Kromozom Bantlama Ve Fish

KROMOZOM BANTLAMA

TEKNİKLERİ ve FISH

İnsan kromozomlarındaki karyotipleme çalışmaları sırasında benzer

büyüklükteki ve benzer konumlu sentromere sahip kromozomların ayırt

edilebilmesini sağlamak amacı ile kromozomların uzun eksenleri boyunca farklı boyanmaları bantlama olarak isim

alır. Günümüzde farklı bantlama yöntemleri bulunmaktadır.

Q BANTLAMAFloresans boyalar

kullanılır ve böylece

kromozomlar üzerinde farklı bölgeler farklı

renkte boyanmış olur.

C BANTLAMAKromozom

preparatları ısı ile denatüre edilip

sonra giemsa ile boyanır böylece heterokromatin

bölgeleri boyanırken diğer bölgeler

boyanmaz.

NOR Bantlama (Nukleolar organizer bölgeler)

En sık kullanılan bantlama yöntemidir. Preparatlar bir proteaz olan tripsin ile muamele edilir. Ardından giemsa ile boyama yapılır.böylece A-T açısından

zengin olan bölgeler daha koyu boyanır. Bu bantlar kromozomlara özgüdür ve

kromozomların kesin tanısında kullanılır. Ayrıca bu bantlar sayesinde

translokasyon, inversiyon, delesyon gibi kromozomal hasarlar belirlenebilir.

Giemsa boyamanın ardından preperatların sıcak tuz solüsyonu

ile muamele edilerek G bantlamadaki bant profilinin tam tersi elde edilir. Yani burada A-T açısından zengin bölgeler açık

renk boyanırlar.

G BANTLAMA R BANTLAMA

FLOURESCENCE IN SITU

HYBRIDIZATION (FISH)

YÖNTEMİ

Çeşitli dokulardan alınan hücrelerin (kültüre almadan) DNA larını floresan işaretli problarla hibridize ederek,bu floresan işaretler sayesinde söz konusu DNA bölgesinin hücre içerisindeki durumunu görmemizi sağlayan bir yöntemdir.

Moleküler sito-genetikteki hızlı ilerlemeler, bantlama ve boyama tekniklerinin hızlı gelişimiyle sağlanmıştır.

Standart bantlama teknikleri yalnızca bir denemede bir hücre için tüm genomu sorgulamada yetersiz kalmaktayken,

Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH), genleri ve kromozomları boyamada fluoresan moleküllerin kullanıldığı bir yöntem olarak bantlama teknikleriyle birlikte iyi bir değerlendirme aracıdır.

Bu yöntem gen haritalanmasında ve kromozom aberasyonlarının tanımlanmasında kullanılır.

Kromozomların çalışılmasında kullanılan birçok teknik, aktif olarak bölünen hücreleri gerektirirken (metafaz kromozomları),

FISH aynı zamanda bölünmeyen hücrelere de uygulanabilir (interfaz nukleusu). Metafaz delesyonları belirlemede kullanılır Interfaz genelde kromozomların yeniden

düzenlenmesinin ve kromozom sayılarının belirlenmesinde kullanılır.

Preperatların hazırlanması Materyalin preperat üzerine sabitlenmesi Ön yıkama Prob ve hedef DNA nın denaturasyonu Hibridizasyon Yıkama Görüntüleme Mikroskobi

Fish yönteminde kullanılan probların işaretlenmesi önemli bir aşamadır. Bu işaretleme doğrudan floresan işaret taşıyan probun hedef DNA ile hibridizasyonu ile olabildiği gibi indirekt işaretleme ile yani floresan sinyal güçlendirilerekte yapılabilir. Genellikle indirekt yöntem tercih edilir.

İndirekt işaretlemede Biotin gibi moleküller önce prob DNA içerisine yerleştirilir sonra biotinle çok sıkı bağ yapan avidin gibi moleküller ortama konur avidin molekülleri ayrıca floresan madde taşırlar(Florescein izotiyosiyanat FITC=yeşil renk). Daha sonra ortama anti avidin antikorları konur, bu antikor hem probdaki avidin hemde ortamdaki avidinlere bağlanır böylece sinyal güçlenir.

Tekrarlayan bölge probları Lokusa özgü prob

Tüm kromozomu boyayan prob Banda özgü prob

• Lokusa özgü olan problar bir kromozomun belirli bölgeleriyle hibridizasyona girer. Bu tip problar ilgilenilen belirli bir genin hangi kromozom üzerinde yerleşmiş olduğunu belirlemede kullanılır.

• Alfoid veya sentromerik tekrarlı problar, kromozomların sentromerlerinde bulunan

tekrarlayan dizilerden elde edilir. Kromozomlar farklı renklerde boyanabildiği için, bu prob herhangi

bir bireyin doğru sayıda kromozoma sahip olup olmadığının belirlenmesinde kullanılır.

