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Programa de Pós-Graduação em MicrobiologiaBiologia Molecular de Micro-organismos (MIC842)ICB/UFMG
PCR quantitativaTeoria e Aplicações
Lucas Secchim RibeiroLaboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
• PCR Histórico Teoria Aplicações
• Desenho de primers
• qPCR MetodologiasCálculos Aplicações PCR Digital
Dogma central da Biologia Molecular• Francis Crick / 1956
PCRPCR
PCR - Polymerase Chain Reaction
Funções da PCR• Distinguir uma sequência-alvo específica de uma grande quantidade de background;
• Amplificação de cópias de uma sequência específica a partir de pequenas quantidades do DNA modelo.
Aplicações da PCR “convencional”• Diagnóstico
• Avaliação de mutações• Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários)
• Tipagem para transplantes - MHC
• Testes forenses• Paternidade• Investigações criminais
• Sequenciamento e clonagem• Epidemiologia molecular e bioinformática• Análise de OGM• ...
PCR “convencional”
Reagentes básicosIniciadores
senso/antissenso(primers forward/reverse)
Cátions(Na+/K+ e Mg2+)
DNA polimerasecom DNA modelo
Deoxinucleotídeos(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Importância do tampão e íon potássio na PCR• pH 8,3 pH 7,2 a 72º C
• Tris/ Tris-Cl•Função enzimática da DNA polimerase
• K+
• Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer pela neutralização de cargas negativas
↑ [K+] para fragmentos pequenos ↓ [K+] para fragmentos grandes
Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR• Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
• Associados ao DNA na forma de dNMPs• Sequestradores de Mg2+
• Mg2+
• Cofator da DNA polimerase• Especificidade e eficiência da enzima•Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita de DNA (↑ Tm)• Rendimento x Concentração crítica e empírica
↑ [Mg2+] ↑eficiência ↓especificidade
Função e relevância dos primers• Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de sequência complementar e flanqueadora à fita molde, com a extremidade 3´-OH livre
Thermus aquaticus
DNA polimerase termorresistente• Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo
• Taq DNA Polimerase• Dependente de cátions bivalentes (Mg2+ > Mn2+ >>>Ca2+)
• Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato)
Parque Nacional de Yellowstone / EUA
DNA molde• Qualidade • Cuidado com resíduos de processos de extração
• SDS (dodecil sulfato de sódio)• Fenol• Corantes• Heparina/EDTA/Citrato• Polissacarídeos vegetais/carragenina• Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV
• Quantidade• Excesso de DNA é prejudicial• Aumento de reação inespecífica
Parâmetros de termociclagem• Temperatura de anelamento
↑ Tanelamento ↑estringência ↓produtos inespecíficos
↓ Tanelamento ↑rendimento ↑ produtos inespecíficos
• Tempo de extensão• DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C• Mínimo = 1 minuto • Excesso Atividade de exonuclase 5´-3´
Aditivos• Separação de fitas com alto conteúdo G:C• Estruturas secundárias fortes
• Betaína (1 M)• DMSO (1-10%)• Formamida (1-10%)
• Agentes estabilizantes da DNA polimerase• Redução da adesão de reagentes ao tubo
• BSA (0,1 mg/mL)• Gelatina (0,1 – 1,0%)• Detergentes não-iônicos (<0,5%)
Inibidores• Derivados das próprias amostras ou do método de extração/purificação do ácido nucléico;
• Fenol/álcoois• EDTA• Debris celular• Detergentes
Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)
Visualização dos resultados• Separação por eletroforese• Corantes/marcação fluorescente
Visualização dos resultados• Sequenciamento capilar• Dideoxinucleotídeos
Antes da PCR...• Clonagem!
Antes dos termocicladores...• Banho-maria!
