Imagerie de la paroi - Station Biologique de...

Imagerie de la paroiimmunohistochimie des polysaccharides

de paroi chez les végétaux

Atelier GlycoOuest, Interactions sucres-protéines14-18 Avril 2014, Roscoff

Cécile HervéUMR8227, Roscoff

I. Sondes moléculaires pour la détection des polysaccharides de paroi

• production et caractérisation d’anticorps monoclonaux• utilisation de modules naturels de reconnaissance

(carbohydrate-binding modules, CBM)

II. Utilisation des sondes de paroi en immunohistochimie et microscopie

• principes de l’immunohistochimie

• préparation du matériel végétal

• immunofluorescence indirecte

• microscopie électronique

• observation, interprétation et mise en forme

TP. Imagerie de la paroi par immunofluorescence

Anticorps monoclonaux et CBMs

Interface

Intégrité

Différenciation

Expansion

Signalisation

Adhérence

Morphogenèse

Pourquoi la paroi ?• entoure chaque cellule végétale (algues & plantes)

• rôles dans de nombreuses réponses physiologiques

(compartiment dynamique)

Type cellulaire & diversité pariétale(plasticité spatiale/temporelle)

• les parois végétales sont des structures compactes

composées d’assortiments de polysaccharides complexes

Réseau squelettique cristallin(cellulose-hémicelluloses)

Somerville et al. (2004) Science 306, 2206

dictoylédones

• les parois végétales sont des structures compactes

composées d’assortiments de polysaccharides complexes

Réseau squelettique cristallin(cellulose-hémicelluloses)

+ polysaccharides matriciels(pectines)

Somerville et al. (2004) Science 306, 2206

dictoylédones

• les parois végétales sont des structures compactes

composées d’assortiments de polysaccharides complexes

Réseau squelettique cristallin(cellulose-hémicelluloses)

+ polysaccharides matriciels(alginates/fucanes)

algues brunes

Deniaud-Bouët et al. (2014) Annals of Botany, in press

• La plupart des connaissances dérivent de méthodes

biochimiques, utilisant des polysaccharides purifiés ou des

parois fractionnées sur plantes entières:

� perte de l’information spatiale et de développement� connaissance limitée des configurations in situ

• Quels sont les polymères présents ? En quelles quantités

relatives ? Comment sont-ils organisés les uns par rapport

aux autres ? Quelles variations physiologiques ? –

architectures pariétales & dynamiques

Pourquoi des anticorps ?

� sondes moléculaires pour des analyses in situ

chaîne

légère

région variable

région constante

chaîne

lourde

antigène

épitopes

antisérum

Qu’est-ce qu’un anticorps ?

Sérum d’anticorps polyclonaux

• Facile à obtenir –à partir d’un échantillon sanguin

• Si l’antigène est pur, possible d’obtenir un volume

suffisant d’antisérum à titre élevé et à forte affinité

• Contient des anticorps dirigés contre toute une

série d’épitopes

• Pas 2 animaux identiques

• Quantités limitées

Immunogènes

• Les protéines sont directement immunogènes

• Les glycanes donnent une faible réponse immunitaire

• Les oligosaccharides sont conjugués à une protéine (BSA, KLH) avant injection

chaque lymphocyte secrète un type

d’anticorps, à spécificité unique

cellule 1

cellule 2

cellule 3

Anticorps monoclonaux

• Technologie de l’hybridome

• Les lignées cellulaires secrétant les anticorps de spécificités appropriées sont immortalisées� rate � source de lymphocytes

généralement rongeurs (rats, souris)

� myélome � lignées cellulaires immortelles

• Quantités illimitées• Spécificité définie

Schéma général de production

FUSION

criblage des puits donnant une réponse positive

sélection clonale des lignées

propagation des lignées sélectionnées

anticorps à spécificité unique (un épitope) dans le surnageant hybridomal

cellules Bculture cellulaire de

myélome

Sélection des hybridomes (1)

• les cellules myélomateuses sont immortelles mais

ne synthétisent leurs nucléotides que par la voie de

novo car elles sont HPRT- (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase, i.e. voie de sauvetage)

