Sains Malaysiana 38(5)(2009): 773–784

Chlorella vulgaris Menunjukkan Kesan Antioksidan dan Antitumor Terhadap Kanser Hepar dalam Kajian in vivo dan in vitro

(Chlorella vulgaris Exhibited Antioxidant and Antitumour Effects against Liver Cancer in in vivo and in vitro Studies)

NOR ASHIKEEN MUKTI, SUHANIZA SULAIMAN, SUHANA MD SAAD, JUNAIDA @ MAIMUNAH HASSAN BASARI, MARIATI ABDUL RAHMAN, WAN ZURINAH WAN NGAH & YASMIN ANUM MOHD YUSOF*

ABSTRAK

Chlorella vulgaris (ChV), sejenis alga hijau unisel telah dilaporkan mempunyai khasiat kesihatan pada penyakit tertentu termasuk kanser. Objektif utama kajian ialah untuk mengukur dan menilai kesan antioksidan dan antitumor ekstrak air panas ChV ke atas sel kanser hepar yang dijalankan secara in vivo dan in vitro. Asai DPPH yang dijalankan menunjukkan peratus pengautan ChV yang tinggi. Dalam kajian in vivo, tikus Wistar jantan (200-250 g) dibahagikan kepada lapan kumpulan: tikus kawalan (diet normal), tikus diaruh kanser hepar (diet kurang kolin + 0.1% etionin dalam air minuman) atau singkatannya CDE, tikus diberi rawatan ChV pada tiga dos berbeza (50, 150 dan 300 mg/kg berat badan) dan tikus CDE diberi rawatan ChV pada tiga dos berbeza. Sampel darah dan tisu diambil dari semua kumpulan tikus pada minggu 0, 4, 8 dan 12 untuk penentuan kadar proliferasi dan apoptosis sel untuk melihat kesan antitumor ChV. Peratus pembentukan nodul praneoplasia adalah tinggi pada tikus diaruh kanser hepar (CDE) tetapi ChV pada semua dos berjaya mengurangkannya. Pertambahan jumlah sel kanser semasa hepatokarsinogenesis ditunjukkan dengan peningkatan proliferasi hepatosit yang signifikan (p<0.05) pada tikus CDE berbanding kawalan tetapi ChV pada semua dos berjaya mengurangkan proliferasi secara signifikan (p<0.05). Peratus apoptosis sel didapati meningkat secara signifikan (p<0.05) pada tikus CDE, tetapi peningkatan yang lebih ketara berlaku pada tikus CDE diberi ChV (300 mg/kg berat badan). Dalam kajian in vitro pula, aktiviti antitumor ekstrak air panas ChV telah ditentukan dengan melihat perubahan dalam proliferasi dan apoptosis sel kanser hepar HepG2 yang dikultur di makmal. Ekstrak air panas ChV berjaya menurunkan kadar proliferasi sel HepG2 dengan signifikan secara berkadar terus dengan dos yang digunakan dengan nilai IC50 1.6 mg/ml. Hasil analisis TUNEL pula menunjukkan ekstrak air panas ChV berjaya mengaruh apoptosis dalam sel HepG2. Keputusan ini disokong oleh hasil pemblotan Western dengan peningkatan pengekspresan protein P53 dan protein proapoptosis BAX dan Kaspase-3. Daripada hasil-hasil kajian, dapatlah dicadangkan bahawa ChV berpotensi tinggi sebagai antioksidan serta berupaya memberi kesan antitumor kepada kanser hepar pada kajian in vivo dan in vitro.

Kata kunci: antioksidan; antitumor; apoptosis; Chlorella vulgaris; kanser hepar; proliferasi

ABSTRACT

The unicellular green microalgae Chlorella vulgaris (ChV) has been reported to have beneficial effects on various diseases including cancer. The main objectives of this study were to determine and evaluate the antioxidant and antitumour properties of ChV against liver cancer cells, both in vivo and in vitro. The antioxidant effect of hot water extract of ChV was demonstrated by DPPH assay which exhibited a high percentage of free radical scavenging activity. In in vivo studies, male Wistar rats (200-250 g) were divided into eight groups according to the diet given: control group (normal diet), liver cancer (choline deficient diet + 0.1% ethionine in drinking water to induce liver cancer), abbreviated as CDE group, ChV group with three different doses (50, 150 and 300 mg/kg body weight), and CDE group treated with three different doses of ChV. Rats were killed at 0, 4, 8 and 12 weeks of experiment and blood and tissue samples were taken from the rats in all groups for the determination of cellular proliferation and apoptosis. ChV at all doses reduced the percentage of liver tumour incidence (the preneoplastic nodules) in the CDE (liver cancer) rats when compared to the CDE rats alone. The percentage of hepatocyte proliferation was significantly higher (p<0.05) in CDE rats when compared to control which however was inhibited by ChV at all doses. Meanwhile, the percentage of apoptotic cells in the CDE rats increased significantly (p<0.05) compared to control which was further increased when treated with higher dosage of ChV (300 mg/kg body wt). The antitumour effects of hot water extract of ChV in in vitro studies were determined by observing the changes in the proliferation and apoptosis rate in liver cancer cell line, HepG2. ChV reduced (p<0.05) the proliferation rate of HepG2 cells in dose-dependent manner. The IC50 value was recorded at 1.6 mg/ml. Apoptosis was induced by ChV, as indicated by TUNEL analysis which was supported further by Western blot analysis indicating increased expression of P53 and pro-apoptotic proteins BAX, and Caspase-3. From these findings, it can be suggested that ChV has great potential as an antioxidant with the ability to exert antitumour effects against liver cancer.

Keywords: Antioxidant; antitumour; apoptosis; Chlorella vulgaris; liver cancer; proliferation

