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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA
Reduccin de Cromo (VI) en efluente de curtiembre por Pseudomonas
aeruginosa MBL-03 en condiciones de laboratorio
Br. OBED RICARDO LUJAN MEZA
Proyecto de tesis para obtener el ttulo de
Bilogo - Microbilogo
TRUJILLO-PER
2013
1
PROYECTO DE TESIS
I. GENERALIDADES
1. TITULO
Reduccin de Cromo (VI) en efluente de curtiembre por Pseudomonas aeruginosa MBL-03 en
condiciones de laboratorio
2. PERSONAL INVESTIGADOR
2.1. Autor: Obed Ricardo Lujan Meza
Ex-alumno de la Escuela Acadmico Profesional de Microbiologa y Parasitologa de la
Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo.
2.2. Asesor: Dr. Juan Guevara Gonzlez
Profesor Principal a D. E. del Departamento de Microbiologa y Parasitologa de la
Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo.
3. TIPO DE INVESTIGACION
3.1. De acuerdo al objetivo que persigue: Aplicada.
3.2. De acuerdo a la tcnica de contrastacin: Experimental.
4. RGIMEN DE INVESTIGACIN: Orientada
5. DEPARTAMENTO Y SECCIN AL QUE PERTENECE EL PROYECTO:
5.1. Departamento: Microbiologa y Parasitologa
5.2. Seccin: Microbiologa Aplicada
6. LOCALIDAD E INSTITUCIN DONDE SE EJECUTAR EL PROYECTO:
6.1. Localidad: Trujillo-La Libertad.
6.2. Institucin: Universidad Nacional de Trujillo.
2
7. CRONOGRAMA GENERAL DE ACTIVIDADES
N Actividades Responsables Ao 2013
Oct. Nov. Dic. Ene. Feb. Mar.
1 Recoleccin
de datos
Investigador
Asesor
2 Anlisis de
datos
Investigador
Asesor
3
Redaccin
de Informe
de Tesis
Investigador
Asesor
8. FECHA PROBABLE DE INICIO Y TRMINO:
8.1. Inicio: Octubre 2013
8.2. Trmino: Marzo 2013
9. HORAS SEMANALES DEDICADAS AL PROYECTO
10. RECURSOS NECESARIOS
10.1. Recursos Disponibles:
10.1.1. Personal:
Autores
Asesor
10.1.2. Local:
Laboratorio de Microbiologa Ambiental, Departamento Acadmico de
Microbiologa y Parasitologa, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad
Nacional de Trujillo.
RESPONSABLES HORAS
(SEMANALES)
Obed Lujan Meza 10 h
Juan Guevara Gonzlez (asesor) 3 h
3
10.1.3. Materiales y Equipos: Cantidad (unidades/gramos)
Balanza de un platillo OHAUS 01 u
Balanza Analtica Lmin 01 u
Estufa Alion 01 u
Horno 01 u
Autoclave 01 u
Cmara ultravioleta 01 u
Refrigeradora National 01 u
Probetas de 100 mL Simax 01 u
Probetas de 50 mL Simax 01 u
Pipetas de 0.1 mL Qualicolor 01u
Pipetas de 5 mL Qualicolor 02 u
Pipetas de 10 mL Qualicolor 02 u
Matraces de 100 mL Simax 02u
Matraces de 500 mL Simax 02 u
Balones de 150 mL Schott. Gen 01 u
Mecheros de vidrio 01 u
Gradilla 02 u
Esptula 01 u
Goteros 02 u
Pipetas Pasteur 02 u
Motores 6 v 06 u
Encendedor 03 u
Asas bacteriolgicas 01 u
Tubos de 16 x 180 mL 08 u
pH metro 01 u
Termmetro 100 C 01 u
Calculadora Cientfica 01 u
Tubos de ensayo 24 u
Frascos de vidrio boca ancha de 1L (biorreactores) 03u
Cultivo puro de Pseudomonas aeruginosa MBL 03
NaH2PO4. 2H2O 7.8 g
KH2PO4 6.8 g
4
MgSO4 0.2 g
Fe(CH3COO)3NH4 0.01 g
Ca(NO)34H2O 0.05 g
Placas Petri 24 u
10.2. Recursos No Disponibles:
Segn el Clasificador por Objeto de Gasto, en nuevos soles, aprobado por el Congreso de
la Repblica:
2.3 BIENES Y SERVICIOS
2.3.1 COMPRA DE BIENES
2.3.1 5 MATERIALES Y UTILES
2.3.1 5.1 DE OFICINA
2.3.1 5.1 2PAPELERIA EN GENERAL, UTILES Y MATERIALES DE
OFICINA
Material
(Caractersticas) Marca Presentacin Cantidad
Precio
Unitario
(S/.)
