Tema 6 DiagnóStico VirolóGico

PARTE IIDiagnóstico microbiológico de las Enfermedades Infecciosas:

2. Diagnóstico directo. Toma y calidad de las muestras. Procesamiento en el laboratorio de microbiología. Técnicas de diagnóstico rápido

3. Diagnóstico indirecto. Técnicas. Sensibilidad y especificidad de los estudios serológicos. Perfiles serológicos para el diagnóstico de diferentes patologías infecciosas

4. Microbiología molecular. Diagnóstico de microorganismos por la detección de ácidos nucleicos. Epidemiología molecular. Estudio de los polimorfismos genéticos

5. Diagnóstico de las enfermedades producidas por micobacterias. El laboratorio de micobacterias. Muestras clínicas y su procesamiento. Nuevas técnicas aplicadas al diagnóstico de M. tuberculosis

6. Diagnóstico de los virus. El laboratorio de virología. Muestras clínicas. Cultivos celulares y otras técnicas de diagnóstico. Cuantificación viral

JUSTIFICACIÓN DEL DIAGNÓSTICO JUSTIFICACIÓN DEL DIAGNÓSTICO ETIOLOGICO DE LAS INFECCIONES ETIOLOGICO DE LAS INFECCIONES

VIRALESVIRALES

• ENFERMEDADES GRAVES POR VIRUS- terapias agresivas (cáncer ..)- transplantados- sida

• DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS- más asequibles- técnicas moleculares

• EXISTENCIA DE TRATAMIENTOS EFICACES

Diagnóstico de laboratorio de las Diagnóstico de laboratorio de las infecciones viralesinfecciones virales

• Confirmar el diagnóstico clínico

• Seleccionar un tratamiento adecuado

• Monitorizar la evolución de la enfermedad

• Hacer un seguimiento epidemiológico de la enfermedad

DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES VIRALES

• Directo:

Demostración de la presencia del virus en la muestra clínica

• Indirecto:

Demostración de la presencia de anticuerpos específicos en el suero

DIAGNOSTICO DIAGNOSTICO INDIRECTOINDIRECTO DE LAS DE LAS INFECCIONES VIRALES:INFECCIONES VIRALES:

• Infecciones agudas: IgM, seroconversión, serorefuerzo

• Infecciones crónicas: IgG, avidez

Demostración de la presencia de anticuerpos específicos en el suero

DIAGNOSTICO DIAGNOSTICO DIRECTODIRECTO DE LAS DE LAS INFECCIONES VIRALES:INFECCIONES VIRALES:

• Inoculación en animales de experimentación• Inoculación en huevo embrionado• Inoculación en cultivos celulares:

- primarios, diploides, líneas contínuas• Detección del virus en la muestra:

- visualización partícula viral (M/E)- detección de componente estructural (Ag, ac. nucleico)

Demostración de la presencia del virus en la muestra clínica

DIAGNÓSTICO DE VIRUS:DIAGNÓSTICO DE VIRUS:

Toma de muestrasToma de muestras

Muestras clínicaspara el aislamientode virus

CONSIDERACIONES A LA TOMA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNOSTICO DE LA

INFECCION VIRAL

• Precoz

• Adecuada (raspados, lavados ..) ¡células!

• Localización 1ria de la infección y otras posibles

• Transporte y conservación

• Decontaminación

• Infección enfermedad (viremia)

DIAGNÓSTICO DIRECTO DE VIRUS:DIAGNÓSTICO DIRECTO DE VIRUS:

Microscopía ópticaMicroscopía óptica

Fibroblastos infectados por CMV

Célula epitelialinfectada por HSV

Células sanguíneasinfectadas por CMV(antigenemia pp65)

Varicela-zoster, influenza, parainfluenza, adenovirus …

Células de mucosa respiratoriainfectadas por HSV

DIAGNÓSTICO DIRECTO DE VIRUS:DIAGNÓSTICO DIRECTO DE VIRUS:

InmunocromatografíaInmunocromatografía

DETECCIÓN DE ANTÍGENODETECCIÓN DE ANTÍGENO (Inmunocromatografía)(Inmunocromatografía)