774

PENDAHULUAN

Kanser hepar di Malaysia telah menjadi salah satu penyebab utama kematian dan merupakan penyakit malignan kesebelas tertinggi (Lim & Halimah 2004). Insiden karsinoma hepatosel (HCC) pada golongan lelaki terletak di tempat ke-10 manakala di kalangan wanita pula HCC menduduki tempat ke-15 (Lim & Halimah 2004). Pelbagai faktor dikaitkan sebagai penyebab HCC, antaranya keadaan persekitaran, pemakanan dan cara hidup (Romeo & Colombo 2002). Penyebab utama kanser hepar sering dikaitkan dengan jangkitan kronik virus hepatitis sama ada B atau C. Jangkitan kronik virus hepatitis B lebih banyak menyerang negara membangun seperti Asia Tenggara dan Afrika sub-Sahara, manakala jangkitan kronik virus hepatitis C pula di negara maju contohnya di Barat dan Jepun (Llovet et al. 2003). Punca lain kejadian kanser hepar adalah sirosis, ketaknormalan metabolisme, alkohol, pendedahan kepada radiasi, aflatoksin dan karsinogen kimia seperti hidrokarbon polisiklik aromatik (PAH) dan dietilnitrosamin (DEN) (Schafer & Sorrell 1999). Proses pembentukan kanser adalah kompleks dan melibatkan beberapa peringkat utama iaitu pemulaan (initiation), penggalakan (promotion) dan kemaraan (progression) (Pitot et al. 2000; Surh 2002). Pelbagai langkah ini dikatakan sebagai satu siri mutasi berturutan yang akhirnya membawa kepada pertumbuhan tumor malignan (Winter 1986). Antara kaedah perubatan bagi merawat penyakit kanser ialah pembedahan, kemoterapi dan radioterapi. Walau bagaimanapun, kaedah moden ini turut mendatangkan kesan sampingan yang tidak baik. Misalnya, rawatan secara kemoterapi memerlukan pengawasan yang rapi kerana ubat kemoterapi ini bukan sahaja membinasakan sel kanser, tetapi ia juga boleh merosakkan sel normal (Li et al. 2005). Kaedah yang segera seperti pembedahan (surgical resection) dan radioterapi pula hanya boleh dilakukan sekiranya kanser tersebut cuma berlaku pada satu organ tertentu dan belum mengalami metastasis. Bahan kemopreventif dikatakan boleh bertindak sebagai agen antitumor dan kebanyakan bahan ini diperolehi daripada sumber semulajadi seperti sayuran dan tumbuhan hijau (Hocman 1989; Shahidi 1997; Klaunig & Kamendulis 1999). Bahan kemopreventif dikatakan bertindak melambatkan, merencat atau menghalang proses perkembangan kanser sama ada di salah satu daripada tiga peringkat utama iaitu pemulaan, penggalakan dan kemaraan atau pada semua peringkat perkembangan tumor (De Flora & Ferguson 2005). Ia bertindak di peringkat pemulaan dengan menghalang prokarsinogen bertukar kepada karsinogen sebenar dan seterusnya menyekat interaksi di antara karsinogen sebenar tersebut dengan makromolekul intrasel seperti DNA (menghalang pembentukan aduk DNA yang reaktif) (Surh 1999). Selain itu, agen kemopreventif juga boleh bertindak sebagai agen penindas di peringkat penggalakan dan kemaraan bagi menghalang sel yang telah mengalami mutasi serta kerosakan DNA daripada

terus berproliferasi dan bertukar ke bentuk malignan (Surh 1999). Antioksidan telah dikenalpasti sebagai bahan kemopreventif. Antioksidan yang boleh terhasil semulajadi di dalam tubuh (antioksidan endogenus) atau diperolehi melalui diet (antioksidan eksogenus) dapat menghalang atau melambatkan kerosakan sel atau tisu akibat proses pengoksidaan dan penghasilan radikal bebas (Shahidi 1997). Produk asli daripada alam semulajadi antaranya tumbuh-tumbuhan dan mikroorganisme telah dikenalpasti sebagai sumber antioksidan eksogenus yang amat baik seperti ginkgo biloba, spirulina, halia dan kunyit (Bonham et al. 2002). Kini, satu lagi tumbuhan semulajadi ditemui, iaitu mikroalga Chlorella vulgaris (ChV) yang mengandungi hampir kesemua zat makanan yang diperlukan oleh manusia dan berpotensi mencegah pelbagai jenis penyakit (Choo & Choo 2004). Kandungan klorofilnya yang tinggi memberi warna hijau dan bau seperti rumput kepada alga unisel ini (Choo & Choo 2004). Selain tinggi kandungan klorofil, ChV juga mengandungi protein, vitamin, kalsium, magnesium, mineral, asid nukleik, asid amino, enzim, faktor pertumbuhan chlorella (Chlorella Growth Factor, CGF), dan bahan-bahan aktif yang lain (Lau et al. 1992; Cook et al. 1963). Selain itu ia juga mengandungi komponen antioksidan yang tinggi seperti karotenoid, astaxantin, kantaxantin, flavoxantin, loraxantin, neoxantin and violaxantin dan juga sebatian fenolik seperti salisilik, trans sinamik, klorogenik, kimik dan asid kafeik (Hasegawa et al. 2000). ChV banyak dikaji kepentingannya dalam bidang perubatan seperti perangsang sistem imun (Hasegawa et al. 1990; Hasegawa et al. 1997), mengurangkan alergi dan asma (Kralovec et al. 2005), mengurangkan risiko menghidap diabetes atau kencing manis (Cherng & Shih 2005; Cherng & Shih 2006), mengurangkan risiko mendapat penyakit jantung atau aterosklerosis (Yamaghisi et al. 2005), anti-inflamatori (Park et al. 2005), dan sebagai agen antikanser (Tanaka et al. 1990; Morimoto et al. 1995). Tanaka et al. (1998) mendapati Chlorella vulgaris mempunyai sejenis glikoprotein yang bersifat antimetastasis ke atas mencit teraruh fibrosarkoma. Glikoprotein tersebut dikatakan mampu menggalakkan migrasi sel T ke kawasan tumor dan seterusnya membunuh sel-sel kanser yang ada di kawasan tumor tersebut (Hasegawa et al. 1990). Dalam kajian ini, kebolehan ChV bertindak sebagai antioksidan dikaji melalui asai pengautan radikal bebas, manakala sifat antitumornya ditentukan secara in vivo dan in vitro dengan mengukur kadar proliferasi dan apoptosis pada sel kanser hepar.

BAHAN DAN KAEDAH

PENGKULTURAN ALGA CHLORELLA VULGARIS DAN PENYEDIAAN EKSTRAK AIR PANAS

Chlorella vulgaris Beijerinck (strain 072, University of Malaya Algal Culture Collection, Kuala Lumpur) dikultur

775

secara steril di dalam Bold’s Basal Media (BBM) dalam keadaan kitar 12 jam cerah dan 12 jam gelap di dalam kebuk yang dipasangkan lampu berpendafluor. ChV yang telah mencapai tahap pertumbuhan yang maksimum diasingkan daripada media BBM secara pengemparan pada 4000 rpm selama lima minit (IEC, HN-S Centrifuge). Untuk kajian in vivo, ChV yang telah diempar ini (ChV mentah) diberi kepada tikus manakala ekstrak air panas ChV pada kepekatan 10% berat/isipadu digunakan untuk kajian in vitro. Untuk menyediakan ekstrak air panas, ChV yang telah diempar dikeringbekukan (LABCONCO FreeZone 12) untuk memperolehi serbuk ChV. Sebanyak 10 g serbuk ChV dilarutkan dengan 100 ml air suling dan dididihkan selama 20 minit dengan menggunakan refluks. Setelah dibiarkan sejuk pada suhu bilik, ekstrak air panas diempar dan supernatannya diambil sebagai sampel.

PENENTUAN AKTIVITI ANTIOKSIDAN

Untuk mengkaji keupayaan C. vulgaris sebagai antioksidan, asai pengautan radikal bebas DPPH (2,2-difenil-2-pikrilhidrazil hidrat) telah dijalankan (Lu et al. 2000 dan Lai et al. 2001). Sebanyak 200 µl sampel pada julat kepekatan 0.62-4.96 mg/ml dicampurkan dengan 800 µl larutan penimbal Tris-HCl 100 mM (pH 7.4) dan seterusnya ditambahkan dengan 1 ml DPPH 500 µM. Air suling dijadikan sebagai kawalan manakala asid askorbik pada julat kepekatan 0.04-1.28 mg/ml digunakan sebagai piawai. Campuran ini dilarutkan dan dibiarkan pada suhu bilik dalam keadaan gelap selama 20 minit. Absorbans larutan ini diukur menggunakan spektrofotometer pada jarak gelombang 517 nm (Shimadzu UV160-A).

