View
7
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Slide based cytometry– princip a pou!ití
O. Hovorka1, V. Budínsk"2
1Mikrobiologick" ústav AV #R, Víde$ská 1083, Praha 4
2Ústavu imunologie 2. Léka%ské fakulty FN v Motole, V Úvalu 84,150 06 Praha 5
1. Co to je skenovací / zobrazovací cytometrie
2. Princip
3. P!íklady a vyu"ítí
1. Co to je skenovací / zobrazovací cytometrie
2. Princip
3. P!íklady a vyu"ítí
Vazba lektinu WGA (FITC) na 3T3 my&í fibroblasty po 24h inkubaci s 2 typy polymerníchlé'iv (doxorubicin)
Jezierska A et all., Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule (ALCAM) is associated with suppression of breast cancer cells invasion.Med Sci Monit. 2006 Jul;12(7):BR245-56. Epub 2006 Jun 28.
Figure 5. Comparison of ALCAM, E-cadherin, #-catenin, andMMP-2 expression in tumors graded according to Elston and
Ellis criteria: noninvasive
(NG), grade 1 – well differentiated (G1), grade 2 – moderatelydifferentiated (G2), grade 3 – poorly differentiated) (G3). Proteinconcentrations in individual cells were measured by LSC andexpressed as a ratio of protein-related green fluorescence (GreenIntegral) to the nucleus area marked by DNA-related redfluorescence.
Fig. 3 Comparative analysis of DNA content of the two Giardia nuclei by laserscanning cytometry. To categorize nuclei, only events from R1 region are used.Nuclei that fall outside the scattergram dynamic range are excluded from furtheranalysis. Nuclei of R1 region are separated into six subpopulations (marked bydifferent colors) according to Ratio of Integral of Fluorescence to Average Pixelvalue.
Pavla T(mová et all., Cytogenetic evidence for diversity of two nuclei within a single diplomonad cell of Giardia. Chromosoma, 2007 Feb;116(1):65-78.Epub 2006 Nov 4.
1. Co to je skenovací / zobrazovací cytometrie
2. Princip
3. P!íklady a vyu"ítí
1. Kvantitativní záznam souboru obraz$
2. Anal%za obrazu a identifikace jednotliv%chudálostí
3. Kvantifikace fluorescence jednotliv%chudálostí
1. Kvantitativní záznam souboru obraz$
2. Anal%za obraz$ a identifikace jednotliv%chudálostí
3. Kvantifikace fluorescence jednotliv%chudálostí
Excitace lasery
Záznam signálu pomocí
fotonásobi&$
Excitace v%bojkou
Záznam signálu pomocí CCD
kamery
Segmentace získaného souboru obraz( vymezením úrovn) pozitivity vjednom z kanál(
Sestavení scatergram(, dotplot( a histogram( odpovídajícíchfluorescen'ním vlastnostem m)%eného vzorku
1. Kvantitativní záznam souboru obraz$
Excitace lasery
Záznam signálu pomocí
fotonásobi&$
Excitace v%bojkou
Záznam signálu pomocí CCD
kamery
Laserov% skenovací cytometrCompuCyte iCys
Zobrazovací cytometr
Olympus Scan^R
Laserov" skenovací cytometrCompuCyte iCys
LASERY
SKENOVACÍZA!ÍZENÍ
SKENOVACÍOPTIKA
OBJEKTIV
MOTORIZOVAN" STOLEK
DETEKTORROZPTYLU SV#TLA
ZDROJPROCHÁZEJÍCÍHO
SV#TLAFOTONÁSOBI$E
ZELENÁ
ORAN%OVÁ
$ERVENÁ
FAR RED
VZOREK
CCD KAMERA
Konfigurace LSC
•Laserymodr" (488nM) 20 mW Ar'erven" (633nM) 5 mW He-NeUV (400nM) 30mW Diode
Konfigurace LSC
•Laserymodr" (488nM) 20 mW Ar'erven" (633nM) 5 mW He-NeUV (400nM) 30mW Diode
•Detektory4 fotonásobi'e s v"m)nn"mifiltrbloky + detektor rozptylu
Konfigurace LSC
