/exp RTGQ

función de partición

Sistema ergódico ⇒ AA =

0iii APA promedio de colectividad

∫ ′′=+∞→

0)(1lim promedio temporal

En general, iAA ∀≠ ,i

A propiedad observable del sistema ⇒ ¿ medida de A ?

QRTG ln−=Δ

( ) ( )∑∑ Δ−=Δ−=i

ii RTGRTHQ /exp/expω

RTGP ii

/exp Δ−=

∂Δ∂

−=∂

∂=Δ

/ln 22

TQTQRS

∂Δ∂

−=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

∂∂

+=Δlnln

ΔSnΔHnΔGnn

ΔSiΔHiΔGii

ΔSΔHΔGi

RTGP ii

/exp Δ−=

QRTGNPNN i

Δ−==

( )∑ Δ−=i

i RTGQ /exp

( )RTGNN

ii /exp0

Δ−=

⎪⎪⎭

⎪⎪⎬

∑∑ ==i

Equilibrio Conformacional

( )RTGPPT /expcte, ii Δ−∝⇒

iestados,...,1,0 Pni ⇒=

0ii =∑

G0ii GGG −=Δ

],...)[],[,,,,(ii LDpHPTGG μΔ=Δ

][])([ 0ii DmGDG −Δ=Δ

⎟⎟

⎜⎜

++Δ=Δ

=∑ pHpKa

RTnGpHG,

101ln)(1j

( ))/ln()()()()( im,iP,im,iim,iP,im,ii TTCTSTTTCTHTG Δ+Δ−−Δ+Δ=Δ

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

+Δ=Δ][1][1

ln])([iB,

B,10ii LK

LKRTGLG

Estudio de estabilidad de proteínas

• Bioquímica y BiofísicaInteracciones intramolecularesPlegamiento de proteínas

• BiotecnologíaIngeniería de proteínasSensores moleculares

• BiomedicinaEnfermedades conformacionales

• FarmacologíaFormulación de fármacosControl de calidad

Conformación nativa ≡ conformación de mínima energíaestructurada, estable, funcional, activa

• temperatura moderada• ausencia de agentes denaturalizantes• pH moderado

Pérdida de la Conformación Nativa

• pH ácido• temperatura extrema• agentes desnaturalizantes• hidrólisis• mutaciones

En un contexto dado, la estructura primaria de unaproteína determina su estructura tridimensional, que corresponde a un mínimo energético

Cuantificación dela estabilidad

Energía requerida paradesestabilizar la estructuratridimensional molecular

Técnicas Experimentales:

• Espectroscopía (UV, F, CD, NMR, FTIR)• Calorimetría (DSC)

• Propiedad con diferentes valores para cada estado• Señal medida proporcional al avance del proceso de desplegamiento• Información global o local

Espectroscopía

20 40 60 80 1000

Temperatura (oC)

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

)T (oC)

100°C

Calorimetría Diferencial de Barrido

Medida de la capacidad calorífica de una disolución de macromolécula en función de la temperatura

Desplegamiento Cooperativo Reducción del númerode estados accesibles

Estados parcialmente plegados no son significativamente poblados

0 2 4 6 8 10

[Urea] (M)

20 40 60 80 1000

Temperatura (oC)

20 40 60 80 100

Temperatura (oC)

Estabilidad ΔG Energía de Gibbs de estabilizacióno desplegamientoDiferencia de energía de Gibbs entre el estado nativo y el estadodesplegado

−=Δ

⎩⎨⎧

↓↑Δ

⇒↑K

GdEstabilida

⎩⎨⎧

0Estable

UN ↔

NU GGG −=Δ

Equilibrio de desplegamiento o desnaturalización

No se obtiene información cinéticaNo se consideran procesos irreversibles

ΔG‡ΔG

UN ↔

Enlaces de hidrógenoInteracciones de van der WaalsInteracciones electrostáticasInteracciones hidrofóbicasEntalpía de solvataciónEntropía de solvataciónEntropía conformacional

ΔG = ΔH - TΔS

El papel del agua es extremadamente importante

Balance entre estado nativo y desplegado, tomando como referencia la interacción con el solvente

Desplegamiento de dos estados

⎪⎪

KΔGGU

exp(-ΔG/RT)ΔGGi

UN ↔

],...)[],[,,,,( LDpHPTGG μΔ=Δ

][])([ 0 DmGDG −Δ=Δ

⎟⎟

⎜⎜

++Δ=Δ

=∑ pHpKa

RTnGpHGUj,

101ln)(mj

( ))/ln()()()()( mPmmPm TTCTSTTTCTHTG Δ+Δ−−Δ+Δ=Δ

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

+Δ=Δ][1][1

ln])([UB,

Desnaturalización Térmica

( ))/ln()()()()( mPmmPm TTCTSTTTCTHTG Δ+Δ−−Δ+Δ=Δ

)()( mm TTHTH =Δ=Δ )()( mm TTSTS =Δ=Δ

PPP ⎟⎟

⎞⎜⎜⎝

⎛∂Δ∂

−=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛∂Δ∂

=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛∂Δ∂

KRTTG ln)( −=Δ

⎪⎪

⇒=Δ

ΔH(Tm) > 0 Ruptura de interacciones de van der WaalsRuptura de enlaces de hidrógenoSolvatación de grupos polares y apolares