PENENTUAN KESAN ANTITUMORKAJIAN IN VIVO HAIWAN DAN DIET

Untuk mengkaji kesan C. vulgaris ke atas kanser hepar secara in vivo, 142 ekor tikus jantan albino Wistar (lingkungan berat 200-250 g) berusia sekitar 3-4 bulan telah digunakan. Tikus perlakuan ini diperolehi daripada Unit Haiwan Universiti Kebangsaan Malaysia setelah kajian ini mendapat kelulusan daripada Jawatankuasa Etika Penggunaan Haiwan UKM (UKMAEC) (Nombor Kelulusan UKMAEC: BIOK/2002/YASMIN/30-SEPTEMBER/082). Tikus ditempatkan di dalam bilik yang mempunyai pencahayaan dan pengudaraan yang sempurna pada suhu 32 ± 2°C di rumah haiwan di Institut Penyelidikan Perubatan Kuala Lumpur, Malaysia (IMR). Tikus dibahagikan kepada lapan kumpulan utama (enam ekor setiap kumpulan) iaitu kumpulan yang diberi diet normal (Gold Coin, Malaysia) dan air minuman secara ad libitum sebagai kawalan (empat ekor), enam tikus yang diaruh kanser hepar (Akhurst et al. 2001) yang diberi diet karsinogen iaitu diet kurang kolin (choline deficient diet) dalam bentuk pelet bersama 0.1% karsinogen etionin (SIGMA, AS) di dalam air minuman yang juga diberi secara ad libitum (kumpulan kanser ini dikenali sebagai kumpulan CDE (CDE= Choline deficient diet with ethionine)), tikus yang diberi ChV mentah pada

tiga dos berbeza sebanyak 50, 150 dan 300 mg/kg berat badan (dilabelkan ChV50, ChV150 dan ChV300) dan kumpulan CDE diberi rawatan ChV mentah pada tiga dos berbeza sebanyak 50, 150 dan 300 mg/kg berat badan (dilabelkan CDE+ChV50, CDE+150 dan CDE+300). Tempoh kajian dijalankan adalah selama 12 minggu yang mana tikus dibunuh pada empat, lapan dan 12 minggu kajian dilakukan. Empat ekor tikus dibunuh serta-merta tanpa menjalani sebarang protokol eksperimen bagi mewakili minggu 0.

PENENTUAN PROLIFERASI SEL PELABELAN BrdU DAN PENGESANAN IMUNOHISTOKIMIA

Pelabelan BrdU dan pengesanan imunohistokimia hepatosit yang berproliferasi dijalankan mengikut arahan pengeluar (DAKO, AS). Tikus disuntik dengan BrdU (100 mg/kg berat) 24 jam sebelum dibunuh. Tisu hepar dihiris dan direndam dalam formalin 10% serta dibenamkan di dalam lilin parafin. BrdU yang diinkorporasikan ke dalam DNA yang baru disintesis dikesan menggunakan antibodi monoklonal khusus terhadap BrdU. Hirisan tisu dilekapkan pada slaid bersalut, dinyahparafin dalam siri alkohol dan dihidrat semula. Kemudian, slaid dieram dalam H2O2 3% selama 5 min untuk menghalang aktiviti peroksidase endogenus. Selepas dibasuh beberapa kali dengan TBS (pH 7.4), tisu diperlakukan dengan Target Retrieval High pH pada 98°C selama 20 min. Anti-BrdU tikus primer (DAKO, AS) kemudiannya diaplikasikan selama 30 min pada 37°C dengan pencairan 1:100. Tisu dibasuh dengan ‘larutan salin penimbal Tris’ TBS (pH 7.4) sebelum diperlakukan dengan antibodi anti-tikus arnab sekunder terkonjugat horse radish peroxidase (HRP) (1:100) selama 30 min. Akhir sekali, tisu dicuci, diwarnakan dengan diaminobenzidin (DAB, Sigma, St Louis, MO) dan H&E. Indeks proliferasi dinilai pada pembesaran 400× dalam 10 kawasan yang mempunyai sekurang-kurangnya 1000 sel setiap kawasan.

PENENTUAN APOPTOSIS SEL HEPAR TIKUSASAI TUNEL

Asai TUNEL (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-end Labeling) digunakan untuk mengenalpasti fragmentasi DNA dwibebenang yang merupakan ciri degradasi DNA oleh apoptosis. Kit pengesanan TUNEL (Promega, AS) digunakan menurut arahan pengeluar. Hirisan tisu dilekapkan pada slaid yang bersalut, dinyahparafin dalam siri alkohol bergred, dihidrat semula dan dipralakukan dengan proteinase K (20 ug/ml) selama 15 min pada 37°C. Setelah aktiviti peroksidase endogenus dihentikan dengan 3% H2O2 dan dibilas dengan TBS, terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) kemudian diaplikasikan selama 1 jam pada 37°C dalam Biotynylated Nucleotide Mix, dan penimbal penyeimbangan (Tris asetat, pH 7.9, 50 mmol/L kalium asetat, 10 mmol/L magnesium asetat, 1 mmol/L ditiotreitol, 0.25 mmol/L CoCl2, 24 µmol/L biotin-dATP). Kemudian, tisu dihalang

776

dengan Penimbal Henti/Basuh dan dieram dengan 100 µl Streptavidin HRP (1:500) selama 30 minit pada suhu bilik. Selepas beberapa kali dibasuh dengan TBS (pH 7.4), slaid diwarnakan dengan diaminobenzidin (DAB) (Sigma, St Louis, MO) dan H&E. Indeks apoptosis dinilai pada pembesaran 400× dalam 10 kawasan yang mempunyai sekurang-kurangnya 1000 sel setiap kawasan.

KAJIAN IN VITROASAI PROLIFERASI SEL

Sel HepG2 diplatkan secara seragam dalam plat mikrotiter 96 telaga pada kepekatan 2 × 104 sel setiap telaga. Selepas 24 jam eraman, sel diperlakukan dengan ekstrak air panas ChV dan dieram lagi selama 24 jam. Sel dilabel dengan BrdU semasa 3 jam terakhir rawatan dengan ekstrak ChV. Sel direndam dengan larutan denat dan penggabungan BrdU dikesan dengan tindak balas imuno. Selepas larutan substrat ditambah ke dalam setiap telaga, jumlah BrdU yang tergabung ditentukan dengan mengukur absorban pada dua jarak gelombang 450/690 nm menggunakan spektrofotometer pengimbas multi telaga (pembaca ELISA).

