Xantano

MODELLO CINETICO PER LA PRODUZIONE DELLO XANTANO

Xanthan gum is a complex exopolysaccharide produced by the plant pathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris. It consists of D-glucosyl, D-mannosyl, and D-glucuronyl acid residues in a molar ratio of 2:2:1 and variable proportions of O-acetyl and pyruvyl residues. Because of its physical properties, it is widely physical properties, it is widely used as a thickener or viscosifier in both food and non-food industries. Xanthan gum is also used as a stabilizer for a wide variety of suspensions, emulsions, and foams. We are interested in the biosynthesis and degradation of xanthan. The iosynthetic pathway of xanthan resembles that of succinoglycan.

INTRODUZIONE

Lo xantano è una gomma industriale ottenuta mediante fermentazione ed è probabilmente la più utilizzata a livello la più utilizzata a livello commerciale.

Le soluzioni acquose della gomma di xantano hanno una grande utilità per le loro proprietà reologiche:

Proprietà reologiche

� Comportamento da finta plastica;

� Viscosità stabile in un vasto range di temperature;di temperature;

� pH e concentrazione salina;

� Effetto sinergico con soluzioni di galattomannani.

Tali proprietà reologiche permettono alle soluzione acquose di Xantano di essere usate in un gran numero di industrie differenti (alimentare, industrie differenti (alimentare, cosmetica e farmaceutica) come:

� Emulsionante;

� Agente sospendente;

� Agente addensante.

Produzione dello Xantano

Xanthomonas campestris è il batterio maggiormente utilizzato per la produzione dello xantano, è un microorganismo aerobio obbligato.microorganismo aerobio obbligato.

X. campestris utilizza maggiormente la via di Entner-Doudoroff come processo catabolico del glucosio.

Via di Entner-Doudoroff

Glucochinasi Glucosio-6-fosfato deidrogenasi Aldolasi

Etanolo + CO2

Alcuni batteri demoliscono il glucosio attraverso la via del 2-cheto-3-deossi-6-fosfogluconato (o di Entner-Doudoroff) e grazie alla piruvato decarbossilasi il

piruvato è convertito in acetaldeide e CO2.

L’acetaldeide viene poi ridotta ad etanolo grazie all’azione di un alcool deidrogenasi.

Il processo di produzione della gomma dello xantano può essere effettuato in diverse tappe:

Produzione di una coltura contenente X. 1. Produzione di una coltura contenente X. campestris;

2. Preparazione dell’inoculo;

3. Produzione;

4. Raccolta della massa;

5. Isolamento.

Variabili che influenzano la produzione:

� Composizione del mezzo di coltura;

� Temperatura;

� pH;

� Coefficiente di diffusione della massa di O2;

� Fonte di azoto.

Concentrazione di O2 e N

� La concentrazione dell’ossigeno è molto importante per lo sviluppo cellulare dei microrganismi aerobici; infatti l’X. campestris necessita di ossigeno per compiere sia il processo di crescita che quello di produzione.processo di crescita che quello di produzione.

� Anche la quantità di N necessario varia a seconda delle diverse fasi del processo produttivo; infatti è possibile registrare, nella fermentazione dell’ X. campestris, una richiesta massima sia durante la crescita che durante la fase di produzione.

La produzione dello xantano può essere descritta mediante modelli cinetici più o meno complessi.

Il più complesso è capace di descrivere la biomassa, la fonte di azoto, la fonte di la biomassa, la fonte di azoto, la fonte di carbonio, la produzione della gomma dello xantano e l’evoluzione di ossigeno dissolto.

Tuttavia questi modelli non sono capaci di prendere in considerazione i cambiamenti futuri di tutte le condizioni operative.

MODELLO CINETICO

Il modello cinetico proposto può essere diviso in due diverse parti in relazione tra di loro:

1. descrizione della crescita (intesa prevalentemente come metabolismo prevalentemente come metabolismo dell’azoto);

2. descrizione della produzione di xantano, dell’energia di mantenimento e della fosforilazione ossidativa (produzione e catabolismo intesi prevalentemente come metabolismo del carbonio).