Precio
Total
(S/.)
Plumn marcador Artesco unidad 2 2.50 5.00
Papel bond A4 80 g Atlas Paquete 1000 1 15 15.00
Bolgrafos Pilot unidad 2 2.80 5.50
Etiquetas adhesivas Atlas unidad 2 2.00 4.00
Flder manila unidad 10 0.5 5.00
Tijera Artesco unidad 1 1.50 1.50
Cintasde embalaje Celux unidad 1 1.00 1.00
Cinta Masking Shurtape unidad 1 2.00 2.00
Hoja Adhesiva Alpha unidad 1 1.00 1.00
Subtotal (1) 40.00
5
2.3.1 5.3 ASEO, LIMPIEZA Y COCINA
2.3.1 5.3 1 ASEO, LIMPIEZA Y TOCADOR
Material
(Caractersticas) Marca Presentacin Cantidad
Precio
Unitario
(S/.)
Precio
Total
(S/.)
Detergente Ace 160 g. 1 1.40 1.40
Lavavajilla Ayudn 350 g. 1 2.50 2.50
Leja Clorox 500 mL 1 1.30 1.30
Toallas
absorbentes
Scotch-
Brite Unidad 3 2.00 6.00
Papel Toalla Elite Unidad 1 4.80 4.80
Algodn CKF 500 g 1 12.50 12.50
Esponja de lavado Scotch
Brite Unidad 2 1.00 2.00
Jabn de tocador Neko Unidad 1 1.80 1.80
Frasco de plstico Artesco 100 mL 1 1.00 1.00
Despensero Sumac Unidad 1 22.80 22.80
Guantes Rubbercare Caja 1 16.00 16.00
Mascarillas Careplus Caja 1 10.00 10.00
Agua destilada Dropaksa Litro 5 2.50 12.50
Alcohol 96% Jennfar Litro 1 6.00 6.00
Ron de Quemar - litro 2 3.00 6.00
Sub Total (2) 106.60
6
2.3.1 8.2 MATERIAL, INSUMOS, INSTRUMENTAL Y ACCESORIOS
MEDICOS, QUIRURGICOS, ODONTOLOGICOS Y DE LABORATORIO
2.3.1 8.2 1 MATERIAL, INSUMOS, INSTRUMENTAL Y ACCESORIOS
MEDICOS, QUIRURGICOS, ODONTOLOGICOS Y DELABORATORIO
Material
(Caractersticas) Marca Presentacin
Cantidad/
envase
Precio
Unitario
(S/.)
Precio
Total
(S/.)
Agar agar en polvo Dropaksa Frasco, plstico 100 g. 30.00 30.00
FeSO4.7H2O Merck Frasco, vidrio 100 g. 50.10 50.10
Peptona 1% Merck Frasco, plstico 20 g. 7.30 7.30
Extracto de carne
0.3% Merck Frasco, plstico 6 g. 5.70 5.70
Cocina elctrica - - 01 15.00 15.00
Pisetas Dropaksa Frasco, plstico 250 mL 10.00 20.00
Perxido de
hidrgeno Merck Frasco, plstico 30 mL 5.60 5.60
Sub Total (3) 133.7
2.3.2 CONTRATACION DE SERVICIOS
2.3.2 2.2 SERVICIOS DE TELEFONIA E INTERNET
2.3.2 7 SERVICIOS PROFESIONALES Y TECNICOS
Tipo de Servicio Unidad Cantidad Precio
Unitario
Precio Total
(S/.)
Fotocopias en negro pginas 300 0.05 15
Impresiones en negro y
color pginas 800 0.10 80
Empastado del informe
de tesis 240.00
7
Pago de anlisis de
muestras (LASACI) 27 20 480
Sub total (4) 815.00
Sub totales Precio (S/.)