–génie génétique

• sélection sur milieu HAT (hypoxanthine,

aminopterine, thymidine) : l’aminoptérine bloque la

synthèse de novo, l’hypoxanthine et la thymidine

sont les substrats de la voie de sauvetage

Sélection des hybridomes (2)

• seules les cellules fusionnées pourront survivre : les lymphocytes apportent la HPRT et les cellules du

myélome la capacité à proliférer ���� hybridomes

• les cellules B non fusionnées et les cellules du

myélome (sur milieu HAT) sont éliminées

Anticorps monoclonaux

• Reconnait un épitope –correspond à une région du

polymère cible

• Connaissance a priori de la structure de l’épitope et

de l’antigène

• Difficile dans le cas de polymères où la

connaissance structurale est limitée (cf. algues)

• Une caractérisation après coup est possible, à

l’aide d’haptènes, d’enzymes, etc.

Centres de ressources

• BioSupplies Abs, Australia

• CCRC-Mx –Georgia, USA

• JIMx (1989-1994) –John Innes, UK

• LMx (1991-onwards) –Leeds, UK

• BAMx (in progress) –Leeds, UKBrown Algae http://www.plantcellwalls.net

http://www.plantprobes.net

http://www.biosupplies.com.au/

http://www.ccrc.uga.edu/

EX. d’anticorps monoclonaux• anti-pectines

JIM5 partially Me-esterified HG

JIM7 partially Me-esterified HG

PAM1 blockwise de-esterified HG

LM7 non-blockwise de-esterified HG

2F4 unesterieid, calcium cross-linked HG

LM8 xylogalacturonan

LM5 (1�4)-b-D-galactan

LM6 (1�5)-a-L-arabinan

LM13 (1�5)-a-L-arabinan

CCRC-M2 RGI

Sous-structure pectique (LM7)homogalacturonan partiellement Me-esterifié

Willats et al. (2001) J. Biol. Chem.; Clausen et al. (2003) Carbohdr. Res.

pea stem

LM11

LM10

LM11

LM10 LM11

• anti-xylanes

Caractérisation des anticorps (1)

• principe de l’ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

-dosage immuno-enzymatique

HRP

S P

HRP

fixation de

l’antigène

reconnaissance

par l’Ac

spécifique

liaison du

conjugué

révélation

lavages lavages lavages

100 %

0 %

concentration en anticorps

90 % du maximum

de fixation

fra

ctio

n l

iée

concentration en

anticorps à utiliser

100 %

0 %

concentration en haptène

50 %fra

ctio

n l

iée

IC50

100 %

0 %

inh

ibit

ion

de

la

fix

ati

on

de

l’a

nti

corp

s

1. déterminer la dilution

appropriée en anticorps

2. déterminer les haptènes

compétiteurs (ELISA compétitif)

Caractérisation des anticorps (2)

LM15, a rat monoclonal antibody directed to the XXXG oligosaccharide of xyloglucan –developed from a XXXG-BSA neoglycoprotein

(Marcus S., Verhertbruggen Y., Hervé C. et al. 2008, BMC Plant Biol 8: 60)

XXXG

forêt tropicale forêt de Laminaires

La dégradation de la biomasse végétale par les microorganismes

est une étape clé dans le recyclage de la matière carbonée

���� évolution de protéines reconnaissant les polysaccharides de paroi

Carbohydrate-binding modules (CBMs)

Glycosyl hydrolases microbiennes

• Structure modulaire :

� module catalytique

� module(s) de fixation des polysaccharides : CBMs –carbohydrate binding module

• module catalytique et CBM associé ont

généralement la même spécificité

• Cellulose et autres polysaccharides de paroi

• le CBM dirige l’enzyme à proximité de son substrat

et la maintien en contact prolongé avec celui-ci

domaine catalytique

séquence

de liaison

Carbohydrate Binding Module

(CBM)

Himmel et al., “Cellulase Animation”, NREL (2000).http://genomics.energy.gov/gallery/b2b/detail.np/detail-24.html

• classés en 68 familles suivant une base de similitude de séquence protéique

http://www.cazy.org

• cellulose, xylane, mannane, glucomannane, β-1,3-glucanes

(callose, laminarine), β-1,3-1,4-glucanes (MLG, lichenane),

xyloglucanes, galactanes, chitine, amidon, agar, etc.