“Whole chromosome” probları, herbiri tüm bir kromozom boyunca farklı dizilerle hibridizasyona

girebilen küçük probların kolleksiyonudur. Bu şekildeki bir prob kitaplığı taranarak tüm bir kromozom spektral bir karyotip oluşturmak üzere boyanabilir. Bu

teknik kromozomal translokasyonların tanımlanmasında imakan sağlar.

FISH ile sitogenetik çalışmalara yardımcı olan ve iyi tanımlanmış uygulamalar geliştirilmiş olmasına rağmen, amaca uygun prob ve filtre seçimi doğru yapılmaz ise hatalı ve zaman alıcı denemeler ortaya çıkmaktadır.

Prosedür Metafaz kromozomları veya interfaz

nukleusu kullanılarak preparatların hazırlanması

Etanol içinde dehidrasyon DNA’yı 70oC’de denatüre etme Etiketli probun denatürasyonu

Hibridizasyon için 37oC’de, 4-16 saat inkübasyon

TANISAL AMAÇ:* Klinik sitogenetik

* Prenatal tanı (trizomi, monozomi, mozaizm, translokasyon, delesyon)

* İnterfaz sitogenetiği (mayoz, mitoz,.) * Mikrodelesyon sendromlarının tanısı * Dokuda enfeksyon ajanlarının tanısı

* Kanser genetiği * Dokuda mRNA düzeyinde onkogenlerin

değerlendirilmesi

ARAŞTIRMA AMACI: * Gen haritalaması * Tümör biyolojisi

* Viroloji * Gen expresyon analizi * Mayoz/mitoz analizleri

* Hücre tanımlaması

Di George Sendromu (22q11.2) Prader Willi Angelman (15q11-13) Williams Beuren Sendromu (7q11.23) Smith-Magenis Sendromu (7p11.2) Wolf Hirschhorn Sendromu (4p16.3) Miller-Dieker Sendromu (17p13.3) Cri-du-Chat Sendromu (5p15.2/5p15.3)

Di George: metafaz görünümü Di George: İnterfaz hücresinde

Prader Willi / D115Z1 / SNRP / PML loküs bölgeleri

Sayısal kromozom anomalileri (-7,+8, +12)

Partial kromozom yada gen delesyonları

Gen amplifikasyonları Translokasyonlar

CGH ile tüm hücre genomunu tarama

Trisomy 7

11q23 MLL gen bölgesi

Trizomi 11q23 (ALL)

Trisomy 11(ALL)

17p13.1 ( p53 )

17p11.1 - q11.1 (CEP 17)

p

q

P53 delesyonu

8p11.1 – q11.1 (CEP 8)

8q24.2 – q24.3 (c-myc)

p

q

t(9;22)(q34;q11.2) metafaz ve interfaz görüntüleri

t(9;22) (bcr/abl)

Monozomi 9, t(bcr;abl)

Monozomi 22

PML ve RARA lokusleri t(15q22;17q12-22.1)

t(15q22;17q12-22.1) şematik

t(15q22;17q11-12),(PML/RARA) metafaz ve interfaz görünümü

t(2;5)(p23;q35) - Anaplastik büyük hücre lenfoması t(8;14) - Burkitt's lenfoma (c-myc) t(9;22)(q34;q11) - Philadelphia kromozom, Kronik miyoljenik lösemi (KML), Akut lenfoblastik lösemi (ALL) t(11;14) - Kabuklu hücre lenfoması (Bcl-1) t(11;22)(q24;q11.2-12) - Ewing's sarkoma t(14;18)(q32;q21) - Foliküler lenfoma (Bcl-2) t(17;22) - Dermatofibrosarkomik protuberans t(15;17) - Akut promyelötik lösemi t(1;12)(q21;p13) - Akut miyelötik lösemi t(9;12)(p24;p13) - Kronik miyelötil lösemi (CML), Akut lenfoblastik lösemi (ALL) (TEL-JAK2) t(X;18)(p11.2;q11.2) - Eklem sarkoması t(1;11)(q42.1;q14.3)- Şizofreni

İnversyon 16 Şematik

İnversyon 16 probu ile FISH

Sitogenetik kültür sorunları İnterfaz nükleusunda çalışılabilir

Kantitatif ölçüm sağlar Tedavi sonrası izleme de ideal

Lösemilerde p190 ve 210 aynı anda bakılabilir, Kırılmanoktaları değişebilen translokasyonlarda

efektifdir Örn: t(9;22), t(15;17), 11q23, inv 16

Hızlı sonuç istendiğinde Klonal anomalilere sitogenetik yetersiz kalır Lökosit sayısı az olduğunda (<10.000) PCR

yapılamazsa Yapılan çalışmalar normal bireylerde de bu tip

translokasyonların olduğunu gösterdi.

Probun uygun olması ve doğru probun eldesi için nelere bakılması gerektiğinin

iyi bilinmesi

Hibridizasyon için birleşme sinyali

Nuklear organizasyonda beklenmedik varyasyonlar