•AutofokusRychl" laserov" AutoFocusnezávisl" na intenzit)fluorescence
•Laserymodr" (488nM) 20 mW Ar'erven" (633nM) 5 mW He-NeUV (400nM) 30mW Diode
•Detektory4 fotonásobi'e s v"m)nn"mifiltrbloky + detektor rozptylu
Konfigurace LSC
•AutofokusRychl" laserov" AutoFocusnezávisl" na intenzit)fluorescence
•Laserymodr" (488nM) 20 mW Ar'erven" (633nM) 5 mW He-NeUV (400nM) 30mW Diode
•Detektory4 fotonásobi'e s v"m)nn"mifiltrbloky + detektor rozptylu
•MikroskopOlympus IX-serie10x, 20x, 40x, 60x objektivyAutomatick" stolek s posunem0.5*m
Konfigurace LSC
•AutofokusRychl" laserov" AutoFocusnezávisl" na intenzit)fluorescence
•Laserymodr" (488nM) 20 mW Ar'erven" (633nM) 5 mW He-NeUV (400nM) 30mW Diode
•Detektory4 fotonásobi'e s v"m)nn"mifiltrbloky + detektor rozptylu
•MikroskopOlympus IX-serie10x, 20x, 40x, 60x objektivyAutomatick" stolek s posunem0.5*m
•KameraBarevná CCD kamera prozáznam snímk( s vysok"mrozli&ením
Zobrazovací cytometrOlympus Scan^R
vzorek
kostka
Fluorochrom
Excita&níFiltr
Dichroické
zrcadlo
Emisní Filtrdiafragma
Objektiv
CCD kamera
Zdroj sv'tla –v%bojka
Hardware
• Mikroskop Olympus IX81
• Vysoce citlivá CCD / motorizovan" stolek,
• Illumin'ní systém MT20
• Real-Time PC kontroler
• Hardwarov" i softwarov" autofokus
• Inkubátor (teplota, CO2, vlhkost)
• Robotick" podava' vzork(
ShutterAttenuator Light guideXe or XeHg Filter wheel
MT 20 – Nov% sv'teln% zdroj pro fluorescen&ní aplikaceZcela integrované !e(ení
! Sv)tlovod ! Zdroj energie
! Záv)rka
! Sada filtr(! Atenuátor
! Xe nebo Hg/Xe Arc v"bojka
! Elektronika
All Inclusive
Termáln) i mechanicky je tento zdroj izolovánod mikroskopu – eliminují se tedy vibracevyvolané tepeln"mi zm)nami i pohybemmechanick"ch sou'ástek
PC controler pro Imaging System: Serial operation, PC jitter, ...
Real-time synchronizace
Paralelní operace, eliminace PC jitter, vysoce p%esn" timing, redukce bleachingu
CCD
Shutter
Filter wheel
)as
shutter
Readout 1Exposure 1 Exposure 2 Readout 2
change filter
PC jitter PC jitter PC jitterPC jitter
shutter Exposure 1 Readout 1 shutter change filter shuttervibrations Exposure 2 Readout 2
1. Kvantitativní záznam souboru obraz$
2. Anal%za obraz$ a identifikace jednotliv%chudálostí
3. Kvantifikace fluorescence jednotliv%chudálostí
Excitace lasery
Záznam signálu pomocí
fotonásobi&$
Excitace v%bojkou
Záznam signálu pomocí CCD
kamery
Segmentace získaného souboru obraz( vymezením úrovn) pozitivity vjednom z kanál(
Sestavení scatergram(, dotplot( a histogram( odpovídajícíchfluorescen'ním vlastnostem m)%eného vzorku
3T3 fibroblast, paclitaxel-OregonGreen + doxorubicin
3T3 fibroblast, paclitaxel-OregonGreen + doxorubicin
Periferní kontura
pozadíSubkontura
Primární kontura
Roz(í!ení primární kontury
Segmentace událostí (Triggering)
Segmentace událostí (Triggering)fantomové (virtuální) události
jaterní tká& karcinom prsu slezina
parafínové %ezy, zna'eno SytoxOrange
1. Kvantitativní záznam souboru obraz$
2. Anal%za obraz$ a identifikace jednotliv%chudálostí
3. Kvantifikace fluorescence jednotliv%chudálostí
Excitace lasery
Záznam signálu pomocí
fotonásobi&$
Excitace v%bojkou
Záznam signálu pomocí CCD
kamery