ASAI APOPTOSIS SEL MELALUI ASAI TUNEL

Kematian sel secara apoptosis ditentukan dengan Dead End TM Colorimetric TUNEL System (Promega, AS). Selepas perlakuan dengan ekstrak ChV selama 24 jam, sel yang terapung serta sel yang melekat dikumpulkan di dalam tiub, ditripsin, diempar dan dibasuh dengan penimbal ‘larutan salin penimbal fosfat’ PBS. Sel dilekapkan pada slaid yang disaluti poli-L-lisin, dan dikeringkan. Sel ditetapkan dengan merendamnya di dalam formalin 4% dalam PBS selama 25 minit pada suhu bilik. Selepas dibasuh dengan penimbal PBS, sel ditelapkan dengan menenggelamkan slaid di dalam larutan Triton® X-100 0.2% selama 5 minit pada suhu bilik. Sel kemudiannya diseimbangkan dengan 100 µl Penimbal Penseimbangan selama 7 minit. Kawasan yang diseimbangkan dipekap dengan kertas tisu sebelum biotinylated nucleotide dan campuran tindak balas TdT (100 µl) ditambah ke atas slaid. Slaid ditutup dengan sisip kaca untuk memastikan penyebaran reagen yang sekata sebelum dieram pada 37°C selama 60 minit di dalam kebuk lembap. Sisip kaca ditanggalkan dan slaid ditenggelamkan dalam penimbal SSC (natrium klorida 0.15M, trinatrium sitrat 0.015M) 2× selama 15 minit pada suhu bilik, dan dibasuh dua kali dengan PBS. Peroksidase endogenus dihalang dengan membenamkan slaid di dalam hidrogen peroksida 0.3% selama 4 minit pada suhu bilik dan dibasuh sekali lagi dengan PBS. Larutan Streptavidin Horse Radish Peroxidase (HRP) (1:500 dalam PBS) ditambah kepada setiap slaid dan dieram selama 30 minit pada suhu bilik. Selepas basuhan terakhir dengan PBS, larutan diaminobenzidin (DAB) ditambah kepada slaid selama 20 minit sehingga warna perang muda kelihatan. Akhir sekali, slaid ditutup dengan sisip kaca menggunakan DPX sebelum hasilnya dilihat di bawah mikroskop cahaya dan dianalisis menggunakan penganalisis imej (Zeiss, Jerman).

PENGUKURAN P53, BAX DAN KASPASE 3 MELALUI PEMBLOTAN WESTERN

Sel HepG2 (1×107/piring petri) disemai di dalam piring petri 9 cm dan diperlakukan dengan pelbagai kepekatan ekstrak air panas CHV selama 2, 6, 12, 18 dan 24 jam. Kemudian, sel dieram dalam penimbal lisis RIPA (50 mM Tris–HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 20 mM NaF, 100 mM Na3VO4, 1% NP-40, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Leupeptin) dalam ais selama 30 minit untuk melisiskan sel. Selepas pengemparan, jumlah protein ditentukan dengan kit asai protein Bradford (Biorad, AS). 50 µg protein diresolusikan oleh 10-15% SDS-PAGE dan dipindahkan kepada membran Polivinil PVDF. Membran dihalang dengan penimbal penghalang (susu skim 5% dalam Tween 20 1% dalam salin penimbal Tris 20 mM, pH 7.5) dengan eraman 1 j pada suhu bilik, diikuti eraman dengan antibodi primer yang sesuai iaitu P53, BAX dan Kaspase 3 (Chemicon Int., AS) pada pencairan 1:1000 dalam penimbal penghalang selama 2 jam pada suhu bilik. Membran kemudiannya dieram dengan antibodi sekunder masing-masing selama 1 jam. Antigen dikesan dengan menggunakan sistem pengesanan pemblotan kimipendarcahaya dipertingkatkan (enhanced chemiluminiscence) (Amersham, AS).

HASIL DAN PERBINCANGAN

AKTIVITI ANTIOKSIDAN CHV

Keupayaan ekstrak air panas ChV dan dua jenis piawai iaitu asid askorbik dan hidroksitoluena terbutil (BHT) mengaut radikal bebas DPPH ditunjukkan di dalam Rajah 1. Daripada rajah ini, didapati larutan piawai BHT menunjukkan peratus pengautan tertinggi, diikuti oleh ekstrak air panas ChV dan asid askorbik. Ekstrak air panas ChV yang disediakan pada empat kepekatan, iaitu 0.62, 1.24, 2.48 dan 4.96 mg/ml menunjukkan peratus pengautan yang tinggi, iaitu dalam lingkungan 88.54 - 90.57%. Namun, nilai peratusannya tidak meningkat selaras dengan peningkatan kepekatan ekstrak yang digunakan, tetapi mendatar selepas mencapai tahap pengautan maksimum, iaitu pada 1.24 mg/ml. Secara keseluruhannya, hasil eksperimen ini menunjukkan bahawa ekstrak air panas ChV mempunyai sifat antioksidan berdasarkan keupayaannya mengaut radikal bebas DPPH yang hampir setara dengan BHT.

KESAN CHV KE ATAS PEMBENTUKAN NODUL PRANEOPLASIA

Rajah 2a menunjukkan tiada pembentukan nodul praneoplasia pada kumpulan tikus kawalan dan kumpulan tikus yang diberi ChV mentah pada dos 300 mg/kg (Rajah 2b). Pembentukan nodul praneoplasia dikesan pada hepar kumpulan tikus yang diaruh dengan kanser hepar (Rajah 2c). Namun, kehadiran nodul praneoplasia didapati berkurangan pada kumpulan tikus CDE yang diberikan ChV mentah (300 mg/kg), dan saiznya didapati mengecil

777

dan berukuran kurang daripada 0.1 cm (Rajah 2d). Jadual 1 menunjukkan kehadiran kanser hepar dalam tikus CDE (100%) selepas 12 minggu dalam lingkungan saiz 0.1 – 0.5 cm diameter. Kehadiran kanser hepar ini lebih ketara pada minggu 12 berbanding minggu 8. Bilangan kanser hepar menurun secara signifikan apabila ChV pada dos yang lebih tinggi diberi kepada tikus, iaitu pengurangan kepada 67%, 33% dan 17% pada 50, 150 dan 300 mg/kg berat badan masing-masing (Jadual 1).

KESAN CHV KE ATAS PROLIFERASI DAN APOPTOSIS SEL KANSER HEPAR TIKUS

Proliferasi dan apoptosis hepatosit masing-masing diukur menggunakan pelabelan BrdU dan asai TUNEL. Pewarnaan BrdU menunjukkan taburan sel yang mengalami proliferasi yang tidak jauh berbeza dan hampir sama antara kumpulan tikus kawalan (Rajah 3a) dengan kumpulan tikus diberi 300 mg/kg ChV mentah (Rajah 3b). Kumpulan tikus yang diaruh kanser hepar melalui pemberian diet CDE mempamerkan

(a) (b)

(c) (d)

RAJAH 2. Kesan Chlorella vulgaris (ChV) ke atas morfologi hepar tikus diaruh kanser hepar. Hepar kumpulan tikus kawalan, diet asas tikus normal (a), hepar kumpulan tikus diberi ChV pada dos 300 mg/kg (ChV300) (b), hepar kumpulan

tikus diaruh kanser, diet kurang kolin bersama 0.1% etionin dalam air minuman (CDE) (c), dan hepar kumpulan tikus CDE diberi ChV pada dos 300 mg/kg (CDE+ChV300) (d). Kelihatan nodul

praneoplasia berwarna putih-kuning (anak panah) pada hepar kumpulan tikus CDE

Kepekatan (mg/ml)

Pera

tus p

enga

utan

(%)