Desenho deDesenho deprimersprimers
Características de bons primers• Tamanho adequado• 15 a 25 pares de bases• Tamanho x Temperatura de dissociação
• Temperatura adequada de dissociação (Tm)• Conteúdo G:C•Diferença entre primers < 5º C
Características de bons primers• Tamanho do fragmento a ser gerado• Tempo de extensão da polimerase
•Especificidade Primers específicos x degenerados
Características de maus primers• Inter-complementariedade• Formação de dímeros (primer dimer)• Atenção à extremidade 3´
Características de maus primers• Auto-complementariedade• Formação de auto-dímeros e hairpins
Características de bons primers• Adequação para qPCR• Tamanho do amplicon •Junção exon-exon e contaminação com gDNA
Ferramentas online de suporte• Primer-BLAST
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
• Primer3bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3
• IDT Oligo Analyzer 3.1www.idtdna.com/calc/analyzer
• UCSC PCR in silicogenome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
• RT Primer DB (específico para qPCR)• medgen.ugent.be/rtprimerdb
Problemadetectado
Workflow para desenho de primers
Verificar• Temp. de anelamento• Temp. de dissociação• Tamanho do amplicon• Estruturas secundárias• Complementaridade• EspecificidadeNãoSim
PCR para confirmação de funcionamento
PCR para confirmação de funcionamento
GenBank/NCBI
Encontrar sequência da região desejada
Encontrar sequência da região desejada
PrimerBLASTPrimer3, etcDesenhar primersDesenhar primers
Registrar e arquivarresultados obtidos
Registrar e arquivarresultados obtidos
Reaçãoadequada
OK?OK?
CHECAR PRIMERS!CHECAR PRIMERS!
PCRPCRquantitativaquantitativa
PCR quantitativa
• Nomenclatura• qPCR• qRT-PCR• Real-time PCR
Ensaios químicos disponíveis
• SYBR Green I• Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan)• Molecular Beacons• LightCycler• LUX
Detecção de fluorescência!
↑ sensibilidade
SYBR Green I• Corante específico para DNA de fita dupla• Flourescência aumenta ao longo da reação• Não tem ação inibitória• Detecta produtos inespecíficos
SYBR Green I
Brometo de etídio
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan• Atividade 5´-nucleásica da Taq DNA Polimerase• Altamente específica, sem produtos espúrios• Duas marcações simultâneas são possíveis• Tecnologia baseada em FRET• Flourescence Resonance Energy Transfer
FRET - Transferência de energia por ressonância fluorescente• Fenômeno quântico entre duas moléculas muito próximas (10 – 100 Å), com bloqueio da emissão de luz• Quencher/bloqueador
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan• Discriminação alélica
Conceitos importantes• Fases exponencial, logarítmica e plateau
• Threshold• Baseline• Cycle threshold (CT)
Ciclos
Flou
resc
ênci
a(p
rodu
tos
de P
CR
)
Plateau
Linear
Exponencial
Threshold
Ciclos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Amostra A 3 6 12 24 48 96 192 384 768 1536 3072
Amostra B 15 30 60 120 240 480 960 1920 3840 7680 15360
~7,05 ~9,38
↑ CT ↓ Qtde. inicial↑ CT ↓ Qtde. inicial
Quantidadeinicial
CT
Amostra A 3 9,38
Amostra B 15 7,05
Conceitos importantes• Quantidade inicial de amostra• Relação CT x Quantidade inicial
Conceitos importantes• Eficiência
2n = cópias em n ciclos Eficiência teórica= 100%
Conceitos importantes• Eficiência
Qtde. inicial de
DNA1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000
CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1
Log 10da qtde. inicial
0 1 2 3 4 5 6 7 8
CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1
Conceitos importantes• Eficiência
E = 10(-1/slope)
Conceitos importantes• Eficiência
Eficiência 100% = 2n a cada ciclo = log 2 x
Para um aumento de 10x = log 2 10 = 3,32
Slope(inclinação)
Conceitos importantes• Curva-padrão e blank sample
• Gene de referência/constitutivo/normalizador• Gene de interesse
Controle Infectado
GAPDH IFN-γ Relação GAPDH IFN-γ Relação
Amostra 1 20 20 1 5 40 8,0
Amostra 2 30 40 1,33 5 20 4,0
Amostra 3 60 80 1,33 10 50 5,0
Amostra 4 50 60 1,2 15 80 5,33
Amostra 5 40 50 1,25 10 60 6,0
Média + EPM 1,22 + 0,06 Média + EPM 5,66 + 0,67
Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)• Indica a temperatura em que 50% dos primers estão anelados;• Ligação específica do corante à fita dupla
Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)• Diretamente relacionada ao conteúdo G:C• Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de primers
Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)• Importante para distinção de amplicons/primers em protocolos multiplex
Fatores que afetam a eficiência da qPCR• DNA degradado• Produtos inespecíficos• Tamanho do amplicon• Condições de termociclagem
• Prática laboratorial inadequada• Reagentes contaminados• Primers mal desenhados• Diluições mal feitas• Falta de calibração e manutenção
• Pipetagem errada!