ΔS(Tm) > 0 Libertad conformacionalSolvatación de grupos polares y apolares

ΔCP > 0 Solvatación de grupos polares y apolares

ΔCP = cte

ΔCP = a + bT + cT2

0 20 40 60 80 1000

Temperatura (oC)

UUNN APAPA +=

( )TbaA NNN +=

( )TbaPA UUUU +=

( ) ( )( ) ( )( )( ) RTTTCTSTTTCTH

RTTTCTSTTTCTH

eTbaeTbaA /)/ln()()()(

UU/)/ln()()()(

NNmPmmPm

mPmmPm

1 Δ+Δ−−Δ+Δ−

Δ+Δ−−Δ+Δ−

0 20 40 60 80 1000

Temperatura (oC)

ΔH(Tm) 101 ± 2 kcal/molTm 60.69 ± 0.04 °CΔCP 2.2 ± 0.7 kcal/K⋅mol

0 20 40 60 80 100

P N, P

Temperatura (oC)

40 60 80-2

l/K·m

Temperatura (oC)40 60 80

Temperatura (oC)

∫ Δ=ΔT

TmΔCP

ΔHcal

HPHPHPH

Δ+Δ=Δ

)()( mPm TTCTH −Δ+Δ

( ) P2

+=⎟⎟

⎞⎜⎜⎝

⎛∂Δ∂

40 60 80

Temperatura (oC)

∂∂

Δ−+=ln

( ))/ln()()()()(

TTCTSTTTCTHTG

Δ+Δ−−Δ+Δ=Δ

40 60 80

Temperatura (oC)

Tm 60.75 ± 0.03 °CΔH(Tm) 102 ± 0.3 kcal/molΔCP 2.51 ± 0.02 kcal/K⋅mol

-40 -20 0 20 40 60 80 100-10

ΔG (k

Temperatura (oC)

Δ−=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛∂Δ∂

Δ=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛

∂∂

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ΔΔ

−−Δ−Δ=Δ

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ΔΔ

−==Δ

mmSmax

)(exp1)(max

TCTHTCTHG

TCTHTTT

Δ⇒=Δ max0

Tmax ΔG

P ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂Δ∂

−=ΔT

30 40 50 60 70 80 90-20-15

Temperatura (oC)

l/K·m

0.00.2

0.40.6

0.81.0

ción PN PU

Enlaces de hidrógenoInteracciones de van der WaalsInteracciones electrostáticasInteracciones hidrofóbicas

0 20 40 60 80 100-20

ΔG (k

Temperatura (oC)

-250-200-150-100-50050100150200

, -TΔ

ΔH -TΔS

estabilizado entálpicamente

estabilizado entrópicamente

Estabilidad “marginal”Dificultad para cálculos predictivos

ΔG = ΔH - TΔSP

CTHTTTH

−=⇒=Δ

=⇒=Δ Δ

Posible justificación de una estabilidad no muy elevada:

Razones para una estabilidad no muy baja:

• Permitir cierta flexibilidad y dinámica relacionadascon la función molecular• Posibilitar la degradación mediante proteasas• Impedir cinética de plegamiento lenta con intermedios de plegamiento muy estables• Evitar la aparición de estructuras incorrectamenteplegadas estables (trampas cinéticas)

• Estados parcial- o totalmente desplegadossignificativamente poblados (inactivos y susceptiblesde degradación)

30 40 50 60 70 80 90

6 Subtype B Subtype A Subtype C Subtype G

Temperatura (oC)

m )()( TTSTG ΔΔ≈ΔΔ

)()()( WTm

MUTWTm TGTGTG Δ−Δ=ΔΔ

MUTP CC Δ≈Δ

Diferencias de estabilidad

Problema: ΔG= ΔG(T)

Utilizar una temperatura común

( )WTm

XGG −⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛∂Δ∂

−=Δ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛∂Δ∂

−≈ΔΔ

-40 -20 0 20 40 60 80 100-30

ΔG (k

Temperatura (°C)

Estabilidad a elevada y baja temperatura

¿ Qué proteína es más estable ?

ΔH(Tm) 180 kcal/molΔS (Tm) 0.54 kcal/(K⋅mol)ΔCP 5.0 kcal/(K⋅mol)

ΔH (Tm) 350 kcal/molΔS (Tm) 1.05 kcal/(K⋅mol)ΔCp 8.0 kcal/(K⋅mol).