RAJAH 1. Peratus pengautan radikal bebas DPPH (2,2-difenil-2-pikrilhidrazil hidrat) oleh ekstrak air panas Chlorella vulgaris, BHT dan asid askorbik. Data dinyatakan sebagai min ± sisihan

piawai tiga eksperimen yang berasingan

BHTAsid askorbikChlorella vulgaris

778

taburan sel yang mengalami proliferasi yang tinggi (Rajah 3c). Kadar proliferasi yang tinggi adalah salah satu ciri sel tumor. Berlaku pengurangan taburan sel yang mengalami proliferasi pada tikus CDE yang diberi rawatan 300 mg/kg ChV (Rajah 3d). Secara keseluruhannya, tikus kawalan tidak menunjukkan sebarang perubahan peratus sel yang mengalami proliferasi tetapi tikus CDE mempamerkan peningkatan peratus proliferasi sel yang signifikan (p<0.05). Penurunan signifikan (p<0.05) peratus proliferasi sel berlaku pada tikus CDE yang diberi 150 mg/kg ChV dan 300 mg/kg ChV berbanding tikus CDE tanpa rawatan (Rajah 4). Daripada pewarnaan TUNEL, tikus kawalan dan tikus diberi 300 mg/kg ChV menunjukkan taburan sel mengalami apoptosis yang hampir sama (Rajah 5a & 5b). Taburan sel yang mengalami apoptosis meningkat pada tikus CDE (Rajah 5c), tetapi apabila diberi rawatan 300 mg/kg ChV, apoptosis meningkat dengan lebih tinggi (Rajah 5d). Daripada Rajah 6, didapati apoptosis berlaku dalam kumpulan CDE namun apabila dirawat dengan ChV (300 mg/kg) kadar apoptosis meningkat lebih tinggi. Kadar apoptosis dalam semua kumpulan ChV adalah sama dengan kumpulan kawalan yang menunjukkan kadar apoptosis yang rendah, merupakan satu proses fisiologi yang normal. Ini menunjukkan kesan ChV sebagai bahan antitumor.

Kumpulan/Minggu Minggu Perlaksanaan

4 8 12

Kawalann = 4

0 0 0

CDEn = 6

83 100 100

ChV50 n = 6

0 0 0

ChV150 n = 6

0 0 0

ChV300 n = 6

0 0 0

CDE+ChV50 n = 6

83 83 67

CDE+ChV150n = 6

83 50 33

CDE+ChV300n = 6

67 33 17

CDE = Tikus diaruh kanser hepar (diet kurang kolin + 0.1% etionin dalam air minuman)ChV50, ChV150 dan ChV300 = Tikus yang diberi Chlorella vulgaris pada dos 50, 150 dan 300 mg/kg berat badan CDE+ChV50, CDE+ChV150 dan CDE+ChV300 = Tikus diaruh kanser hepar yang diberi Chlorella vulgaris pada dos 50, 150 dan 300 mg/kg berat badan

JADUAL 1. Kesan Chlorella vulgaris ke atas jumlah nodul praneoplasia (%) pada tikus diaruh kanser hepar

(a) (b)

RAJAH 3. Pewarnaan BrdU untuk penentuan proliferasi sel pada tisu hepar tikus kawalan (a), tikus ChV300 (b), tikus CDE (c) dan tikus CDE+ChV300 (d). Anak panah menunjukkan

nukleus sel yang mengalami proliferasi (× 400)

(c) (d)

(a) (b)

779

RAJAH 4. Proliferasi sel (%) antara kumpulan tikus perlakuan mengikut minggu berbeza. Data adalah min ± S.E.M. Abjad menunjukkan perbandingan yang dilakukan antara kumpulan tikus perlakuan berbeza pada minggu yang sama

eksperimen dijalankan. Nombor menunjukkan perbandingan yang dilakukan antara tempoh eksperimen berbeza pada kumpulan tikus perlakuan yang sama. a = signifikan (p<0.05) berbanding kawalan, b = signifikan

(p<0.05) berbanding CDE, c = signifikan (p<0.05) berbanding ChV50, d = signifikan (p<0.05) berbanding ChV150, e = signifikan (p < 0.05) berbanding ChV300, 1 = signifikan (p<0.05)

berbanding minggu 4, 2 = signifikan (p<0.05) berbanding minggu 8

RAJAH 5. Pewarnaan asai TUNEL untuk penentuan apoptosis sel pada hepar tikus kawalan (a), tikus ChV (b), tikus CDE (c) dan tikus CDE+ChV300 (d). Anak panah menunjukkan

nukleus sel yang mengalami apoptosis (× 400)

(a) (b)

(c) (d)

780

Hasil daripada kajian ini mendapati tikus yang diaruh kanser hepar (CDE) menunjukkan kadar proliferasi sel dan apoptosis yang lebih tinggi berbanding tikus kawalan dan tikus yang diberi ChV. Pertambahan aras radikal bebas atau spesies oksigen reaktif (ROS) akibat daripada kemasukan bahan-bahan karsinogen kimia di dalam badan boleh membawa kepada peningkatan tekanan oksidatif dan menyebabkan wujudnya penyakit berbahaya seperti kanser (Fang et al. 2002). Kajian yang dilakukan ke atas tikus teraruh kanser membuktikan bahawa ROS yang terhasil akibat proses karsinogenesis membentuk ikatan kovalen dengan bes DNA dan menghasilkan aduk DNA yang seterusnya membawa kepada kerosakan serta kemutagenan pada struktur DNA tersebut (Tessitore 2000). Apoptosis atau kematian sel secara terancang adalah salah satu komponen penting dalam pertumbuhan serta pengawalan homeostasis untuk fungsi normal badan dan juga salah satu respon tubuh terhadap sesuatu keadaan patologi seperti kanser (Ledda-Columbano & Columbano 1991; Holland & Frei 2000; Zakeri & Lockshin 2002). Kematian sel secara terancang atau apoptosis ini amat diperlukan untuk menyingkirkan sel termutasi yang mengalami kerosakan DNA bagi mengurangkan pembentukan lesi praneoplasia seperti yang berlaku pada kanser hepar (Schulte-Hermann et al. 1995). Kadar proliferasi dan apoptosis sel didapati meningkat daripada lesi yang bersifat fokus, adenoma dan seterusnya karsinoma pada hepar tikus yang disebabkan oleh kerosakan oksidatif DNA akibat mutasi genetik, pemecahan ikatan rantaian serta perubahan pada kromosom (Schulte-Hermann et al. 1995; Jia et al. 2002). Penyataan ini selaras dengan hasil penemuan yang didapati daripada kajian ini yang

mendapati tikus CDE menunjukkan kadar apoptosis sel yang lebih tinggi berbanding tikus kawalan. Proliferasi sel memainkan peranan penting dalam proses pemulaan serta penggalakan karsinogenesis, maka pengawalan terhadap kadar peningkatan proliferasi sel tumor ini amatlah penting dalam menghalang daripada berlakunya kanser (Mori et al. 1999). Apoptosis pula sangat diperlukan untuk memusnahkan sel kanser dan mengembalikan keseimbangan proses penghasilan serta pertumbuhan sel tubuh ke tahap yang lebih normal (Zakeri & Lockshin 2002). Kajian ini juga menunjukkan pada tikus CDE yang diberi ChV, kadar proliferasi sel didapati menurun manakala kadar apoptosis sel pula didapati meningkat dengan signifikan terutamanya pada tikus CDE yang diberi ChV pada dos yang lebih tinggi (300 mg/kg berat badan) berbanding tikus CDE. Berdasarkan hasil kajian ini, didapati ChV mempunyai kesan antitumor terhadap tikus yang diaruh kanser hepar.