• utilisation analogue aux anticorps

monoclonaux :� test immuno-enzymatique (ELISA, etc.)

� microscopie (localisation des ligands in

planta)

• les CBMs sont produits de façon recombinante,

avec une étiquette permettant leur (purification et)

immunodétection

Utilisation des CBMs en tant que sondes moléculaires

S P

CBM

HRP

ex. His-tag

• spécificité connue• quantité illimitée• immunisation

animale

• protéine recombinante

• reconnaissance différentielle in situ

• couverture polysaccharidique

Anticorps monoclonaux

CBMs

②Utilisation des sondes sur matériel végétal

particules d’or

• La détection des antigènes d’intérêt par l’utilisation

des sondes (anticorps/CBM) nécessite l’emploi d’un

système de révélation

• tests immuno-enzymatiques = enzymes telles que

peroxydase et phosphatase alcaline

• microscopie à fluorescence = fluorochromes tels

que FITC, Alexafluors

• microscopie électronique =

• Dans la majorité des cas un protocole

d’immunomarquage indirect est utilisé

Immunohistochimie indirecte• incubation avec un anticorps

primaire/CBM contre l’antigène

d’intérêt

• puis incubation avec un anticorps secondaire qui reconnait la région

constante de l’anticorps primaire

(étiquette dans le cas d’un CBM),

couplé au traceur

• Ce système est très versatile : combinaisons

multiples pour un même AcI + nombreux AcII

disponibles commercialement

• Des témoins doivent toujours être réalisés lors d’un

protocole d’immunomarquage

• Un CONTRÔLE NEGATIF peut inclure un anticorps

primaire qui ne reconnait pas le matériel d’étude

où, plus simplement, omettre l’anticorps primaire

• Un contrôle positif est un anticorps primaire qui

reconnait le matériel d’étude ; il peut être utile dans

la phase initiale d’immunohistochimie sur des

antigènes encore non étudiés

Préparation pour la microscopie

• fixation

• coupes

• immunomarquages

La littérature sur la préparation des échantillons pour

la microscopie (fixation/inclusion/coupes) est très

abondante. Le choix dépend du but recherché.

• Fixer = rester le plus proche possible de l’état vivant,

stabiliser l’ultrastructure et protéger des dommages

• aldéhydes fréquemment utilisés

• attention aux conditions physicochimiques, notamment équilibre osmotique

plante ~300 mOsm, algue marine ~1100 mOsm

• échantillons aussi petits que possibles <2x2x2 mm

• plusieurs types d’inclusion/coupes suivant la

résolution souhaitée (à la main, inclusion en

paraffine/résine LR-white, etc.) -plus elle est

importante, plus le temps de préparation sera long

Immunomarquage

• le matériel doit fermement adhérer à la lame : certains réactifs tels que la poly-L-lysine et le

Vectabond améliorent l’adhérence

• des immunomarquages en tubes eppendorf sont

également possibles (coupes à la main, graines, etc.)

• Le matériel végétal doit toujours resté hydraté

• l’immunomarquage peut être combiné à des

marquages chimiques (ex. anticorps couplé au FITC

+ calcofluor white pour la cellulose) –longueurs

d’onde d’émission différentes

Microscope à fluorescence

1. seule la lumière bleue ayant une longueur d’onde comprise entre 450 et 490 nm passe à travers le filtre

2. reflète la lumière en dessous de 510 nm et transmet celle au-dessus de 510 nm

3. ne laisse passer que les longueurs d’onde comprises entre 500 et 550 nm, dont le signal fluorescent vert

Asplenium aethiopicumred channel

Asplenium aethiopicumCalcofluor stain

Asplenium aethiopicumanti-1,5-arabinan

calcofluor (cellulose)

LM10 (xylane)

fibres phloémiennes

vaisseaux xylémiens

Les inclusions permettent de réaliser des coupes fines

ou semi-fines et offrent une résolution intéressante.

Néanmoins les coupes manuelles sont rapides et

peuvent permettre un premier criblage. Certains

échantillons peuvent même être utilisés entiers.

graine d’Arabidopsis embryon de Fucus

filaments d’Ectocarpus

poil absorbant

de carotte

Pour des analyses très fines au niveau cellulaire, la

microscopie électronique est requise.