40 60 80

Temperatura (oC)

Tm 60.75 ± 0.03 °CΔH(Tm) 102 ± 0.3 kcal/molΔCP 2.51 ± 0.02 kcal/K⋅mol

-40 -20 0 20 40 60 80 100-10

ΔG (k

Temperatura (oC)

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ΔΔ

−−Δ−Δ=Δ

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ΔΔ

−==Δ

mmSmax

)(exp1)(max

TCTHTCTHG

TCTHTTT

Tmax ΔG

P ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂Δ∂

−=ΔT

0)()( fm =Δ=Δ TGTG

f 22-3

TT −≈≈

-60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120-50

ΔG (k

Temperatura (oC)

Desnaturalización Fría

Para una proteína globular típica:

Tm ~ 50-70 °CΔH(Tm) ~ 80-120 kcal/molΔCP ~ 2-3 kcal/K·molΔG(25 °C) ~ 5-10 kcal/molTmaxΔG ~ 20-30 °CTf < 0 °C

Desplegamiento de tres estados

K1K2ΔG1+ΔG2

K2ΔG2

K1ΔG1

10exp(-ΔGi/RT)ΔGii

Q = 1 + K1 + K2 + K1K2

RTGP /exp ii

Δ−=

= (1 + K1) (1 + K2)

K1K2ΔG1+ΔG2

K1ΔG1

Q = 1 + K1 + K1K2

RTGP /exp ii

Δ−=

≠ (1 + K1) (1 + K2)

20 40 60 80 100

Temperatura (oC)

20 40 60 80 100

Temperatura (oC)

∫ Δ=ΔT

0 20 40 60 80 100

ΔG1ΔG2ΔG1+ΔG2

Temperatura (oC)

0.00.20.40.60.81.0

ción PN

PU P ∼ 0

Reducción del númerode estados accesibles

20 40 60 80 100

l/K·m

Temperatura (oC)

¿Transición de dos estados ?

20 40 60 80 100

Temperatura (oC)

∫ Δ=ΔT

Tests de dos estados

• Superposición de las curvas de desplegamiento obtenidas con diversas técnicas (espectroscopía)

• Valor del cociente (calorimetría)cal

Refolding

FluorescenciaCD (far UV)

Dos estados Tres estados

Genzor et al. Protein Science (1996) 5, 1376-1388 Irún et al. J. Mol. Biol. (2001) 306, 877-888

¡ Cuidado !

• Superposición de curvas obtenidas con distintas técnicas es condición necesaria pero no suficiente

• Espectroscopía nos informa de comportamiento global y/o local

• Transición de dos estados implica total cooperatividad (ausencia de otros estados parcialmente plegados)

• Errores y ruido en las medidas pueden enmascarar algunos detalles y fenómenos

CRTHΔ

>Δ<=Δ

∂∂

HHHHHH unidad cooperativa ≡ molécula (dos estados)

unidad cooperativa < molécula (estados intermedios)

unidad cooperativa > molécula (nativo está asociado)

van’t Hoff enthalpy

20 40 60 80 100

Temperatura (oC)

ΔHcal 144.3 kcal/molTm 63.5 ºC< ΔCP>max 10.2 kcal/K·mol

ΔHvH 63.4 kcal/molΔHvH/ΔHcal 0.44

0 20 40 60 80 100

ΔG1ΔG2ΔG1+ΔG2

Temperatura (oC)

0.00.20.40.60.81.0

ción PN PI

PU P ≠ 0

20 40 60 80 100

Temperatura (oC)

30 40 50 60 70 80 90

l/K·m

Temperatura (oC)

ΔHvH /ΔHcal 1ΔHvH/ΔHcal 0.5

Tm 60ºC 60ºCΔH(Tm) 200 kcal/mol 2 × 100 kcal/molΔCP 4 kcal/K·mol 2 × 2 kcal/K·mol

N Δ−=

∂∂

0 20 40 60 80 100-40

ΔG (k

Temperatura (oC)

0 20 40 60 80 100

Temperatura (oC)30 40 50 60 70 80 90

Temperatura (oC)

K1K2kΔG1+ΔG2+ΔgK2kΔG2+ΔgK1kΔG1+Δg10

exp(-ΔGi/RT)ΔGii

Q = 1 + kK1 + kK2 + kK1K2

RTGP /exp ii

Δ−=

Dos dominios interaccionantes

≠ (1 + kK1) (1 + kK2)

0 20 40 60 80 10005

101520253035404550

Temperatura (oC)

k Δg (kcal/mol)1 010-1 1.410-2 2.710-3 4.110-4 5.510-5 6.810-6 8.310-7 9.5

85.0vH ≈ΔΔ

0 20 40 60 80 100

Temperatura (oC)

k = 1 Δg = 0 independenciak ≠ 1 Δg ≠ 0 cooperatividad

0 20 40 60 80 10005

101520253035404550

Temperatura (oC)