KAJIAN IN VITRO KESAN EKSTRAK AIR PANAS ChV KE ATAS PROLIFERASI SEL HepG2

Ekstrak air panas ChV merencat pertumbuhan sel hepatoma manusia, HepG2 (Rajah 7) secara berkadar terus dengan dos yang mana nilai IC50 dicatatkan pada 1.6 mg/ml. Perencatan proliferasi sel HepG2 mencapai 100% pada kepekatan 4 mg/ml. Suatu agen kemopreventif yang baik sering dikaitkan dengan kebolehannya merencat atau memperlahankan proses karsinogenesis. ChV mempamerkan aktiviti antioksidan yang tinggi berbanding mikroalga lain (Rodriguez-Garcia & Guerrero 2008). Kesan antiproliferasi kebanyakan agen diet dalam sel kanser telah dikaitkan dengan bahan fitokimia yang

RAJAH 6. Apoptosis sel (%) antara kumpulan tikus perlakuan mengikut minggu berbeza. Data adalah min ± S.E.M. Abjad menunjukkan perbandingan yang dilakukan antara kumpulan tikus perlakuan berbeza pada minggu yang

sama eksperimen dijalankan. Manakala nombor menunjukkan perbandingan yang dilakukan antara tempoh eksperimen berbeza pada kumpulan tikus perlakuan yang sama. a = signifikan (p<0.05)

berbanding kawalan, b = signifikan (p<0.05) berbanding CDE, c = signifikan (p<0.05) berbanding ChV50, d = signifikan (p<0.05) berbanding ChV150, e = signifikan (p < 0.05) berbanding ChV300, 1 = signifikan (p<0.05) berbanding minggu 4

781

terkandung dalam bahan semulajadi yang mempunyai aktiviti antioksidan yang tinggi (Khan et al. 2007). Walau bagaimanapun, tindakan antiproliferasi ChV berkemungkinan besar disumbangkan oleh sebatian aktif yang dikenalpasti sebagai glikoprotein berasid, yang telah dibuktikan mempunyai ciri antitumor terhadap mencit teraruh tumor (Konishi et al. 1985, Hasegawa et al. 2002, Noda et al. 1996 )

KESAN ChV KE ATAS APOPTOSIS MELALUI ASAI TUNEL

Kajian terdahulu menunjukkan banyak sebatian dietari mempamerkan kesan apoptosis dengan cara mensasarkan molekul pengisyaratan (Khan et al. 2007). Ini bertujuan untuk menghindar atau melindungi sel daripada kerosakan yang lebih teruk atau transformasi kepada sel kanser. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 8, pengaruhan apoptosis dalam sel HepG2 oleh ekstrak air panas ChV jelas kelihatan melalui nukleus yang mengecut dan membran plasma yang mengalami ‘blebbing’, iaitu ciri-ciri

lazim jasad apoptotik (Bortner, 1995). Pada kepekatan 2 mg/ml ekstrak ChV, 70% sel HepG2 mengalami apoptosis (Rajah 9).

KESAN ChV KE ATAS PROTEIN TAPAKJALAN APOPTOSIS DALAM SEL HEPG2 MELALUI ANALISIS

PEMBLOTAN WESTERN

Untuk menyelidik mekanisme apoptosis yang diaruhkan oleh ChV, kami mengukur pengekspresan dan aktiviti protein penindas tumor, P53 serta protein proapoptosis dalam tapakjalan mitokondria, BAX dan Kaspase 3. Hasil kajian menunjukkan aras protein P53 meningkat secara berkadar terus dengan dos, yang mana pengaruhan maksimum dicapai selepas 2 jam (Rajah 10) pada kepekatan 2 mg/ml ekstrak ChV. Perlakuan dengan ChV juga meningkatkan pengekspresan BAX secara berkadar terus dengan masa. Kesan ekstrak ChV ke atas protein efektor tapakjalan apoptosis Kaspase 3 juga dinilai dan didapati meningkat berkadar terus dengan dos selepas 24

RAJAH 7. Perubahan kadar proliferasi sel HepG2 dengan perlakuan pelbagai dos ekstrak air panas Chlorella vulgaris selama 24 jam menggunakan kedah asai BrdU. Kesemua dos perlakuan

yang menunjukkan perubahan yang signifikan (p<0.05) ditandakan *

RAJAH 8. Pengesanan apoptosis dengan kaedah asai TUNEL dan pewarnaan dengan DAB terhadap sel HepG2 dengan perlakuan pelbagai dos ekstrak air panas ChV. Nota: (a) Sel normal (N) HepG2 menujukkan morfologi nukleus normal dengan saiz

sel yang lebih besar. (b) Sel HepG2 yang dirawat dengan 2 mg/ml ekstrak ChV menunjukkan nukleolus diwarnakan perang tua dengan kondensasi kromatin yang bertaburan pada periferi nukleus ditandakan a. (c) Hampir 75%

sel mengalami apoptosis setelah diberi rawatan 4 mg/ml ekstrak air panas ChV

(a) (b) (c)

782

jam rawatan. Hasil kajian ini mencadangkan bahawa ChV memperantarai apoptosis melalui P53. Maka, hasil kajian kami menunjukkan bahawa dalam sel yang diperlakukan dengan ekstrak air panas ChV, aras protein keluarga Bcl-2 khususnya bax dan protein efektor tapak jalan apoptosis, kaspase 3 mengalami perubahan. Pengaruhan apoptosis telah dikenalpasti sebagai strategi terapi kanser yang berkesan. Pelbagai ubatan herba Cina seperti Ganoderma lucidum (Hu et al. 2002), Rubus coreanum (Kim et al. 2005), Paeoniae Radix (Lee et al. 2002) dan Phyllanthus urinaria (Huang et al. 2003) masing-masing telah menunjukkan kebolehan mencetuskan tapakjalan apoptosis dalam sel kanser payudara MCF-7, sel kanser kolon manusia HT-29, sel hepatoma manusia HepG2 dan sel karsinoma paru-paru Lewis. Apoptosis dikawalatur oleh protein efektor antiapoptosis dan proapoptosis. Protein proapoptosis dan antiapoptosis keluarga Bcl-2 bertindak sebagai reostat dalam pengawalaturan kematian terancang, serta menjadi sasaran dalam terapi antikanser (Goodsell 2002). Nisbah antagonis kematian (Bcl-2, Bcl-xL) kepada agonis (bax, bcl-xs, bad, bid) menentukan sama ada sel akan bertindak balas kepada rangsangan apoptosis atau pun tidak. Pengawalaturan turun protein penindas kematian Bcl-2 boleh menekan pertumbuhan tumor dengan cara menggalakkan kematian terancang (Kluck et al. 1997; Zhivotovsky et al. 1998). Sebagai suatu ekstrak herba, ChV mengandungi pelbagai sebatian yang boleh bertindak melalui pelbagai tapakjalan pertumbuhan dan kemandirian sel tumor. P53 jenis liar telah dikenalpasti sebagai pengawalatur naik penggalak gen bax yang mengandungi tapak pengikatan P53, yang boleh diaktifkan secara langsung oleh P53 jenis liar (May & May 1999). Umumnya, isyarat apoptosis dipercayai diperantarakan oleh pengaktifan suatu hierarki kaspase yang dikawal oleh satu daripada dua tapakjalan utama yang dikaitkan dengan kaspase-8 atau kaspase-9. Daripada ini, kaspase-kaspase pemula bertumpu kepada kaspase efektor utama, iaitu kaspase 3 dan 7. Dalam kebanyakan model yang dikaji, kaspase 3

RAJAH 9. Perubahan kadar apoptosis sel HepG2 dengan perlakuan pelbagai dos ekstrak air panas ChV. * menunjukkan perubahan % sel apoptotik yang signifikan (p<0.05) berbanding kawalan

RAJAH 10. Ekstrak air panas ChV pada 2 mg/ml (dos optimum) mengaruh pengekspresan protein P53 (A), BAX (B) (proapoptosis) dan Kaspase 3 (C) yang lebih tinggi

dalam sel HepG2 berbanding sel kawalan selepas 24 jam perlakuan

dan 7 (Liu et al. 1997, Chowdhury et al. 2008) didapati menjadi protease efektor yang bertanggungjawab ke atas manifestasi morfologi apoptosis. Kaspase 3 disintesis sebagai proenzim tak aktif 33 kDa yang memerlukan pengaktifan proteolitik. Hasil kajian kami menunjukkan kehadiran proenzim kaspase 3 pada aras yang tinggi dalam sel tumor yang tidak dirawat, tetapi aras kaspase 3 aktif

783

meningkat secara beransur-ansur selepas rawatan dengan ChV. Ini mencadangkan bahawa ekstrak air panas ChV mengaruh apoptosis melalui mekanisme yang bergantung kepada kaspase 3 (Rajah 10).