CC TT SS

FUNDAMENTO DE INMUNOCROMATOGRAFÍA PARA DETECCIÓN DE ANTÍGENOS

TIRA NITROCELULOSA

Antígeno en muestraAntígeno en muestra

Anticuerpo de Captura Anticuerpo de Captura contra antígenocontra antígeno

específicoespecífico

GG

Anticuerpos de detecciónAnticuerpos de detección marcados con marcados con

Oro ColoidalOro ColoidalGG

Anticuerpo de Captura Anticuerpo de Captura contra anticuerpo contra anticuerpo

de detecciónde detección

TÉCNICA DE INMUNOCROMATOGRAFÍA:DETECCIÓN DEL VIRUS INFLUENZA

• Rotavirus • Virus Respiratorio Sincitial• Influenza A, B• …………

CULTIVO DE VIRUS:CULTIVO DE VIRUS:

Cultivos celularesCultivos celulares

fibroblastos

CULTIVOS CELULARES:

• Primarios

• Diploides

• Línea contínua

MICROSCOPIOINVERTIDO

DETECCION DE LA PRESENCIA DE LOS VIRUS EN LOS CULTIVOS CELULARES

• EFECTO CITOPÁTICO

- alteraciones morfológicas

- inclusiones citoplásmicas

- lisis (generalizadas, focales)

- fusiones (sincitios)

• OTROS: hemaglutinación, hemadsorción …

EFECTO CITOPÁTICO:

Lisis de la monocapa

EFECTO CITOPÁTICO (parcial)

EFECTO CITOPÁTICO (completo)

INCLUSIONES VIRALES EN LOS CULTIVOS CELULARESINCLUSIONES VIRALES EN LOS CULTIVOS CELULARES

CUERPOS DE INCLUSIÓN

HEMADSORCIÓN

IDENTIFICACION DE LOS VIRUS EN LOS CULTIVOS CELULARES

• Neutralización del efecto observado (citopático, hemaglutinación ..)

• Detección antígeno con Ac. específicos marcados (IF, EIA, RIA)

• Detección ac. nucleico (hibridación, amplificación)

Fibroblastos infectados por CMV

SHELL VIAL

SHELL VIAL

Fibroblastos infectados por CMV

DIAGNÓSTICO DIRECTO DE VIRUS:DIAGNÓSTICO DIRECTO DE VIRUS:

Técnicas molecularesTécnicas moleculares

DIAGNÓSTICO DE LAS VIRIASIS RESPIRATORIAS

• Clínica

• Imagen Dtico. inespecífico

• Epidemiología

• Aislamiento en cultivo Dtico. tardío

• Serológico

• Detección de Ag Dtico. específico, rápido

• Amplificación genética

Termociclador

Ciclos de: Desnaturalización Anillamiento Elongación

PCRPCR

La amplificación de ac. nucleicos en el La amplificación de ac. nucleicos en el diagnóstico de las enfermedades viralesdiagnóstico de las enfermedades virales

• Diagnóstico (sensibilidad, único método)

• Cuantificación (carga viral)

• Epidemiología molecular (tipado)

• Detección de la resistencia al tto. (VIH,VHB…)

• Identificación de nuevos patógenos (VHC,

HHP-8 …)

CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS EN SANGRE (plasma, suero)

VIREMIA nº de copias o UI / ml

• DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDAD (CMV)

• PROGRESIÓN DE LA INFECCIÓN (VIH)

• RIESGO DE TRANSMISIÓN VERTICAL (MADRE-HIJO)

• EFICACIA DE LA TERAPIA ANTIVIRAL

PCR CUANTITATIVA: Carga Viral PCR CUANTITATIVA: Carga Viral (sangre total, plasma, suero)(sangre total, plasma, suero)

• VIH copias / ml [20-10.000.000]

• VHC UI / ml [15 - 69.000.000]

• VHB UI / ml [20 - 170.000.000]

• CMV, Epstein-Barr, HHV6, virus JC/BK ....

DIAGNÓSTICO CITOMEGALOVIRUS

• Serología • Antigenemia (pp65)• Cultivo convencional• Cultivo shell vial• Métodos moleculares (PCR)