Segmentace získaného souboru obraz( vymezením úrovn) pozitivity vjednom z kanál(
Sestavení scatergram(, dotplot( a histogram( odpovídajícíchfluorescen'ním vlastnostem m)%eného vzorku
Zaznamenané parametry• Fluorescence inegrováná v rámci segmentovacích kontur
• Maximální intenzita jednoho pixelu (“Maximal Pixel”)
• Integra&ní plocha (po&et pixel$)
• Pr$m'r integra&ních kontur
• Fluorescence integrovaná v oblasti vymezené perifernímobrysem (nap!. jádro vs cytoplazma)
• Fluorescence pozadí (m$"e b%t automaticky ode&tena)
• xy sou!adnice v(ech pixel$ (poloha na sklí&ku)
• )as m'!ení
• U sekundárních kontur jejich fluorescen&ní parametry,jejich po&et a vzdálenost
1. Co to je skenovací / zobrazovací cytometrie
2. Princip
3. P!íklady a vyu"ítí
Red Max Pixel
A
rea
100
A
A B
B
C
C
Granulocytes (C)
Lymphocytes (A)0
Monocytes (B)
100
Identifikace populací PBL na LSC pomocí rozídl$ v barveníjaderné DNA
Anal"za bun)'ného cyklu
M-fázeG1-fáze
3T3 fibroblasty, PI + phalloidin-FITC
Detekce apoptotick%ch a mitotick%ch bun'k pomocízm'n hodnoty maximálního pixelu
(hyperchromicita chromatinu)R
ed
In
teg
ral
Red Max PixelRed Max Pixel
40
020 0 20
40
A B
G2
M
G1
S
Ctr CPT, 3h
0 50 150
10
20
30
40
0 50 150
10
20
30
40
A B
DNA Content DNA Content
DN
A S
tran
d B
reaks
DN
A S
tran
d B
reaks
Apoptotické bu*ky
Fale(n' pozitivníapoptotické bu*ky
Detekce apoptózy a identifikace “fale(n' pozitivních”apoptotick%ch bun'k
Pro ka"dou zvolenou populaci je mo"nézobrazit galerii událostí, které do ní pat!ía to umo"*uje p!ímou vizuální kontrolu
nastavení
Translokace NF-!B z cytoplasmy do jádra
Kontrola TNF 6h
Primární ('ervená) + periferní kontura (modrá) pro anal"zu jadernétranslokace NF-!B
Cytoplasmatická
exprese
Jaderná exprese
Translokace NF-!B z cytoplasmy do jádra
Anal"za tká$ov"ch %ez(
+ez z my(ích jater zna&en% DAPI a FITC-ApoBrdU technikou
Kvantifika'ní anal"za tká$ov"ch %ez(
ZNA#ENÍ
ANAL+ZALIKVIDACE
FLUOROCHROMU
„RECYKLACE“ vzorku
Ale kdo má tohleanalyzovat????????
• Bu$ky jsou analyzovány ve fyziologickém prost%edí
• Je mo!né provád)t anal"zu bun)k p%ímo v tkáni tzn. v p%irozen"chinterakcích s prost%edím, co! podstatn) ovliv$uje celou %adufyziologick"ch parametr(
• Je mo!né provád)t sekven'ní anal"zu v rámci dlouhodobé inkubacebun)k
• Pro ka!dé nastavení analytick"ch parametr( je okam!itá vizuálníkontrola
V"hody zobrazovací cytometrieoproti pr(tokové cytometrii
• Zobrazovací cytometrie spojuje simultánní multiparametrovou kvantitativnícytometrii a anal"zu obrazu u vzork( na pevn"ch substrátech (adherentní bu$ky,st)ry, tká$ové %ezy).
• ,iroké spektrum pokro'il"ch aplikací fluorescen'ní mikroskopie se zam)%ením nakvantitativní anal"zu a lokaliza'ní studie. Nap%: anal"za bun)'ného cyklu,detekce jednotliv"ch fází apoptózy, morfometrie jadérka, transloka'ní studie,anal"za !iv"ch bun)k, immunofenotypizace, FRET, FRAP a kvantitativní anal"zatká$ov"ch %ez(.
• Anal"zu je mo!né provád)t ve v&ech b)!n"ch laboratorních kultiva'níchnádobách (nejen na skle) jako jsou mikrotitra'ní desti'ky, petriho misky, lahvepro tká$ové kultury atd…Bu$ky jsou tedy analyzovány ve fyziologickémprost%edí.
SHRNUTÍ
D)kuji za pozornost....
Recommended