Le principe d’immunomarquage est identique.

L’anticorps secondaire est couplé à des particules d’or

denses aux électrons.

Knox et al., 1990. Planta 181(4):512

espace

intercellulaire

cellule 1

cellule 2

cellule 3

paroi

JIM5/7 – reconnaissent des pectines (HG) ayant différents

degrés d’estérification

L’observation d’échantillons

prélevés à différents temps

permet de suivre la

localisation des polymères

au cours du développement

–lien fonctionnel?

0 24h

cellulose

M-alginate

fucanes sulfatés

Un échantillon soumis à des

conditions

environnementales

différentes peut présenter

des variations pariétales

–lien fonctionnel?

1 cm

1 cm

100 % edm

5 % edm

fucanes sulfatés

fucanes sulfatés

Distinguer autofluorescence & fluorescence !

• certains composés cellulaires peuvent émettre de la

fluorescence à des longueurs d’onde qui interfèrent

avec le fluorochrome

• le glutaraldéhyde intensifie cet artéfact

• ce problème est particulièrement marqué chez les algues brunes et rouges

• le choix préalable du fluorochrome et du mode de détection ne doit pas être négligé

filtre d’émission >515 nm

Chondrus

Ceramiale

filtre d’émission 500-550 nm

Ex. autofluorescence chez les algues rouges

Prudence sur l’interprétation !

• le signal observé est-il bien lié au fluorochrome ?

(témoin négatif pour contrôler l’autofluorescence)

• l’absence de détection ne signifie pas forcement absence d’épitopes

� antigène soluble

� expression transitoire liée au développement

� épitope non accessible/masqué par d’autres polymères

cp

x

LM15

_

+

PL

Xyloglucan detection

&

pectate lyasetreatment

cl ppcp xe ipMarcus S., Verhertbruggen Y., Hervé C. et al. 2008, BMC Plant Biol 8: 60

JIM5 – pectic HG LM15 – xyloglucan

C

C

is

pectate lyase/JIM5 pectate lyase/LM15

HG-masked xyloglucan

+ pectate lyase+

pfx

cl

JIM5 JIM5

CjCBM15 CjCBM15

pf

x

cl

pfx

cl pfx

cl

- pl

Hervé C., Rogowski A., Gilbert H.J. and Knox J.P 2009, The Plant Journal 58(3): 413-422

nu

mb

er

of

pix

els

fluorescence intensity

34%

Quantification de l’immunofluorescence

nu

mb

er

of

pix

els

fluorescence intensity

100%

Hervé C., Rogowski A., Gilbert H.J. and Knox J.P 2009, The Plant Journal 58(3): 413-422

+ enzyme + enzyme

Autres sondes/utilisations

• anticorps par phage display, autres protéines

recombinantes d’origine bactérienne (SusD),

évolution dirigée de modules d’intérêt (ex.

aptamères par SELEX), enzymes modifiées, etc.

• ces sondes moléculaires sont également des outils performants pour détecter des épitopes dans des mélanges complexes

� glycoarrays (CoMPP)

� Epitope Detection Chromatography (EDC)

Pour aller plus loin• protocoles : Hervé C., Marcus S.E. and Knox J.P. (2011) Monoclonal

antibodies, carbohydrate-binding modules, and the detection of

polysaccharides in plant cell walls. Methods Mol Biol, 715, 103-113.

• évolution et diversité des parois de plantes et macroalgues : Popper Z.A., Michel G., Hervé C., Domozych D.S., Willats W.G.T., Tuohy M.G., Kloareg B. and Stengel D.B. (2011) Evolution and diversity of plant

cell walls: from algae to flowering plants. Annual Review of Plant

Biology, 62, 567-590.

• les sondes pariétales (très exhaustif avec production, utilisation,

articles scientifiques) : sites de J. P. Knox avec

http://www.plantprobes.net et http://www.personal.leeds.ac.uk

Most of my talk’s content has been inspired by Paul’s lectures, so

thanks Paul ☺

• My email: cecile.herve@sb-roscoff.fr