KESIMPULAN

Chlorella vulgaris (ChV) mempamerkan sifat antioksidan berdasarkan keupayaannya mengaut radikal bebas DPPH pada peratusan yang tinggi. Kesan antitumornya secara in vivo pula dibuktikan melalui tikus yang diaruh kanser hepar yang mana ChV berjaya mengurangkan pembentukan tumor hepar, proliferasi sel tumor dan mengaruh apoptosis. Keputusan yang sama didapati berlaku pada kajian in vitro yang menunjukkan bahawa ekstrak air panas ChV berjaya menurunkan kadar proliferasi serta mengaruh apoptosis sel selanjar kanser hepar yang dibuktikan dengan pengekspresan protein proapoptosis. Ini mendorong kami membuat rumusan bahawa mekanisme kemopreventif ChV ialah melalui perencatan proliferasi dan pengaruhan apoptosis yang mungkin diperantarai oleh P53, BAX dan Kaspase 3. Kajian ini mirip dengan banyak kajian lain yang menunjukkan sifat kemopreventif berkait rapat dengan kesan sesuatu bahan semulajadi mengaruh apoptosis.

PENGHARGAAN

Kajian ini telah dibiayai oleh geran penyelidikan IRPA 06-02-02-0023/PR0008/09-08.

RUJUKAN

Akhurst, B., Croager, E.J., Farley-Roche, C.A., Ong J.K., Dumble, M.L., Knight, B. & Yeoh, G.C. 2001. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology 34: 519-522.

Bonham, M., Arnold, H., Montgomery, B. & Nelson, P.S. 2002. Molecular effects of the herbal compound PC-SPES: identification of activity pathways in prostate carcinoma. Cancer Research 62: 3920-24.

Bortner, C.D., Oldenburg, N.B.E. & Cidlowski, J.A. 1995. Trends in Cell Biology 5: 21-26

Cherng, J-Y. & Shih, M-F. 2005. Potential hypoglycemic effects of Chlorella in streptozotocin-induced diabetic mice. Life Sciences 77(9): 980-990.

Cherng, J-Y. & Shih, M-F. 2006. Improving glycogenesis in Streptozocin (STZ) diabetic mice after administration of green algae Chlorella. Life Sciences 78: 1181-1186.

Choo, T.C. & Choo, H.L. 2004. Chlorella Nature’s Miraculous Gift to Mankind. Selangor: Uniwellness Resources.

Chowdhury, I., Tharakan, B. & Bhat, G.K. 2008. Caspases - An update. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B. 51: 10-27.

Cook, B.B., Lau, E.W. & Baily, B.M. 1963. The protein quality of waste-grown green algae. Quality of protein in mixtures of algae, nonfat powdered milk, and cereals. Journal of Nutrition 81: 23-29.

De Flora, S. & Ferguson, L.R. 2005. Overview of mechanisms of cancer chemopreventive agents. Mutation Research 591: 8-15.

Fang, Y.Z, Yang, S. & Wu, G. 2002. Free Radicals, Antioxidant, and Nutrition. Nutrition 18: 872-879.

Goodsell, D.S. 2002. The molecular perspective: Bcl-2 and apoptosis. Stem Cells 20(4): 355–356.

Hasegawa, T., Kimura, Y., Hiromatsu, K., Kobayashi, N., Yamada, A., Makino, M., Okuda, M., Sano, T., Nomoto, K. & Yoshikai, Y. 1997. Effect of hot water extract of Chlorella vulgaris on cytokine expression patterns in mice with murine acquired immunodeficiency syndrome after infection with Listeria monocytogenes. Immunopharmacology 35: 273-282.

Hasegawa, T., Matsuguchi, T., Noda, K., Tanaka, K., Kumamoto, S., Shoyama, Y. & Yoshikai, Y. 2002. Toll – like receptor 2 is at least partly involved in the antitumor activity of glycoprotein from Chlorella vulgaris. International Immunopharmacology 2(4): 579-589.

Hasegawa, T., Noda, K., Kumamoto, S., Ando, Y., Yamada, A. & Yoshikai, Y. 2000. Chlorella vulgaris culture supernatant (CHVS) reduces phycological stress - induced apoptosis in thymocytes of mice. International Journal of Immunopharmacology 22: 877-885.

Hasegawa, T., Yoshikai, Y., Okuda, M. & Nomoto, K. 1990. Accelerated restoration of the leukocyte number and augmented resistance against Escherichia coli in cyclophosphamide-treated rats orally administered with a hot water extract of Chlorella vulgaris. International Journal of Immunopharmacology 12(8): 883-891.

Hocman G. 1989. Prevention of cancer: Vegetables and plants. Comparative Biochemistry and Physiology 93B(2): 201-212.

Holland, B.K. & Frei, P.W. 2000. Tumor Growth & Cell Proliferation In Vivo. (accessed online) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=cmed.section. 175 (9 Mac 2006).

Hu, H., Ahn, N.S., Yang, X., Lee, Y.S. & Kang K.S. 2002. Ganoderma lucidum extract induces cell cycle arrest and apoptosis in MCF-7 human breast cancer cell. International Journal of Cancer 102: 250-253.

Huang, S.T., Yang, R.C., Yang, L.J., Lee, P.N. & Pang, J.H.S. 2003. Phylanthus urinaria triggers the apoptosis and Bcl-2 down-regulation in Lewis lung carcinoma cells. Life Sciences 72: 1705-1716.

Jia, G., Tohyama, C. & Sone, H. 2002. DNA damage triggers imbalance of proliferation and apoptosis during development of preneoplastic foci in the liver of Long-Evans Cinnamon rats. International Journal of Oncology 21: 755-761

Khan, N., Afaq, F., Mukhtar, H. 2007. Apoptosis by dietary factors: the suicide solution for delaying cancer growth. Carcinogenesis 28(2): 233-239.

Kim, E.J., Lee, Y.J., Shin, H.K. & Park, J.H.Y. 2005. Induction of apoptosis by the aqueous extract of Rubus coreanum in HT-29 human colon cancer cells. Nutrition 21: 1141-1148.

Klaunig, J.E. & Kamendulis, L.M. 1999. Mechanisms of Cancer Chemoprevention in Hepatic Carcinogenesis: Modulation of Focal Lesion Growth in Mice. Toxicological Sciences 52: 101-106

Kluck, R.M., Bossy-Wetzel, E., Green, D.R., Newmeyer, D.D. 1997. The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science 275 (5303): 1132-1136.