Sub totales 1 40.0
Sub totales 2 106.60
Sub totales 3 133.7
Sub totales 4 815.0
TOTAL 1095.3
11. FINANCIAMIENTO
Autofinanciamiento
II. PLAN DE INVESTIGACION
1. REALIDAD PROBLEMATICA
En la actualidad el principal problema ambiental es la contaminacin, principalmente
ocasionada por las industrias; como la produccin de acero, minera, cemento y curtido de
pieles que vierten sus efluentes o residuos, conteniendo metales pesados, tales como Cu, Zn,
Ni, Cr y Pb. 1, 2, 3 12 En las zonas contaminadas por la actividad industrial, las concentraciones
de estas sustancias txicas a menudo exceden los niveles que se encuentran normalmente en
el suelo, medio acutico, los canales, y sedimento.4, 5 Tales metales pesados en aguas
superficiales ocasionan un problema muy grave, tanto para el medio ambiente como para los
sistemas biolgicos, ya que estos elementos no son biodegradables y se acumulan en los
tejidos vivos; ingresan al medio ambiente afectando la fertilidad de los suelos o contaminando
las aguas subterrneas y superficiales, dificultando su utilizacin para el consumo humano o
animal. 3, 6, 7.13
La acumulacin de metales txicos, por ejemplo, Cd, Cr, Cu, Hg y Zn, en los seres humanos
tiene varias consecuencias desfavorables, tales como anormalidades en el crecimiento y
desarrollo, carcinognesis, defectos en el control neuromuscular, retraso mental, mal
funcionamiento renal, bloqueando grupos funcionales de enzimas vitales y una amplia gama
de otras enfermedades.1, 8
8
Uno de los metales pesados que ms utilizado es el cromo ya que es utilizado en la metalrgica,
cromado, limpieza y procesamiento de metales, aleaciones, plantas de energa atmica,
conservacin de madera, fabricacin de pinturas y pigmentos, galvanoplastia e industrias de
curtiembre 5, 8, 9, 10, 14, 15 Esta sustancia ha sido identificado por el Medio Ambiente de EE.UU.
Agencia de Proteccin (EPA de los EE.UU., 1998) como uno de los 17 metales txicos que
presentan el mayor peligro en el medio ambiente.10 Ms de 170.000 toneladas anuales de
residuos de Cr se descargan al ambiente como consecuencia de las actividades industriales.
Del total de Cr utilizado en la industria del cuero, el 40% se retiene en el lodo; la eliminacin
en la tierra y los cuerpos de agua ha provocado un aumento en los niveles de cromo llegando
incluso a 30000 mg/Kg. 11
Los lmites mximo permisibles de cromo en el medio ambiente son: 0.4 mg/kg, para suelos
agrcolas y suelo residencial/parques; 1.4 mg/kg para Suelo Comercial/Industrial/
Extractivos; 0.05 mg/L para aguas superficiales destinadas a la produccin de agua potable,
agua para consumo humano y aguas superficiales destinadas para la recreacin. 32, 33, 34
El cromo existe en distintos estados de oxidacin, variando desde Cr II hasta Cr VI. En la
naturaleza las especies dominantes son el Cr VI y el Cr III.15, 18, 24 El Cr VI , en el ambiente,
est presente como cromato ( CrO42-) y dicromato (Cr2O7
2-) 4, 5, 6, 8, y es el estado con ms
elevada toxicidad ya que es mvil, se adsorbe fcilmente, es soluble en agua, y tiene un elevado
perodo de residencia en las aguas superficiales y subterrneas, lo que supone un riesgo para
la salud de los seres humanos y animales, afectando adems el desarrollo y crecimiento de las
plantas; adems est demostrado que es mutagnico, irritante, corrosivo y cancergeno 6 , 7, 9, 12,
16, 17, 19, 20 . Mientras que el Cromo III es menos soluble, por lo tanto, menos mvil, y mucho
menos txico que el Cr (VI); en el ambiente est presente formando complejos estables con
ligandos orgnicos o inorgnicos; estudios refieren que el cromo III es relativamente
inofensivo debido a su insolubilidad e incapacidad de atravesar las membranas celulares. 9, 12,
21 Adems el cromo III es un micronutriente esencial para los humanos, para el metabolismo
de la glucosa y grasas y el buen funcionamiento de la insulina. 5, 7, 8