0 20 40 60 80 1000.00

Temperatura (oC)

k Δg (kcal/mol)1 010-6 8.3

k = 10-6

0 20 40 60 80 100-30-25-20-15-10

10152025

ΔG1 ΔG2 ΔG1+ΔG2

ΔG1+Δg ΔG2+Δg ΔG1+ΔG2+Δg

ΔG (k

Temperatura (oC)

05101520253035404550

Reducción del númerode estados accesibles

Cooperatividad ⇒ No aditividad

Todd et al. J. Mol. Biol. (1998) 283, 475-88

Unión de Ligandosy

Estabilidad de Proteínas

UN ↔

ln][][

KRTGNUK

−=Δ

K0ΔG0

Q = 1 + K0

RTGP /exp ii

Δ−=

UN+↔

( )][1ln

][1][11

][][][

LKRTGG

++Δ=Δ

][11][][

][1][1

][][][

KPNLNP

K0ΔG0

Ka[L]ΔGbind

Q = 1 + Ka[L] + K0

RTGP /exp ii

Δ−=

0 20 40 60 80 100-12-8-4048

Temperatura (oC)

0.00.20.40.60.81.0 1:0

1:1 1:5 1:25 1:125

Ka 10-6 M-1

[L]T/[P]T

−RTln(1+Ka[L])

( ) ( )

( )][1ln

][1][1][][

][][][

LKRTGG

LKKLKNU

+−Δ=Δ

( )( )( )][11

][11][

LKKLKK

LKKKPNP

K0Ka[L]ΔG0+ΔGbind

K0ΔG0

Q = 1 + K0(1+Ka[L])

RTGP /exp ii

Δ−=

0 20 40 60 80 100

-12-8-4048

Temperatura (oC)

0.00.20.40.60.81.0

−RTln(1+Ka[L])

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

+Δ=Δ

][1][1

][][][][

NLNULUK

( )( )

( )][1][1][1

1][][][

][1][1][1

][][][

LKKLKLKK

LKKLKLK

KPNLNP

Ka,N Ka,U

−RTln(1+Ka,N[L])

−RTln(1+Ka,U[L])

20 40 60 80 100-20-15-10-505

ΔG (k

Temperatura (oC)

121620

Estabilización de proteínas

ΔΔH 2.5 kcal/molΔΔS 2.5 kcal/mol

m )()( TTSTG ΔΔ≈ΔΔ

Estabilización de proteínas

• Enlace disulfuro intramolecular• Interacción catión-π• Resíduo con mayor propensión helicoidal• Carga positiva en extremo C de α-hélice• Carga negativa en extremo N de α-hélice • Rellenado de cavidad intramolecular• Optimización de carga electrostática• Neutralización de enlaces de hidrógeno superficiales

ΔΔH, ΔΔS ⇒ ΔΔG > 0

Estudio de unión de ligandos

• Bioquímica y BiofísicaInteracciones intramolecularesPlegamiento de proteínas

• BiotecnologíaIngeniería de proteínasMotores moleculares

• BiomedicinaInhibidores y activadoresEnfermedades conformacionales

• FarmacologíaControl de calidad

ΔG = ΔH – TΔSconf-PR – TΔSconf-Inh – TΔSsolv

• Cómo interaccionan M y L entre sí?• Cómo interaccionan M y L con el disolvente?

Interacciones M-L• van der Waals• enlaces de H• de/protonación

Desolvatación

Ganancia de entropía debido a la desolvatación

Pérdida de entropía debido a una pérdida de grados de libertad

Tipos de interacciones:

M + L ↔ ML

M + nL ↔ MLn

mM ↔ Mm

mM + L ↔ MmL

Mm + L ↔ mML

Técnicas experimentales

Método 1

• Diálisis• Ultracentrifugación analítica

Método 2

• Espectroscopía• Calorimetría

Diálisis

][][][][][

][][][][

][][][

LLLLML

−=−=

=⇒==

⇒ concentraciones en equilibrio

Ultracentrifugación

molecular peso⇒= WβM0)( eCrC

Distribución de pesos molecularesen disolución ⇒ concentraciones en equilibrio

Espectroscopía

concentración de ligando

KB ≡ 1/KD 2

HTKB Δ

Calorimetría

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

[Ligand]T/[Macromolecule]T

KB ≡ 1/KD

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

MLLM ↔+

( )1][][ −−Δ= iii MLMLHVq

( ) ( )/RTGΔexp/RTHΔexpωPPT, iiii −=−∝⇒constant

iPn1,...,0,i ⇒= states

0ii =∑

G [ML]][MLRTlnGGGΔ i

0ii −=−=

exp(-ΔĜn/RT)ΔĜnĜnn

exp(-ΔĜi/RT)ΔĜiĜiI

10Ĝ00

exp(-ΔĜ/RT)ΔĜĜi

( ) ( )∑=

−=−

ii /RTGΔexpZ

Z/RTGΔexpP

partition function or binding polynomial

pH,...)(T,fSTΔHΔGΔ iiii =−=

Binding and Linkage: Functional Chemistry of Biological Macromolecules. J. Wyman and S. Gill. Ed. University Science Books

ergodic system → AA =

iiAPA ensemble average

∫ ′′=+∞→

0tt)dtA(

t1limA time average

A observable property of the system → measurement of A?