Konishi, F., Tanaka, K., Himeno, K., Taniguchi, K. & Nomoto, K. 1985. Antitumor effect induced by a hot water extract of Chlorella vulgaris (CE): Resistance to Meth-A tumor growth mediated by CE-induced polymorphonuclear leukocytes. Cancer Immunology Immunotherapy 19: 73-78

784

Kralovec, J.A., Power, M.R., Liu, F., Maydanski, E., Ewart, H.S. Watson, L.V., Barrow, C.J. & Lin, T.J. 2005. An aqueous Chlorella extract inhibit IL-5 production by mast cells in vitro and reduces ovalbumin-induced eosinophil infiltration in the airway in mice in vivo. International Immunopharmacology 5: 689-698

Lai, L.S., Chou, S.T. & Chao, W.W. 2001. Studies on the antioxidative activities of hsian-tsao (Mesona procumbens) leaf gum. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49(2): 963-968.

Lau, B.H.S., Lau, E.W. & Yamasaki, T. 1992. Edible plant extracts modulate macrophage activity and bacteria mutagenesis. International Clinical Nutrition Review 12(3): 147.

Ledda-Columbano, G. M. & Columbano, A. 1991. Apoptosis and Hepatocarcinogenesis. Apoptosis: The Molecular Basis of Cell Death. Itali: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Lee, S.M.Y., Li, M.L.Y., Tse, Y.C., Leung, S.C.L., Lee, M.M.S., Tsui, S.K.W., Fung, K.P., Lee, C.Y. & Waye, M.M.Y. 2002. Paeoniae Radix, a Chinese herbal extract, inhibit hepatoma cells growth by inducing apoptosis in a p53 independent pathway. Life Sciences 71: 2267-2277.

Li, R., Hehlmanb, R., Sachsc, R. & Duesberg, P. 2005. Chromosomal alterations cause the high rates and wide ranges of drug resistance in cancer cells. Cancer Genetics and Cytogenetics 163: 44-56.

Lim, G.C.C. & Halimah, Y. 2004. Second Report of National Cancer Registry. Cancer Incidence in Malaysia 2003. Kuala Lumpur: National Cancer Registry.

Liu, X., Zou, H., Slaughter, C. & Wang, X. 1997. DFF, a Heterodimeric Protein That Functions Downstream of Caspase-3 to Trigger DNA Fragmentation during Apoptosis. Cell 89: 175-184.

Llovet, J.M., Burroughs, A. & Bruix, J. 2003. Hepatocellular carcinoma. Lancet 362: 1907-1917.

Lu, Y. R. & Foo, L. Y. 2000. Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace. Food Chemistry 68: 81-85.

May, P. & May, E. 1999. Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein. Oncogene 18(53): 7621-7636.

Mori, H., Sugie, S., Yoshimi, N., Hara, A. & Tanaka, T. 1999. Control of cell proliferation in cancer prevention. Mutation Research 428: 291-298.

Morimoto, T., Nagatsu, A., Murakami, N., Sakakibara, J., Tokuda, H., Nishino, H. & Iwashima A. 1995. Anti-Tumour-Promoting Glycerolglycolipids from the Green Alga, Chlorella vulgaris. Phytochemistry 40(5): 1433-1437

Noda, K., Ohno, N., Tanaka, K., Okuda, M., Yadomae, T., Nomoto, K. & Shoyama, Y.A. 1996. Water soluble antitumor glycoprotein from Chlorella vulgaris. Planta Medica 62: 423-426.

Park, J-Y., Cho, H-Y., Kim, J-K., Noh, K-H., Yang, J-R., Ahn, J-M., Lee, M-O. & Song,Y-S. 2005. Chlorella dichloromethane extract ameliorates NO production and iNOS expression through the down-regulation of NFκB activity mediated by suppressed oxidative stress in RAW 264-7 macrophage. Clinica Chimica Acta 351(1-2): 185-196.

Pitot, H.C., Hikita, H., Dragan, L., Sargent, L. & Haas, M. 2000. Review article: the stages of gastrointestinal carcinogenesis – application of rodent models to human disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics 14(1): 153-160.

Rodriguez-Garcia, I. & Guil-Guerrero, J.L.2008. Evaluation of the antioxidant activity of three alga species for use as

dietary supplements and in the preservation of foods. Food Chemistry 108: 1023-1026.

Romeo, R. & Colombo, M. 2002. The natural history of hepatocellular carcinoma. Toxicology 182: 39-42.

Schafer, D.F & Sorrell, M.F. 1999. Hepatocellular carcinoma. Lancet 353: 1253-1257.

Schulte-Hermann, R., Bursch, W. & Grasl-Kraupp, B. 1995. Active Cell Death (Apoptosis) in Liver Biology and Disease. Progress in Liver Diseases XIII: 1-35.

Shahidi, F. 1997. Natural Antioxidants: An Overview. Dlm: Shahidi, F. Natural Antioxidants: Chemistry, Health Effects and Applications, hlm. 1-11. Champaign Illinois: AOCS Press.

Surh, Y-J. 1999. Molecular mechanisms of chemopreventive effects of selected dietary and medicinal phenolic substances. Mutation Research 428: 305-327.

Surh, Y-J. 2002. Anti-tumor promoting potential of selected spice ingredients with antioxidative and anti-inflamatory activities: A short review. Food and Chemical Toxicology 40: 1091-1097.

Tanaka, K., Tomita, Y., Tsuruta, M., Konishi, F., Okuda, M., Himeno, K. & Nomoto, K. 1990. Oral administration of Chlorella vulgaris augments concomitant antitumor immunity. Immunopharmacology Immunotoxicology 12 (2): 277-291.

Tanaka, K., Yamada, A., Noda, K., Hasegawa, T., Okuda, M. & Shoyama, Y. 1998. A novel glycoprotein obtained from Chlorella vulgaris strain CK22 shows antimetastatic immunopotentiation. Cancer Immunology Immunotherapy 45: 313-320.

Tessitore, L. 2000. Apoptosis and cell proliferation are involved in the initiation of liver carcinogenesis by a subnecrogenic dose of diethylnitrosamine in refed rats. Journal of Nutrition 130: 104-110.

Winter, J.D. 1986. The nature of cancer. Dlm. The truth about cancer: A personal guide to causes and treatment. Blandford Press. Sidney: Bliddles Ltd, Guildford. 15-20.

Yamagishi, S., Nakamura, K. & Inoue, H. 2005. Therapeutic potentials of unicellular green alga Chlorella in advanced glycation end product (AGE)-related disorders. Medical Hypotheses 65: 953-955.

Zakeri, Z. & Lockshin, R.A. 2002. Cell death during development. Journal of Immunological Methods 265: 3-20.

Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Brustugun, O.T. & Doskeland, S.O. 1998. Injected cytochrome induces apoptosis. Nature 391: 449-450.

Nor Ashikeen Mukti, Suhaniza Sulaiman, Suhana Md Saad, Junaida @ Maimunah Hassan Basari, Mariati Abdul Rahman, Wan Zurinah Wan Ngah, Yasmin Anum Mohd Yusof*Jabatan Biokimia Fakulti PerubatanPusat Perubatan Universiti Kebangsaan MalaysiaJalan Raja Muda Abdul Aziz50300 Kuala Lumpur, Malaysia

*Pengarang untuk surat-menyurat; email: anum@medic.ukm.my

Diserahkan: 7 Oktober 2008Diterima : 22 April 2009