La reduccin del Cr VI a Cr III es utilizado para desintoxicar aguas residuales contaminadas
con Cr.9 Tradicionalmente esto se logra mediante mtodo qumicos y biolgicos. 20. Los
mtodos qumicos implican el ajuste del pH, el uso de cidos y bases fuertes, sustancias
9
precipitantes, reductores qumicos tales como los sulfuros y sustancias frricas. 8, 12, 14 Estos
mtodos qumicos pueden ser bastante costosos, requieren de mucha energa o altas
cantidades de reactivos y pueden crear otras formas de desechos, adems, en concentraciones
muy bajas, estos mtodos son ineficientes. 5, 12, 14, 20, 22 Los mtodos biolgicos utilizan a
microorganismos para la reduccin de Cr VI; en recientes aos, la biorremediacin por
microorganismos est siendo considerada como una alternativa para la reduccin de Cr VI,
ya que se ha reconocido la capacidad de biosorcin, bioacumulacin y biorreduccin de Cr
VI por bacterias, hongos y alga; y estos mtodos son ms econmicos, ms eficientes, no
utilizan elevada energa y no son toxicos.5, 12, 22
Se han realizado diversos estudios, para reducir el Cr VI utilizando bacterias como:
Staphylococcus saprophyticus, Bacillus sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
mendocina, Escherichia coli, Desulfovibrio sp., Microbacterium sp., Shewanella oneidensis., Arthrobacter sp.,
Acidithiobacillus thiooxidans, Enterobacter 8, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 27, 29, 30 las levaduras Candida sp., Candida
maltosa, y los hongos filamentosos Penicillium sp., Trichoderma inhamatum y Aspergillus niger. 23, 26
La utilizacin de Pseudomonas sp 9, 12, 28, 31 en este proceso de biorremediacin est muy
generalizada, puede utilizarse en procesos aerbicos, tanto como anaerbicos 11, 16, 22, 27; la
capacidad biorremediativa que tiene este gnero de bacteria se debe a la presencia de genes
en su plasmido.27 Las enzima involucrada en este tipo de biorremediacin es la cromato
reductasa.27, 12
Debido a que a nivel local se han realizado pocos trabajos en relacin a este tema y conociendo
el potencial en el uso de microorganismos para tratar de eliminar sustancias toxicas del medio
ambiente; se hace necesario iniciar estudios en estos temas para, de esta manera, ayudar a
disminuir la cantidad de contaminantes en el medio ambiente, y as mejorar el desarrollo de
nuestra regin. En tal sentido se justifica la realizacin de esta investigacin que tiene por
objetivo evaluar la Reduccin de Cromo (VI) en efluente de curtiembre por Pseudomonas
aeruginosa MBL-03 en condiciones de laboratorio
2. PROBLEMA
Cul es el efecto de Pseudomonas aeruginosa MBL 03 sobre el Cromo VI proveniente del
efluente de una curtiembre del Distrito del Porvenir, en condiciones de laboratorio?
10
3. OBJETIVOS
Evaluar el crecimiento de P. aeruginosa MBL-03 en efluente de curtiembre conteniendo
cromo VI, en un sistema aireado y agitado.
Evaluar la reduccin del cromo VI por parte de P. aeruginosa MBL-03, en el laboratorio
de anlisis fsico-qumicos LASACI.
4. HIPOTESIS
Implcita
5. DISEO DE EXPERIENCIA
Diseo estmulo creciente
6. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO
6.1. MATERIAL
Muestra:
Cultivo de Pseudomonas aeruginosa MBL-03, del cepario del Laboratorio de
Microbiologa Ambiental de la Universidad Nacional de Trujillo.
Cuatro litros de efluente de curtiembre conteniendo Cr VI, del distrito Trujillo,
Provincia Trujillo, departamento la Libertad
6.2. PROCEDIMIENTO
6.2.1. Diseo y ensamblaje de Biorreactores
Se fabricara 5 biorreactores (tanque agitado y aireado) con frascos de vidrio de 1.7 L
de capacidad provistos de 4 deflectores de 1 x 11 cm, con motores de 6 V que sern
regulados a 3 V para su funcionamiento, y un agitador Rushton. Los biorreactores
sern conectados a un sistema de aireacin previamente purificado. 35
Todos los biorreactores sern esterilizados en cmara UV durante 2 horas.