value observed

RTlnZΔG −=

( )∑ −=i

i /RTGΔexpZ

/RTGΔexpP ii

/TΔGT

TlnZRTΔH 22

∂∂

−=∂∂

TlnZTlnZRΔS

∂∂

−=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

∂∂

/RTGΔexpP ii

Z1NPNN

Z/RTGΔexpNPNN

( )∑ −=i

i /RTGΔexpZ

( )/RTGΔexpNN

i −=

⎪⎪⎭

⎪⎪⎬

∑∑∑ ===i

[M]][ML

ln([L]/1M)

[M][L]n

Number of ligand moleculesbound per macromolecule

nnlim LB[L]=

+∞→

[L] (M)

nnF LB

0nlim LB0[L]

0ln[L]nLB ≥

∂∂

Binding and Linkage: Functional Chemistry of Biological Macromolecules. J. Wyman and S. Gill. Ed. University Science Books

∑ ∏

∗∗∗

+++=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

−====

...[L]KK[L]K1[L]K

...[L]β[L]β1[L]βZ

ln[L]RTiΔGGΔ

/RTGΔexp[ML]

][ML[L]βββKKβ

][L][ML][MLK

/RTΔGexp[M][L]

][MLβ overall association constants

step-wise association constants

∑∑

[L]βi

]i[MLn

[L]β[M]

∑∑

=⎟⎠⎞

⎜⎝⎛∂∂

===⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

H[L]β

TlnZRTΔH

i[L]β

ln[L]lnZn

Measurement of thermodynamic binding parameters: ΔG, KA, ΔH, ΔS

• Direct measurement of equilibrium concentrations (method 1)

• Measurement of signal proportional to advance of reaction (method 2)

Fn[M][L]n

∝signal

STΔΔHΔGRTΔH

ΔGK[ML][M],[L],

∂→→

ligand concentration

STΔΔHΔGRTΔH

ΔGΔH,K

∂→→model

ln[L]lnZnLB ∂∂

TLBT [M]n[L][L] +=

TiiiTTLB [M]P][MLP[L]0[L][M]n[L] =→→→=−+

conservation or balance equation

∑∑

0iiiTT

]A[MLAP[M]A[M]

]A[MLVAPV[M]AV[M]

value observed

Note: The free species concentrations are unknown; we only manage total concentrations

∑∑==

iji,jT,jjT,jT, HΔ][MLVHΔPV[M]ΔHV[M]Q

⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−=

⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛ −−=

0ii1-jiji

0ii1-ji,ji,jT,1-jT,jT,j

ΔHVv1][ML][MLV

ΔHVv1PPV[M]

Vv1QQQ

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

0[L][M]n[L] jT,jT,jLBj =−+j

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−=

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −=

Vv11[L][L]

Vv1[M][M]

( )∑

∑∑

0i0iji0jT,

0i0ijT,ji,0jT,

0iiji,jT,jT,j

AA][MLAM][

AA[M]PA[M]

A][MLAP[M]A[M]A

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

[Ligand]T (μM)

0[L][M]n[L] jT,jT,jLBj =−+

jvVjv[L][L]

jvVV[M][M]

Vv11[L][L]

Vv1[M][M]

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−=

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −=

Ligand binding to a simple protein

A single binding site

Binding affinity ΔG Gibbs energy for complex formationGibbs energy difference between free and bound states

[M][L][ML]K

RTlnKΔG

⎩⎨⎧

↑↓

⇒↑KΔG

Affinity⎩⎨⎧

0ΔGBinding

MLLM ↔+

MML GGGΔ −=

ΔG − RTln[L]0ΔĜi

exp(−ΔĜi/RT)i

K[L]1K[L]n

K[L]1Z

MLLM ↔+

ΔHVv1[ML][ML]VQ 1-jjj ⎟

⎞⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−=

0[L][M]n[L] TTLB =−+

K[L]1K[L]nLB +

K[L]1Z +=

TT [M]K[L]1

K[L][ML][M]K[L]11[M]

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

nΔH,K,

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

0 30 60 90 120 150 180 210

time (min)

t (μc

[2'CMP]T/[RNase A]T

Bovine Pancreatic Ribonuclease A2’CMP

KA 2.9·106 M-1

ΔH -19.3 kcal/moln 1.02

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

0 30 60 90 120 150 180 210

time (min)

t (μc

[PPT]T/[STI]T

Soybean Trypsin InhibitorPancreatic Porcine Trypsin

KA 1.5·106 M-1

ΔH 8.4 kcal/moln 1.2

Ligand binding to a “complex” protein

Two binding sites

ΔG2 − 2RTln[L]

