Variantes de PCR

VARIANTES DE PCR

- PCR Standard- PCR Anidada (Nested)- PCR Múltiple (Multiplex)- PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)- PCR en tiempo real (PCR cuantitativa) Q-RT-PCR- PCR in situ- PCR especifica de alelo- PCR asimétrica- PCR inversa- PCR hot-start- PCR tail- PCR touchdown- PCR de rango largo- PCR de fidelidad alta- PCR de metilación especifica

PCR Estándar

Tres Fases:• Desnaturalización• Alineamiento• Extensión

Componentes:• Hembra Templado• Cebadores• Nucleótidos• ADN polimerasa• Iones de Magnesio• Tampón de la reacción

PCR Anidada (Nested)Dos rondas de reacción:1ra amplifica un segmento mas largo2da amplifica un segmento mas corto (mas especifico)Trabaja con dos pares de cebadores

PCR Múltiple (Multiplex)

Simultáneamente amplifica 2 o mas secuencias diferentesUsa al menos dos pares de cebadores distintos

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

A partir de muestra de ARN, con proceso de transcripcióninversa (Transcriptasa Reversa)Se crea una cADN y esta es que se amplifica con PCR

PCR en tiempo real (PCR cuantitativa) Q-RT-PCR

Se conoce cantidad de producto después de cada cicloPor lo tanto se puede determinar cuanto contenía muestra inicialUsan pruebas como TacMan, SYBR Green, Beacons osondas de hibridización

PCR in situ

- Puede darse dentro de célula o en soporte mecánico- Combina PCR con la hibridización en sitio- Muy útil para evaluar progreso de enfermedades- Preparación de muestra de célula o tejido (fijación) es paso muy critico dentro del proceso

PCR especifica de alelo

- Como técnica de diagnostico o clonación- Enfocada en variaciones en un solo alelo (de dos o mas muestras)

PCR asimétrica

- Diseñada para amplificar preferiblemente una cadena de ADN en lugar de otra

PCR inversa- Cebadores en lugar de convergir divergen desde sus inicios- Uso cuando se conoce solo parte de secuencia

PCR hot-start- Acción de ADN polimerasa esta inhibida en temperaturas de ambiente por anticuerpos o químicamente para disminuir reacciones no especificas

PCR tail- Se denomina cuando se intenta aislar una secuencia desconocida cual continua después de una secuencia conocida- Variante de asimétrica pero basada en temperatura

PCR touchdown

- Variante usada cuando se desconoces secuencias exactas de extremos por amplificar, alguna base dudosa en el cebador- Gradualmente se baja temperatura durante hibridación

PCR de rango largo

- Se denomina método cuando se trabaja con mas de 4kb- Son kit especiales optimizados para fragmentos grandes

PCR de fidelidad alta

- Basada en enzimas diferentes del ADN polimerasa, las cuales proveen actividad de remoción de bases incorporadas incorrectamente

PCR de metilación especifica

- Para identificar patrones de metilación en islas CG- Muestra tratada y no tratada, dos pares de cebadores

- PCR Digital- Secuenciación (PCR modificada)- RAPD (Random Amplification of Polimorfic DNA) Uso de varios cebadores para amplificar varios segmentos de ADN (se obtiene patrón único característico)- RACE (Rapid amplification of cDNA ends)- PCR especifica de intersecuencia (ISSR) Uso en huellas genéticas- PCR de extensión solapada (Mutagenesis)- PCR de ensamblaje- LAMP PCR (Loop mediated isotermal amplificación)- PCR con otras enzimas (ej. helicasa)- …

OTROS TIPOS DE PCR

- Diagnóstico

- Genética Forense

- Epidemiología

- Genética de Clonación

- Paternidad

- Biotecnología

APLICACIONES DE PCR