6.2.2. Reactivacin del cultivo
Las bacterias de un cultivo stock de P. aeruginosa MBL-03 se sembrarn en 5 ml de
Caldo Nutritivo e incubados a 37 C por 18 horas.
11
6.2.3. Evaluacin de pureza del cultivo
El cultivo reactivado ser sembrado por superficie en agar nutritivo e incubado a
37C por 24 horas. Se observarn las caractersticas macromorfolgicas de las
colonias y las caractersticas micromorfolgicas mediante coloracin Gram. Luego
se sembrar en agar glutamato y en 10 mL caldo glutamato para observar si existe la
produccin de pioverdina y piocianina respectivamente.
6.2.4. Tratamiento del Efluente de Curtiembre
El efluente de curtiembre ser filtrado en papel filtro estril para retirar partculas
suspendidas. Luego el efluente pasar por una membrana filtrante de 0.44 um de
dimetro de poro para eliminar bacterioflora contaminante y asi evitar la interferencia
con la accin de P. aeruginosa MBL-03.
El efluente filtrado ser llevado al laboratorio de anlisis fsico-qumicos de la
Facultad de Ingeniera Qumica LASACI, para medir la cantidad exacta de Cromo
VI; y se har un recuento en placa para determinar la presencia o ausencia de
bacterias, incluyendo el gnero Pseudomonas.
6.2.5. Adaptacin del P. aeruginosa MBL-03
Al cultivo reactivado se le aadir volmenes de 25 ml del efluente tratado
conteniendo Cromo VI por cada 100 de volumen de suspensin bacteriana para
lograr su adaptacin permaneciendo as por 4 das a 37 C 36
6.2.6. Preparacin del Medio Mnimo de Sales
El medio mnimo de sales contendr: 15.6g Na2HPO4.2H2O; 13.6g KH2PO4; 0.4 g
MgSO4; 0.02 Fe(CH3COO)3NH4; 0.1 Ca(NO)34H2O. Disuelto en 2 litros de agua
destilada.
6.2.7. Preparacin del inculo de P. aeruginosa MBL-03
A partir de la etapa de adaptacin, se obtendr una concentracin final de 9x108
UFC/mL, para cada biorreactor se requerir un volumen de inoculo de 100 mL; Se
corroborara mediante recuento en placa por siembra en superficie, en agar nutritivo.
12
6.2.8. Inoculacin en los sistemas
En los cuatro biorreactores se colocar 700 mL que corresponden al total de afluentes
de curtiembre tratado a distintas diluciones: muestra sin diluir (T1), 1/2 (T2), 1/5
(T3) y 1/10 (T4), luego se les adicionara 100 mL de inoculo y 400 mL de medio
mnimo de sales., haciendo as un total de 1200 mL de volumen de trabajo,
conformndose asi los cuatro sistemas de tratamiento. Los sistemas se mantendrn
en agitacin y aireacin constante durante 9 das a 37 2 C.
Se tendr adems un testigo, donde los volmenes utilizados corresponden al sistema
de muestra sin diluir a excepcin del inoculo, que ser reemplazado con agua destilada
estril.
6.2.9. El efecto de P. aeruginosa se evaluar mediante la determinacin del
Crecimiento bacteriano y la concentracin residual de Cromo VI
6.2.9.1. Evaluacin del crecimiento
Se tomar 10 mL de cada biorreactor a tiempo cero y cada 3 das, durante 9
das; se centrifugara a 3500 rpm durante 15 minutos; se proceder a separar
el sobrenadante del sedimento, el sedimento se suspender en agua destilada
y se realizara diluciones al dcimo de cada contenido; para luego sembrar por
superficie para el recuento en placa, por duplicado; utilizando para ello las
dos ltimas diluciones.
6.2.9.2. Evaluacin de la concentracin residual de Cromo VI
El sobrenadante de cada muestra se le determinar la concentracin de
Cromo VI en el laboratorio LASACI a tiempo cero y cada 3 das durante 9
das.
Todo el procedimiento se har por triplicado.
6.2.10. Anlisis Estadstico
Los datos encontrados se analizarn por el mtodo estadstico ANAVA. Con el
propsito de determinar si existe diferencia significativa entre los valores: problema
- testigo del crecimiento y entre los valores: problema - testigo de la concentracin
residual de cromo VI.
13
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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