ΔG1 − RTln[L]

0ΔĜi

β1[L]

β2[L]2

1exp(−ΔĜi/RT)i

[L]β[L]β1[L]2β[L]βn

[L]β[L]β1Z

2ML2LM ↔+

⎟⎟⎠

⎞⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−+

⎜⎜⎝

⎛⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−=

21-j2j2

11-jjj

ΔHVv1][ML][ML

ΔHVv1[ML][ML]VQ

LB [L]β[L]β1[L]2β[L]βn

221 [L]β[L]β1Z ++=

[M][L]β[L]β1

[L]β][ML

[M][L]β[L]β1

[L]β[ML][M][L]β[L]β1

0 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

n,ΔH,βn,ΔH,β

1β4β

First, perform data analysis with model-free general formalism.Then, once the system is classified, then, apply site-specific models.

What if the binding sites are different, but they display cooperativity?

Extra-thermodynamic considerations (e.g. structural features) may help in deciding which model applies.

Identical and independent binding sites

Non-identical and independent binding sites,or negative cooperativity

Positive cooperativity

Homotropic Interaction Heterotropic Interaction

[M], [A], [MA], [MA2] [M], [A], [B], [MA], [MB], [MAB]

Binding Cooperativity in Proteins

log[L]n

log[L]nn

=∂∂

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−

Quantifying binding cooperativity

Hill coefficient

Binding capacity

• Measure of the ability for accepting or delivering large quantities of ligand for relatively small changes in ligand concentration

• Efficiency of biochemical signal transduction (response to changes in ligand concentration)

0 ≤ nHill < 1 negative cooperativitynHill = 1 independent binding1 < nHill ≤ n positive cooperativity

0 1 2 3 4 5

Molar Ratio

β1 5.5·104 M-1

ΔH1 -1.9 kcal/molβ2 4.2·109 M-2

ΔH2 9.9 kcal/mol

4β2/β12 5.4

nHill 1.40

cAMP Receptor Protein + cAMP

Gorshkova et al. (1995). Journal of Biological Chemistry 270 21679-21683

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

[ML i] /

0 1 2 3 4

Molar Ratio

β1 3.0·106 M-1

ΔH1 -10.1 kcal/molβ2 2.4·1012 M-2

ΔH2 -19.1 kcal/mol

4β2/β12 1.1

nHill 1.02

R. solanacearum Lectin + α-Methyl-Fucoside

Kostlanova et al. (2005). Journal of Biological Chemistry 280 27839-27849

0 1 2 3 4

Molar Ratio

β1 1.0·107 M-1

ΔH1 -9.5 kcal/molβ2 5.4·1013 M-2

ΔH2 -15.0 kcal/mol

4β2/β12 2.2

nHill 1.19

Human Transferrin + Fe3+

Lin et al. (1993). Biochemistry 32 9398-9406

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Molar Ratio

β1 3.3·104 M-1

ΔH1 -23.8 kcal/molβ2 2.6·109 M-2

ΔH2 -33.2 kcal/mol

4β2/β12 9.6

nHill 1.51

H. vulgaris Hemocyanin + Caffeine

Menze et al. (2001). Journal of Experimental Biology 204 1033-1038

0 1 2 3 4

Molar Ratio

β1 4.6·105 M-1

ΔH1 -9.5 kcal/molβ2 1.4·1010 M-2

ΔH2 -18.1 kcal/mol

4β2/β12 0.27

nHill 0.68

Cyanovirin + Manα1→2Man

Bewley et al. (2001). Journal of the American Chemical Society 123 3892-3902

0 1 2 3 4

Molar Ratio

β1 2.5·107 M-1

ΔH1 3.4 kcal/molβ2 3.3·1012 M-2

ΔH2 -2.5 kcal/mol

4β2/β12 0.022

nHill 0.26

O. nova d(T4G4T4G4) + Telomere Binding Protein α Subunit N-domain

Buczek and Horvath. (2006). Journal of Molecular Biology 359 1217-1234

0 1 2 3 4 5 6 7

Molar Ratio

β1 3.1·104 M-1

ΔH1 -21.9 kcal/molβ2 3.3·109 M-2

ΔH2 -45.3 kcal/mol

4β2/β12 14.1

nHill 1.56

E. carinatus Ecarpholin S + Suramin

Zhou et al. (2008). Biophysical Journal 95 3366-3380

Two nonidentical and independentbinding sites

ΔG1+ΔG2 − 2RTln[L]ΔG2 − RTln[L]ΔG1 − RTln[L]

0ΔĜi

K1[L]K2[L]

K1K2[L]2

1exp(−ΔĜi/RT)i

( ) ( )( )

( )( ) [L]K1

[L]K[L]K1

[L]K[L]KK[L]KK1

[L]K2K[L]KKn

[L]K1[L]K1[L]KK[L]KK1Z

++=+++=

2ML2LM ↔+

( )⎟⎟⎠

⎞+⎟

⎞⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−+

⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−+

⎜⎜⎝

⎛⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−=

211-jj

11-jjj

ΔHΔHVv1[LML][LML]