La descrizione della crescita si basa sul presupposto di considerare le reazioni ottenute considerare le reazioni ottenute come un somma dei parametri formanti la via considerata; come mostra la figura:

� Sintesi degli amminoacidi non formanti basi (r1);

� sintesi degli amminoacidi formanti basi (r2); formanti basi (r2);

� sintesi delle basi dell’RNA (r3);

� sintesi delle basi del DNA (r4).

La descrizione del metabolismo della fonte di carbonio è determinata assumendo che il determinata assumendo che il glucosio è coinvolto nelle quattro reazioni preliminari, ed è anche usato per:

� produzione dello xantano (r5);

� catabolismo totale del glucosio (r6).

Infine altre reazioni Infine altre reazioni sono prese in esame:

� fosforilazione ossidativa (r7 e r8);

� energia di mantenimento (r9).

Il processo di produzione della gomma dello xantano è formato da nove reazioni stechiometriche linearmente indipendenti che riguardano:

1. aminoacidi non formanti basi; aminoacidi non formanti basi; 2. DNA; 3. RNA;4. ammonio (NH4

+);5. xantano (P);6. saccarosio (S);7. FAD+;8. ossigeno disciolto (O2);9. ATP.

La biomassa è stata considerata come formata da quattro componenti:

1. proteine intracellulari (IPR);

2. basi formanti RNA;

3. basi formanti DNA;

4. idrocarburi intracellulari (lipidi, xantano, ecc.).

Equazioni Cinetiche

Le equazioni cinetiche supposte per ogni reazione dello schema precedente sono:

dove:

3.58 e 4 sono i coefficienti stechiometrici;

CA = [ammoniaca]CA = [ammoniaca]

CX = [biomassa]

CO2 = [ossigeno disciolto]

YATP = resa ATP

k’5 = costante modello (L/molO2)

Il modello cinetico è costituito da otto equazioni differenziali, che descrivono la produzione della biomassa e i la produzione della biomassa e i processi di produzione dei composti restanti (ammoniaca, IPR, RNA, DNA, fonte di carbonio, xantano e ossigeno disciolto).

Al fine di conoscere la quantità delle proteine extracellulari formate (EPR) è stato condotto un bilancio sulla massa di azoto ad ogni fase dell’esperimento.dell’esperimento.

La formula molecolare (generica) per le EPR è stata assunta essere simile a quella delle IPR.

Il modello proposto è formato dal seguente insieme di equazioni differenziali:

dove 18, 136.9, 103.4, 475.25, 463.9, 180.0 e 923.2 sono rispettivamente i pesi molecolari dell’NH4 e quelli assunti per amminoacidi non formanti basi (aaNFB), amminoacidi formanti basi (aa ), RNA, DNA, glucosio e (aaFB), RNA, DNA, glucosio e xantano. I coefficienti 1.4, 2.74, 5.49, 0.933, 0.5, 1.08, 0.041 e 0.3 sono i coefficienti stechiometrici dei diversi composti coinvolti nello schema della reazione.

Per la valutazione del coefficiente volumetrico di trasferimento della massa di ossigeno (kLaV), in un reattore omogeneo e continuamente agitato, è stata impiegata l’equazione:stata impiegata l’equazione:

Dove:

µ = viscosità apparente

N = velocità dell’agitatore

VS = flusso d’aria (m/s)

Condizioni sperimentali e procedura

Gli esperimenti sono stati svolti in un bireattore commerciale con un volume di lavoro di 1.5 L.

Procedura sperimentale:

� inoculo costruito usando un mezzo di coltura � inoculo costruito usando un mezzo di coltura complesso (YM: D-glucosio (10 g/L));

� peptone batteriologico (5 g/L);

� estratto di lievito (3 g/L);

� estratto di malto (3 g/L)

che devono essere aggiunti, sia per la piastra di coltura sia per il primo stage della coltivazione nell’agitatore.

Il secondo stage dopo che l’inoculo si è formato viene compiuto usando:

� YM-T (D-Glucosio (12 g/L)); � peptone batteriologico (2.5 g/L);

estratto di lievito (1.5 g/L); � estratto di lievito (1.5 g/L); � estratto di malto (1.5 g/L); � PO4H(NH4)2 (1.5 g/L);� PO4HK2 (2.5 g/L);� MgSO4 (0.05 g/L).

Inoltre il pH deve essere portato a 7.0 con l’aggiunta di HCl.