Funções da PCR quantitativa• Quantificação absoluta• Curvas-padrão• Quantidade conhecida de “cópias por volume”• Semelhante a um ELISA• Exemplos: carga viral, 16S bacteriano
• Avaliação relativa• Ausência de curva-padrão• Gene de referência para normalização• Apresentada em aumento/redução em relação a um controle experimental• Exemplo: expressão gênica
CÁLCULOS E ANÁLISES
CÁLCULOS E ANÁLISES
Verificar dispersão entre replicatas biológicas e técnicas
Verificar dispersão entre replicatas biológicas e técnicas
Checar controles positivos(curva-padrão) e negativos (blank)
Checar controles positivos(curva-padrão) e negativos (blank)
Conferir curvas de dissociação (Tm)Conferir curvas de dissociação (Tm)
Verificar ajuste do thresholdVerificar ajuste do threshold
Análise de resultados
Avaliar as curvas de amplificaçãoAvaliar as curvas de amplificação
Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta• Regressão linear simples• Método Pfaffl Método Pfaffl Curva de cópias (plasmídeos) Curva de cópias (plasmídeos)
Cálculos em qPCR – Quantificação relativa• Relação matemática entre a expressão dos genes de referência e os de interesse• Método Livak Método Livak 2 2--ΔΔΔΔCTCT
Cálculos em qPCR – Quantificação relativa• Avaliada a conformidade de todos os outros parâmetros, a única informação útil será o CT
• Exemplo:
Controle Infectado
GAPDH IFN-γ GAPDH IFN-γ
Amostra 1 15,1 32,5 14,9 29,4
Amostra 2 15,4 33,1 15,5 29,1
Amostra 3 16,0 32,8 15,1 28,8
Amostra 4 18,1 31,5 15,8 29,9
Amostra 5 15,7 32,0 15,5 28,9
GAPDH IFN-γ Amostra 1 15,1 32,5 17,4 1,08 0,47Amostra 2 15,4 33,1 17,7 1,38 0,38Amostra 3 16 32,8 16,8 0,48 0,72Amostra 4 18,1 31,5 13,4 -2,92 7,57Amostra 5 15,7 32 16,3 -0,02 1,01
GAPDH IFN-γ Amostra 1 14,9 29,4 14,5 - -1,82 3,53Amostra 2 15,5 29,1 13,6 - -2,72 6,59Amostra 3 15,1 28,8 13,7 - -2,62 6,15Amostra 4 15,8 29,9 14,1 - -2,22 4,66Amostra 5 15,5 28,9 13,4 - -2,92 7,57
Controle
Infectado
ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT
ΔCT
Média ΔCT
16,32
Média ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT
Extração e manuseio de ácidos nucléicos• RNA = extremamente lábil!• Armazenamento correto• Dosagem e normalização das amostras• A260/280 e A260/230 > 1,8
• Contaminação com DNA genômico
Confecção de cDNA• Normalizar a mesma quantidade (p.e. 2 µg) de RNA para todas as amostras;• Todo o procedimento deve ser realizado no gelo;• Ciclos de congelamento/descongelamento;
Escolha do gene de referência• É necessário ter opções!• Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo
• Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem ter a expressão do gene constitutivo alterada; •Preparar um pool com amostras-controle• 6 diluições em triplicata
• Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0
•Algoritmos gratuitos na internet•NormFinder: macro para Excel
Antes da qPCR...• Northern Blotting (RNA)• Southern Blotting (DNA)
PCRPCRdigitaldigital
PCR digital (dPCR)
Baseada na compartimentalização da amostra• Gotículas (droplets) em emulsão = microfluidos• Chips com nanopoços
Individualização das moléculas!Distribuição de Poisson
Aplicações• Quantificação absoluta sem curva-padrão• Expressão gênica• Detecção de alelos raros e/ou mutações• Discriminação de baixas diferenças para CNV
Sample DNA
Target
Fonte: Baker M, 2012. Nature Methods 9, 541 (Jun 2012)
http://www.gene-quantification.de/
O que é importante saber?
• Teoria e suas diferenças entre as técnicas
• Vantagens e desvantagens de cada uma
• Como aplicar a PCR ao seu projeto
• Aplicações gerais e específicas
• Boas práticas laboratoriais
Lucas Secchim Ribeiro
secchimribeiro@gmail.com
Dpto. MicrobiologiaLaboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
Sala C4 191 – Ramal 2735
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