ΔHVv1[LM][LM]

ΔHVv1[ML][ML]VQ

( )( ) 2

LB [L]KK[L]KK1[L]K2K[L]KKn

( ) 22121 [L]KK[L]KK1Z +++=

( ) ( )

( ) ( ) T22121

T22121

[M][L]KK[L]KK1

[L]KK[LML][M][L]KK[L]KK1

[L]K[LM]

[M][L]KK[L]KK1

[L]K[ML][M][L]KK[L]KK1

0 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

n,ΔH,Kn,ΔH,K

Two identical and independent binding sites

2ΔG − 2RTln[L]ΔG − RTln[L]ΔG − RTln[L]

0ΔĜi

K[L]K[L]

K2[L]2

1exp(−ΔĜi/RT)i

K[L]12K[L]

[L]K2K[L]1[L]2K2K[L]n

K[L]1[L]K2K[L]1Z

2ML2LM ↔+

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0

⎟⎟⎠

⎞⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−+

⎜⎜⎝

⎛⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−=

H2ΔVv1][ML][ML

ΔHVv1[ML][ML]VQ

1-j2j2

LB [L]K2K[L]1[L]2K2K[L]n

22[L]K2K[L]1Z ++=

T22T22

[M][L]K2K[L]1

[L]K][ML

[M][L]K2K[L]1

2K[L][ML][M][L]K2K[L]1

nΔH,K,

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

Two identical and cooperative binding sites

2ΔG+Δg − 2RTln[L]ΔG − RTln[L]ΔG − RTln[L]

0ΔĜi

K[L]K[L]

αK2[L]2

1exp(−ΔĜi/RT)i

[L]Kα2K[L]1[L]K2α2K[L]n

[L]Kα2K[L]1Z

2ML2LM ↔+

( )( )

[L]K1[L]K

[L]K1[L]K1[L]Kα2K[L]1Z:1 α if

[L]K1[L]K

[L]K1[L]K1[L]Kα2K[L]1Z:1 α if

++=++=

++≠++=

αβ4β

nonidentical independent binding sites are equivalent toidentical binding sites with negative cooperativity

( )⎟⎟⎠

⎞+⎟

⎞⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−+

⎜⎜⎝

⎛⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −−=

ΔhH2ΔVv1][ML][ML

ΔHVv1[ML][ML]VQ

1-j2j2

LB [L]Kα2K[L]1[L]K2α2K[L]n

22[L]Kα2K[L]1Z ++=

T22T22

[M][L]Kα2K[L]1

[L]Kα][ML

[M][L]Kα2K[L]1

2K[L][ML][M][L]Kα2K[L]1

0 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

0 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0

Δhα,nΔH,K,

Equilibrio conformacional modulado por unión de ligando

]][[][][

][][][

( )][1ln

LKRTGG

++Δ=Δ

Unión de ligando modulada por equilibrio conformacional

][][][][

][][][

BALAALF

ALAALF

( )KRTGGK

++Δ=Δ+

Equilibrio de unión modulado por la unión de otro ligando

][][1][

][][][][

][][][

XKLKLK

MXMLMMLF

MLMMLF

( )][1ln

XKRTGG

++Δ=Δ

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0

[L] (μM)

1E-3 0.01 0.1 1 10

ln([L]/1μM)

KL = 107 M-1

KX = 105 M-1

[X] = 10-4 M

Isothermal Titration Calorimetry&

Differential Scanning Calorimetry

Adrián Velázquez Campoy

Every biological process can be decomposed in a sequence of sequential and/or simultaneous elemental processes

Binding Equilibrium

Conformational Equilibrium

Peq CSHKG ΔΔΔΔ ,,,,

⎩⎨⎧<>

−=Δfavorable0

eunfavorabl0EnergyGibbs AB GGG

Gibbs energyEquilibrium constantEnthalpyEntropyHeat Capacity

eqKRTG ln−=Δ

STHG Δ−Δ=Δ

HC ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛∂Δ∂

Peq CSHKG ΔΔΔΔ ,,,,

STC ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛∂Δ∂

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛Δ+Δ−−Δ+Δ=Δ

0000 ln)()()()(

TTCTSTTTCTHTG PP

⎩⎨⎧<>

−=Δfavorable0

eunfavorabl0EnergyGibbs AB GGG

environmental variablesT, pH, ionic strength, solutes

information about the inter- and intramolecular interactions involved in the process

Two calorimetric techniques can be used to perform an exhaustive thermodynamic characterization of binding and conformational equilibrium processes:ITC Determination of Enthalpy, Affinity, Entropy and

of Binding.

DSC Characterization of Thermodynamic Stability.