Il mezzo di coltura è stato ottimizzato altrove, utilizzando:

� saccarosio (40 g/L);� acido citrico (2.1 g/L);� NH4NO3 (1.144 g/L);� NH4NO3 (1.144 g/L);� KH2PO4 (2.866 g/L);� MgCl2 (0.507 g/L);� Na2SO4 (0.089 g/L);� H3BO3 (0.006 g/L);� ZnO (0.006 g/L);� FeCl3. 6H2O (0.020 g/L);� CaCO3 (0.020 g/L);� HCl (0.13 ml).

� Il pH è stato portato, con aggiunta di NaOH, al valore di 7.

� Il mezzo di coltura privo della fonte di carbonio è stato sterilizzato in sito.

� La fonte di carbonio è stata separatamente sterilizzata e introdotta in un secondo momento nel bioreattore.

Condizioni operative

sterilizzata e introdotta in un secondo momento nel bioreattore.

� L’inoculo è stato introdotto nel bioreattore attraverso un setto di membrana.

� La temperatura è stata controllata attraverso la strumentazione del bioreattore.

In diversi momenti durante i processi, campioni di 10 ml di coltura sono stati prelevati per essere analizzati.

Metodi analitici

� La citometria a flusso è stata la modalità d’analisi utilizzata per i composti intracellulari (proteine, DNA e RNA).

� La concentrazione delle proteine extracellulari è stata calcolata mediante il bilancio dell’azoto.stata calcolata mediante il bilancio dell’azoto.

� La concentrazione dello Xantano è stata ottenuta come variazione della viscosità del brodo di coltura misurata a 25°C e 30 rpm in un viscosimetro.

� La concentrazione del saccarosio è stata misurata mediante strumenti di HPLC.

� La concentrazione dell’ossigeno disciolto è stata monitorata mediante un elettrodo polarografo.

Metodo del calcolo del parametro

I valori del parametro sono stati ottenuti attraverso una tecnica di regressione non lineare, usando un algoritmo a risposta multipla.

L’integrazione dell’insieme delle eq. differenziali è stata ottenuta con l’ausilio di un algoritmo di Runge-Kutta del quarto ordine.

Per il significato statistico dei dati sono stati utilizzati i test di F Fisher e Student (t-test).

Risultati sperimentali e discussioneSono stati effettuati sei esperimenti cambiando due variabili: la [N] iniziale (130,257 e 457 ppm di ammonio) e la temperatura (25, 28, 31 e 34°C).

I valori cinetici del parametro ottenuti non I valori cinetici del parametro ottenuti non hanno mostrato dipendenza rispetto alla [N] iniziale, ma hanno, invece, mostrato dipendenza rispetto alla temperatura.

Alcuni di questi con un massimo (k2, k5 e YOX), altri con tendenze lineari (k1, kHC e k’5), e infine altri non variano (k3 e k4).

I risultati sperimentali ottenuti posso essere osservati nelle seguenti figure:

T=28°C; [ammonio]=257 ppm

T=25°C; [ammonio]=257 ppm

(a)biomassa, proteine intracellulari, RNA, DNA, [ammonio]

(b)saccarosio, xantano e ossigeno disciolto

T=31°C; [ammonio]=257 ppm

T=34°C; [ammonio]=257 ppm

(a)biomassa, proteine intracellulari, RNA, DNA, [ammonio]

(b)saccarosio, xantano e ossigeno disciolto

(a)biomassa, proteine intracellulari, RNA, DNA, [ammonio]

(b)saccarosio, xantano e ossigeno disciolto

T=28°C; [ammonio]=130 ppm

T=28°C; [ammonio]=457 ppm

I dati sperimentali sono stati uniti al modello cinetico, tenendo conto dei diversi parametri in funzione della temperatura, ne consegue:

Conclusioni

Il modello proposto è capace di prevedere il comportamento del sistema quando solo alcunecondizioni variano.

Ad es.Ad es.

Quando la [N] iniziale cambia, la produzione massima di xantano si ha a ~200 ppm di ammonio.

Quando è la temperatura a cambiare, la produzione massima si ha al di sopra di 28°C

Inoltre maggiore è la percentuale di O2

disciolto e maggiore è la produzione di Xantano