ΔH, Ka, n, ΔG, ΔS, ΔCP

ΔH, Tm, ΔCP, ΔS, ΔG, K

MLLM ↔+

UnfoldedNative ↔

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

Temperature (oC)

Isothermal Titration Calorimetry

ΔTR ΔT=TS-TR

dQ/dt 0 100 200 300

t (μc

time (s)

adiabatic chamber

Peltierelement

The measured signal is the amount of heat per time unit, dQ/dt, that must be provided or removed in order to keep ΔT null.

Reference and

Sample cells

ΔT=TS-TR

0 100 200 300

t (μc

time (s)

ΔT=TS-TR

0 100 200 300

t (μc

time (s)

ΔT=TS-TR

0 100 200 300

t (μc

time (s)

ΔT=TS-TR

0 100 200 300

t (μc

time (s)

ΔT=TS-TR

0 100 200 300

t (μc

time (s)

ΔT=TS-TR

0 100 200 300

t (μc

time (s)

ΔTR Total heat released or absorbed during the thermal event

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

MLLM ↔+

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

MLLM ↔+

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

MLLM ↔+

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

MLLM ↔+

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

MLLM ↔+

3.00 30 60 90 120

t (μc

time (min)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Ka ≡ 1/Kd

MLLM ↔+

ITC: Advantages

Complete thermodynamic charaterization: ΔH, Ka, n, ΔG and ΔS

Direct determination of the binding enthalpy (with no additionalassumptions)

Heat is a universal signal

Absence of reporter labels

Non-destructive technique

10 20 30 40

ΔH (k

T (oC)

HC ⎟⎠⎞

⎜⎝⎛∂Δ∂

)()()( 00 TTCTHTH P −Δ+Δ=Δ

Determination of the Binding Heat Capacity

-2 0 2 4 6 8 10

ΔH (k

ΔHbufferionization (kcal/mol)

bufferionization

0 HnHHHΔ+Δ=Δ +

Determination of Proton Transfer Processes Coupled to Ligand Binding

ΔHbuffer,ionization

ΔH0 binding enthalpy independent of the buffer

nH+ number of protons exchanged between M-L complex and solution

macromolecule

ligand

protonbuffer

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

time (min)

t (μc

time (min)

7.0][10

== −

70][10

== −

7000][10

== −

ITC: Considerations

riment)hours/expe 2( techniqueanalyticfast mg)1(~sampleofamount

01010 1814

<••

≠Δ•≤≤• −−

HMKM a

Displacement Experiment

Scheme

0 20 40 60 80 100

Tight-Binding InhibitorWeak-Binding Inhibitor

Tight-Binding Inhibitor displacing the Weak-

Binding Inhibitor

aK ][1][0

XKXKHHH X

+Δ−Δ=Δ

XKKK X

Extension of the Practical Limits for Reliable Affinity Determination

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Time (min)dQ

/dt (μc

[Inhibitor]T/[HIV-1 PR WT]T

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0.0 0.5 1.0 1.5

Protease Protease + Ac-PepstatinProtease

KNI-764 KNI-764Ac-Pepstatin

XKKK X

aa +=X

Measuring High Binding Affinity

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

T (oC)

ΔT=TS-TR

T0↑ ΔTS

The measured signal is the amount of heat per time unit, dQ/dt, that must be provided or in order to keep ΔT null.Later, thermal power is converted to heat capacity.

adiabatic chamber

Peltierelement

Reference and

Sample cells

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

T (oC)

ΔT=TS-TR

T0↑ ΔTS

100°C

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

T (oC)

ΔT=TS-TR

T0↑ ΔTS

100°C

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

T (oC)

ΔT=TS-TR

T0↑ ΔTS

100°C

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

T (oC)

ΔT=TS-TR

T0↑ ΔTS

100°C

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

T (oC)

ΔT=TS-TR

T0↑ ΔTS

100°C

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

T (oC)

ΔT=TS-TR

T0↑ ΔTS

100°C

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

T (oC)

ΔH(Tm)

UnfoldedNative ↔

30 40 50 60 70 80 90

cess (c

T (oC)

UnfoldedNative ↔Differential Scanning Calorimetry

∫ >Δ<=Δ f

T excessPm dTCTH )(

∫>Δ<

TexcessP

CTS )(

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛Δ+Δ−−Δ+Δ=Δ

mPmmPm T

TCTSTTTCTHTG ln)()()()(

0 20 40 60 80 100-12.0

ΔG (k

T (oC)

0 20 40 60 80 100

T (oC)

UnfoldedteIntermediaNative ↔↔

Unfolded2Native2 ↔

40 60 80

cess (c

T (oC)0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

T m (o C

)[Macromolecule]T,monomer (mM)

20 40 60 80 100

cess (c

T (oC)0 5 10 15 20

T m (o C

( )][1ln0 LKRTGG a++Δ=Δ

Determination of Binding Affinity:Effect of Ligand Binding on the Stability

of the Macromolecule

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